胰蛋白酶分子中二硫键Cys129－Cys232的定位改造研究

对胰蛋白酶所特有的二硫键［１２９,２３２］进行了定位改造,将Ｃｙｓ突变为Ｓｅｒ,以观察其对胰蛋白酶稳定性及活性的影响。采用蛋白质工程的方法,构建了三个突变体Ｃ１２９Ｓ、Ｃ２３２Ｓ和Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ．在Ｅ．ｃｏｌｉＸ－９０菌体中进行表达,表达产物用含胰蛋白酶特异性底物ＴＡＭＥ的活性胶检测活性,发现Ｃ２３２Ｓ丧失胰蛋白酶活性,而Ｃ１２９Ｓ和Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ保留了胰蛋白酶活性。在盐酸胍作用下比较双突变体和野生型胰蛋白酶活性,发现突变体Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ的稳定性有所降低。结果表明二硫键Ｃｙｓ１２９－Ｃｙｓ２３２对于胰蛋白酶的活性是非必需的,可能在稳定蛋白质的结构上发挥着重要作用。     

用定位突变探讨胰蛋白酶的稳定性

应用定位突变的方法,对鼠胰蛋白酶分子中易自溶位点的氨基酸残基进行改造,以探索提高胰蛋白酶稳定性的可能。将鼠胰蛋白酶原cDNA从质粒pTRAP上切下,插入载体M13mp8,在E.coli JM 101菌株中转化、复制后用以转染RZ1032缺陷型菌株,利用含U模板,进行按实验目的设计寡聚核苷酸引物引导的定位突变,将易自溶位点Ary105改造为Leu或Gly。经酶切和序列测定,证明在设计位点发生了预期的碱基突变。为了检查活性方便,又将含突变型胰蛋白酶cDNA从pTRAP上切下,插入另一个表达载体pTN中,转化入E.coli SM 138宿主中进行表达,表达产物分泌到围膜间隙,作专一性底物TAME活性胶方法检测,证明改造后的表达产物具有胰蛋白酶活性。对突变与野生型胰蛋白酶进行了初步比较。     

慈菇蛋白酶抑制剂中二硫键Cys1~（12）－Cys~（115）功能的研究

慈菇蛋白酶抑制剂中二硫键Ｃｙｓ１~（１２）－Ｃｙｓ~（１１５）功能的研究谢志伟,罗明娟,戚正武（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,２０００３１）关键词慈菇蛋白酶抑制剂Ｂ;二硫键;定点突变;基因表达慈菇蛋白酶抑制剂（ＡＰＩ）与大豆Ｋｕ...     

凝乳酶原（凝乳酶）二硫键Ｃys206—Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Ｃys206-Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为－１６．１kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的ＤＮＡ,采用快退火可解决此矛盾。５个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除Ｃ２０６Ａ外,约占细胞总蛋白的５０％左右,突变的复性结果表明,Ｃys206-Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在５个突变体中,Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ的复性率分别为Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ、Ｃ２１０Ａ、Ｃ２１０Ｓ的４．５倍、２０倍和３０倍,而C206A不能复性。Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ与Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ的远紫外ＣＤ光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加由于上述３个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

凝乳酶原(凝乳酶)二硫键Cys206-Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Cys206\|Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为-16.1kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的DNA,采用快退火可解决此矛盾。5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除C206A外,约占细胞总蛋白的50%左右。突变体的复性结果表明,Cys206\|Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在5个突变体中,C206A/C210A的复性率分别为C206S/C210S\,C210A\,C210S的4.5倍、20倍和30倍,而C206A完全不能复性。C206A/C210A与C206S/C210S的远紫外CD光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加。由于上述3个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

蛋白质中二硫键附近肽段识别规律研究

本文对蛋白质中二硫键附近的残基进行了计算机统计分析,结果发现平行和反平行残基间存在着特异的配对规律。这种残基间的相互作用或识别,可能与蛋白质折叠过程中正确地形成二硫键有关。该结果有助于蛋白质工程设计。     

风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对其细胞融合活性的影响

为了探讨风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对风疹病毒细胞融合活性的影响,在构建重组载体pBSK-SPE2E1的基础上,利用PCR定点突变与体内同源重组相结合的方法,构建了11个突变体,分别将E1外功能区的11个半胱氨酸残基突变为其它氨基酸残基,从而去除一个二硫键,利用Giemsa染色法定性检测由此引起的细胞融合情况,流式细胞术检测导入的外源DNA在细胞表面的表达效率,血吸附检测重组表达的突变体蛋白的受体识别活性。结果表明E1外功能区的10个二硫键对RV的细胞融合活性都有重要影响,任何一个二硫键的去除均导致E1的细胞融合活性丧失;其中第5和第8个半胱氨酸残基所形成的二硫键与E2和E1的相互作用有关,第3、第4和第13个半胱氨酸残基所形成的二硫键可能直接影响E1的细胞融合功能。     

猪胰蛋白酶自溶活性产物—绿豆胰蛋白酶抑制剂复合物的初步晶体学研究

本文报道了猪胰蛋白酶自溶活性产物——绿豆胰蛋白酶抑制剂复合物的晶体生长及晶体学参数的测定。晶体衍射分辨率为2.8A,四方晶系,空间群I422,晶胞参数为a=b=121.6A,c=113.6A,V=1.680×10~6A~3,每个结晶学不对称单位中含一个复合物分子。     

基于定点突变技术对苦荞麦胰蛋白酶抑制剂活性位点的研究

目的:为了研究胰蛋白酶抑制剂的活性位点,揭示Ft TI结构与功能的关系。将Ft TI和突变体aFtTI-R65L,aFtTI-D67V和aFtTI-R65L/D67V经IPTG诱导培养5h,收集菌液经过超声波破碎得到粗产物,经过纯化后的胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的摩尔抑制比分别为1∶1,1∶1.15,1∶1.3,1∶1.2;抑制常数Ki分别为1.62n M,1.69 n M,1.9 n M,1.8 n M(BAp NA作为底物)。结果:SDSPAGE分析表明突变前和突变后表达产物胰蛋白酶抑制剂的大小一致,均为9.5 k Da。对突变体aFtTI-R65L,aFtTI-D67V和aFtTI-R65L/D67V抑制反应温度研究表明,其最适反应温度均为40℃。在10~80℃保温30 min后,突变体对胰蛋白酶的抑制活性仍保留80%以上;在90℃保温30min,突变体的抑制活性开始显著下降,只保留其39%。具有较高的耐热性。将aFtTI在pH 3.0~10.0的不同缓冲溶液中放置30 min后,其抑制活性可保留90%左右,在pH 2.0条件下,aFtTI抑制活性丧失约31%;在pH 11.0条件下,aFtTI抑制活性丧失约43%。结论:对苦荞麦蛋白酶抑制剂Ft TI的定点突变并不会改变它是一种偏碱性的胰蛋白酶抑制剂的性质,突变前后均保持了耐碱性的特点。     

BstNI同功酶限制—修饰系统基因的表达检测和定位分析

鉴定了Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１和ＪＭ１１０的部分遗传标记,作为受体菌分别用于ＢｓｔＮＩ同功酶限制－修饰系统中限制性内切酶（Ｒ）基因和甲基化酶（Ｍ）基因表达的检测。用外切酶Ⅲ单向删切含Ｒ－Ｍ基因的ＤＮＡ片段,获得２３个缺失突变亚克隆。通过检测各亚克隆表达的Ｒ酶和Ｍ酶活性,将Ｒ和Ｍ基因分别定位在距克隆位点ＰｓｔＩ和０．２→１．４ｋｂ和１．５→３．３ｋｂ范围内。分析表明：该系统属于Ⅱ类限制－修饰系统,两     

生理pH条件下精氨酸脱亚胺酶的分子改造研究

精氨酸脱亚胺酶（arginine deiminase,EC 3.5.3.6,ADI）因其可作为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞的靶向治疗药物而受到广泛关注. 目前,支原体来源的重组ADI处于肝癌和黑素瘤的三期临床研究阶段. 作为药用酶,当前报道的ADI在体内生理条件下普遍存在酶活低、半衰期短、底物亲和性弱等局限性.本研究结合随机突变及基于理性设计的定点突变两种方法,对研究室前期自主筛选得到的变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida来源的ADI经一轮定向进化后所获优势突变株M314(A128T/H404R/I410L)进行分子改造.通过对随机突变法获得的1480个突变株进行96孔板高通量筛选,得到优良突变株M173(A128T/H404R/I410L/K272R);同时,基于同源序列比对及ADI蛋白三维结构同源建模,采用PyMOL软件理性预测和分析其活性中心及附近保守区域氨基酸位点对蛋白功能的影响,选择了6个位点D78E、L223I、P230I、S245D、A275N、R400M分别在M314的基础上进行定点突变,最终获得优势突变株M04(A128T/H404R/I410L/S245D). 通过对突变株的酶学性质以及动力学参数分析发现：生理pH值下,突变株M173的酶比活（12.32 U/mg）在M314（9.02 U/mg）的基础上提升3659%,Kcat/Km提高5236%;而突变株M04的最适pH由6.5升高至7.0,更接近体内生理pH,其比酶活（14.66 U/mg）较M314提升62.53 %,Kcat/Km提高了37.12%. 综上结果,本研究结合两种分子改造方法成功地对该ADI在生理pH条件下的酶活和酶学性质进行了改良,并为蛋白质的分子改造策略提供了理论基础和实验依据.     

大肠杆菌β—D—半乳糖苷酶的定位突变及突变酶的动力学性质

利用人工合成的寡核苷酸探针,将编码大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)的Lac Z基因中537位Glu密码子GAA分别用GAC(Asp)、CAA(Gln)、GTC(Val)来替代,替代后的突变酶的催化活性显著降低.同天然β-D-半乳糖苷酶相比,作用于ONPG底物时,突变酶的k_(cat)值分别为0.13%(Asp-537)、0.0006%(Gln-537)、0.0035%(Val-537),但它们的K_m值并无明显改变.无论是天然酶还是突变酶,底物类似物IPTG是一个强有力的抑制剂,而过渡态类似物2-脱氧-2-氨基-半乳糖和L-核糖只对突变酶有微弱的抑制作用.活化剂叠氮钠的激活作用小于β-D-半乳糖苷酶的Glu-461突变酶.催化甲醇成酯反应的能力小于天然酶.突变酶对热更不稳定.以上结果表明Glu-537残基是该酶催化反应的必需基团.     

谷氨酸脱羧酶的分子改造及酶学性质研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)来源的谷氨酸脱羧酶(GadB)为研究对象,通过组合突变,获得了pH适用范围拓宽、催化活力提高和稳定性增强的组合突变体M2。与野生型GadB-WT相比,组合突变体M2的pH适用范围有效拓宽,在pH6.0时催化活力比GadB-WT提高113.43%。之后对含有M2突变体基因重组菌的发酵培养基和诱导条件进行优化,优化后单位培养基酶活力比未优化时提高了104.13%。在此基础上对M2的酶学性质进行测定,测得其最适pH为5.0,最适温度为37℃。通过稳定性测定M2的pH稳定性和热稳定性与野生型GadB-WT相比都有一定程度的增强。M2的动力学参数K_m值为7.316μmol/L,k_cat为13.387 s^-1,k_cat/K_m为1.830 L/(s·μmol)。研究获得的组合突变体M2进一步丰富了催化合成γ-氨基丁酸的GadB突变体酶库,具有良好应用前景。     

定点突变法对人白细胞介素—2C末端a螺旋的结构和功能研究

用寡核苷酸诱导的基因定位突变法,将人白细胞介素－２Ｃ末端两亲性ａ螺旋中１２５位和１２７位基分别或同时突变为Ｐｒｏ,并测定其生物活性和空间结构。结果发现所得突变体的生物学活性均急下降,同时ａ螺旋含量以及Ｃ端螺旋中残基的空间位置也发生了不同程度的变化。结果提示,Ｃ端ａ螺旋尤其是其疏水面的完整性对维持白介素－２的生物活性有重要作用。     

抗病毒固有免疫分子TRIM22 C端SPRY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响

本文旨在探讨TRIM22 C端SRPY结构域对其转录、翻译及亚细胞定位的影响。以野生型TRIM22真核表达质粒为模板,扩增出C端SPRY结构域缺失的TRIM22基因片段,并将其克隆入真核表达质粒pcDNA3.1。将野生型和突变型TRIM22真核表达载体分别转染高分化人肝癌细胞株HepG2。通过反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达水平,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测其蛋白表达水平,并通过间接免疫荧光法检测其亚细胞内定位。结果成功构建了C端SPRY结构域缺失的TRIM22真核表达质粒。转染HepG2细胞后,TRIM22 SPRY结构域缺失突变体在转录和翻译水平上均与野生型TRIM22无明显差异,但TRIM22 SPRY结构域缺失突变体完全丧失了核定位能力,这为进一步研究SPRY结构域在TRIM22抗病毒过程中所发挥的作用及机制提供了有益的启示。