原核细胞表达的肾综合征出血热病毒核蛋白免疫原性及免疫保护作用的研究

对原核细胞表达的肾综合征出血热病毒核蛋白的免疫原性及免疫保护作用进行了研究,结果发现表达的核蛋白具有很强的免疫原性,免疫小白鼠血清中抗肾综合征出血热病毒荧光抗体滴度达１：１２８００;用免疫小鼠脾细胞和血情做被动免疫保护实验,结果显示脾细胞对部分乳鼠肾综合征出血热病毒的致死感染有保护作用,保护率可达３８％,而血清不具有免疫保护作用;同时也未观察到核蛋白免疫血清具有促感染乳鼠早死作用。表明核蛋白能诱导细胞免疫保护但不诱导抗体介导的免疫保护,同时也不引起抗体介导的早死,这就为肾综合征出血热病毒核蛋白作为该病毒基因工程疫苗的成分提供了一定的理论基础。     

肾综合征出血热乳鼠脑纯化疫苗(I型)糖蛋白及核蛋白在免疫保护中的作用

为了阐明肾综合征出血热纯化疫苗（Ｉ型）中糖蛋白（ＧＰ）、核蛋白（ＮＰ）在免疫保护中的作用,采用脾细胞转输法,分别将ＧＰ、ＮＰ、ＧＰ＋ ＮＰ免疫小鼠后的脾细胞与未经免疫的小鼠正常脾细胞（３．５×１０５ 个）经腹腔转输给乳鼠,２ ｈ 后以１００ ＬＤ５０的汉滩（ＨＴＮ）病毒（ＬＲ１ 株）进行脑腔攻击。结果表明,其乳鼠的保护率分别达７７．０％ ,３８．５％ 和９２．３％ ,而未经免疫的小鼠正常脾细胞则不能提供保护（０％ ）,揭示了ＧＰ＋ ＮＰ在抗ＨＴＮ 病毒感染中具有免疫协同作用。     

转输免疫脾细胞对同系成年小鼠肾综合征出血热病毒致死性感染的保护作用

转输免疫脾细胞对同系成年小鼠肾综合征出血热病毒致死性感染的保护作用卢文红,姚楚铮,刁保卫,张满新,唐家权,罗成旺,黄莉莉（中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所,北京１０２２０６）关键词肾综合征出血热,免疫脾细胞转输,细胞免疫免疫系统在病毒感染的恢...     

牛乳源金黄色葡萄球菌EsxA蛋白的表达及免疫原性分析

为分析牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EsxA蛋白的免疫原性,构建EsxA-p ET-28a重组表达质粒,重组质粒经诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。用纯化后重组EsxA蛋白免疫小鼠,用间接ELISA检测免疫小鼠血清中的IgG、IgG1和IgG2a水平;免疫小鼠经S.aureus菌株攻击后,检测小鼠肝、脾、肾组织荷菌数和免疫保护率,观察S.aureus菌株攻击后小鼠肝、脾、肾病理组织学变化。结果表明,成功诱导表达了EsxA重组蛋白,该重组蛋白免疫小鼠后血清抗体效价可达1∶900,与对照相比,重组蛋白免疫后可减少小鼠肝、脾、肾组织的荷菌数,减轻这些脏器的病理损伤,对免疫小鼠保护率达75%。上述结果表明,该重组Esx A蛋白具有良好的免疫原性。     

肾综合征出血热Vero细胞疫苗毒种的选育及生物学特性研究

在肾综合征出血热(HFRS)疫苗Vero细胞毒种研制中,将肾综合征出血热(HFRS)病毒PS-6(Ⅰ型)、L99(Ⅱ型)在Vero细胞上连续传代,并对其病毒滴度、免疫原性、传代稳定性等进行检测。结果显示,两株病毒在Vero细胞上传代适应后,病毒滴度达8.5 lgCCID50/m l,免疫原性检查,将病毒灭活制成疫苗免疫家兔的血清中和抗体效价>1:10,其他检测符合规程要求。因此,适应的PS-6(Ⅰ型)和L99(Ⅱ型)毒种可用于制备Vero细胞出血热疫苗。     

免疫巨噬细胞在抗肾综合征出血热病毒感染中作用的初步研究

本文报道免疫小鼠腹腔巨噬细胞（ＰＭφ）在体内外抗肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒杂中的作用，用ＭＴＴ法测定细胞活力表明：ＨＦＲＳ病毒在体外对非免疫ＰＭφ具有明显的抑制作用，而免疫ＰＭφ受病毒的抑制不明显，应用直接免疫荧光技术证实，ＨＦＲＳ病毒能在非免疫ＰＭφ胞浆内增殖，并能释放细胞外；而免疫ＰＭφ能杀灭入侵的病毒，细胞转输实验表明，腹腔转输免疫ＰＭφ对乳鼠的致死性感染具有完全或部分保护作用，对用环磷     

中东呼吸综合征冠状病毒S1蛋白在昆虫细胞中的重组表达及免疫效果评价

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统重组表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S1蛋白,并对其免疫效果进行评价。方法:构建含有MERS-Co V S1基因的重组杆状病毒质粒,转染Sf9细胞包装杆状病毒;重组病毒传代3次获得种子病毒,感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得S1重组蛋白;用纯化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;采用假病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。结果:获得了表达MERS-Co V S1蛋白的重组病毒株,在昆虫细胞中表达并纯化了S1重组蛋白;利用重组表达的S1蛋白免疫小鼠3次,血清S1特异性Ig G抗体滴度可达1∶102 400,免疫小鼠血清稀释至1/5120后中和百分比仍达50%以上。结论:利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能有效诱导产生高滴度中和抗体,为发展MERS-Co V重组蛋白疫苗奠定了基础。     

RT—nested PCR检测肾综合征出血热患者血清病毒核酸

采用异硫氰酸胍－酚－氯仿（ＡＧＰＣ）一步法提取病毒ＲＮＡ,并依据肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）核蛋白（ＮＰ）编码基因保守区核苷酸序列合成两对巢式引物,建立了逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测ＨＦＲＳＶＲＮＡ方法,应用此法对ＨＦＲＳＶ感染的ＶｅｒｏＥ６细胞培养液及ＨＦＲＳ患者血清中的病毒ＲＮＡ进行检测。结果显示,感染细胞培养液及３５例ＨＦＲＳ患者血清均为阳性,正常的ＶｅｒｏＥ６     

HFRS病毒特异性抗体与淋巴细胞亚群检测的意义

研究了肾综合征出血热病毒的特异抗体与淋巴细胞亚群检测对临床诊断的意义。用ELISA法对 30例临床诊断肾综合征出血热患者进行特异性IgM抗体检测 ,进而用流式细胞仪对IgM抗体阳性患者进行淋巴细胞亚群测定。正常对照 30例 ,均为健康人。肾综合征出血热患者特异性IgM抗体阳性 2 2例 ,检出率为 73 .33 % ,正常对照标本均未检出病毒特异性IgM抗体。肾综合征出血热患者CD4 +细胞百分比较正常对照组降低 ,CD8+细胞百分比较正常对照组增高 ,CD4 +/CD8+比值下降或倒置。肾综合征出血热病毒的特异性IgM抗体特异性强 ,可作为该病早期临床诊断的重要依据。肾综合征出血热患者的免疫功能明显下降 ,对于判定疗效和疾病预后等具有参考价值。     

反转录病毒MSCV介导汉坦病毒核蛋白基因在NIH3T3细胞中整合和表达

汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒型肺炎综合征(HPS)的主要病原体.由S基因编码的核蛋白(NP)主要与机体的细胞免疫有关,并调节病毒的复制及诱导细胞程序性死亡.构建了汉坦病毒Z10株核蛋白cDNA与含有pac基因的反转录病毒鼠干细胞病毒(MSCV)重组体MSCV-FlagNP,通过磷酸钙转录法导入产病毒的包装细胞系BOSC23中,产生完整的重组MSCV-FlagNP病毒.然后以重组病毒感染NIH 3T3细胞,利用Puromycin的选择特性(pac基因)对感染细胞进行连续压力筛选,获得了转核蛋白抗性细胞.利用Southern blot和PCR方法分别对核蛋白基因在抗性细胞染色体整合情况及其完整性进行了鉴定.并且用Western blot在抗性细胞中可检测到核蛋白的表达.进一步以Flag单克隆抗体介导的免疫荧光染色联合共聚焦激光扫描荧光显微镜,分析了内源性Flag融合核蛋白在抗性细胞内分布,发现核蛋白主要分布于胞浆及胞核周围区,并且部分核蛋白可聚集形成胞浆包涵体.转核蛋白基因细胞模型的建立,对进一步研究汉坦病毒核蛋白功能以及病毒复制机制有重要意义.     

流行性出血热病毒沙鼠肾细胞培养灭活疫苗免疫家兔的抗体反应及保护试验

利用自流行性出血热(EHF)病人血液中分离的EHF病毒浙10株,感染长爪沙鼠肾单层细胞,经培养后,按流行性乙型脑炎的生物制品法规要求研制成灭活疫苗。取1ml经肌肉免疫家兔,6天后即可在血液中检出荧光抗体,至第14～21天为最高峰,荧光抗体效价可达320～2560。经活EHF病毒攻击,有明显的保护作用,保护率达90％以上。疫苗经1:10或1:30稀释后免疫家兔,荧光抗体阳转率仍达100％,但抗体滴度明显降低。肌肉接种优于皮下接种。本研究证明,甲醛灭活EHF病毒可破坏血凝素活性,从而影响疫苗血凝抑制抗体的产生,可能也会影响中和病毒的能力。     

汉坦病毒S基因片段及其产物的研究

汉坦病毒是肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）的病原体,近年来对其Ｓ基因片段生物学特性的研究取得了很大进展。本文不Ｓ基因片段的结构、编码核蛋白（ＮＰ）的免疫原性、抗原决定簇及ＮＰ的重组表达与应用一阐述。     

肾综合征出血热病毒对不同生理状态小鼠的实验感染及在小鼠淋巴细胞亚群中的定位

本文用双标记免疫细胞化学和双标记免疫电镜技术观察了环磷酰胺处理的BALB/c小鼠及乳鼠实验感染肾综合征出血热病毒后的发病和病毒定位情况,结果发现,免疫功能不成熟或有缺陷的小鼠感染后发病并有规律地死亡,而免疫功能正常鼠只呈隐性感染。在发病的和隐性感染的小鼠之间,病毒定位主要差别在于HFRSV是否感染免疫器官,即HFRSV抗原可见于发病鼠外周血,牌和胸腺的单个核细胞中,而在隐性感染小鼠的这些免疫器官中则为阴性,HFRS病毒颗粒及病毒抗原广泛见于发病鼠的T细胞亚群中,在Thy-1,L3T4和Lyt-2亚群中,双标记阳性细胞百分比分别为24.6+—15.3％,7.5％+—6.1％和17.7+—6.1％。对HFRSV在T细胞中分布的差异还作了动态比较。结果提示:细胞免疫可受HFRSV的直接影响,病毒对宿主免疫系统的感染是HFRSV感染发病的一个关键因素。     

N-糖基化对乙型脑炎病毒prME和NS1基因免疫效果影响的研究

prME和NS1为乙型脑炎病毒两个主要的免疫保护蛋白,且均为N-糖蛋白。为研究N-糖基化对乙型脑炎病毒免疫保护的作用,本研究用PCR介导的定点突变方法,分别消除乙型脑炎病毒prME和NS1基因的不同N-糖基化位点,并构建了prME和NS1突变基因的真核表达质粒。将质粒免疫四周龄雌性小白鼠,经两次免疫后,采集血清检测体液免疫反应,最后对小鼠用强毒进行攻击,观察并记录免疫保护力。研究结果显示,与野生型prME基因免疫组相比,消除单个糖基化位点后prME基因诱导的ELISA抗体、中和抗体和免疫保护力均略有升高,而同时消除两个糖基化位点的则会降低。NS1基因消除单个糖基化位点后保护率高达到100%,但消除两个糖基化位点后则免疫保护率略有降低(75%)。通过本研究证明,N-糖基化在维系乙型脑炎病毒prME和NS1蛋白的免疫保护中具有重要的作用,单个糖基化的缺失可增强蛋白的免疫原性,而两个糖基都缺失后,则造成了免疫效率的降低。     

表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答

为探讨表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)核蛋白(N)基因的重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠后诱导特异性免疫应答,本研究制备表达流行性腹泻病毒核蛋白的重组干酪乳杆菌,应用Western blotting、间接免疫荧光和全细胞ELISA鉴定目的蛋白的表达。然后用该重组干酪乳杆菌口服免疫BALB/c小鼠,分别测定了免疫后不同时间血清中特异性IgG、粪便中特异性的sIgA水平以及血清的中和活性;并测定免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和细胞因子水平。结果显示,目的蛋白表达在细胞表面,可被阳性血清所识别。免疫小鼠后,可分别在血清中和粪便中检测到较高水平特异性IgG、sIgA(P<0.01),但血清并没有中和活性;淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定结果显示,免疫组可产生明显的细胞免疫应答。结果表明,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生黏膜免疫应答和系统免疫应答,具有作为口服疫苗潜在的应用价值。     

高压力制备柯萨奇病毒疫苗

以HeLa细胞和BALB／c小鼠为模型,研究了高压力对柯萨B组病毒（CVB）感染活性和免疫原性的影响,发现在230MPa压力下,结合其他相应的物理条件,CVB的感染活性可完全消失。该CVB仍具有抗原性,可诱导小鼠产生CVB特异性抗性,效价可达1：1500。用高压力处理的CVB免疫小鼠,再用正常CVB攻击,其生存率为67％,具有疫苗的特性。这些结果表明,高压力处理的CVB具有免疫保护作用,可作为一种具有潜在应用前景的病毒疫苗。     

表达尼帕病毒G囊膜糖蛋白重组牛痘病毒的研究

采用牛痘病毒WR株,构建了表达哺乳动物密码子优化的NiV G蛋白基因的重组病毒rWR-NiV-G。Westernblot证实大小为66kDa的重组G蛋白在rWR-NiV-G感染的Hela细胞中获得表达;采用兔抗NiV高免血清间接免疫荧光检测重组痘病毒表达G蛋白显示出良好的特异免疫反应原性。rWR-NiV-G感染NiV敏感的BHK细胞系,并与NiV融合蛋白F共同表达,可形成强烈细胞融合现象。rWR-NiV-G感染免疫BALB/c小鼠,可诱导显著的NiV G蛋白特异体液免疫反应。以原核表达NiV G蛋白片段为包被抗原,间接ELISA检测rWR-NiV-G感染免疫小鼠血清中的G蛋白特异抗体,具有良好的敏感性和特异性。同时,rWR-NiV-G感染免疫小鼠血清中的G蛋白特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性。结果表明,重组牛痘病毒表达的NiV G蛋白有良好的免疫原性和生物学活性功能,为进一步深入研究NiV G蛋白生物学功能、免疫原性及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础。     

不同来源的肾综合征出血热病毒对Vero细胞的致病变作用

前文报道,肾综合征出血热病毒76-118株能使Vero细胞产生病变。本文报道76-118株和另11株不同来源的肾综合征出血热病毒(H537、A9、H5、R178、HB55、R22、Z10,沟3、L99、A16和J10)对Vero细胞的致病变作用(CPE )。其中除沟3株外,大部分毒株在感染Vero细胞后的第一代即可见明显的CPE。CPE的特点与76-118株相似,主要是感染细胞粘聚、融合,形成网状结构。CPE能被特异性抗HFRS病毒血清和型特异性单克隆抗体所中和抑制,但不能被特异性抗呼肠孤病毒Ⅲ型免疫血清所中和抑制。HFRS病毒对Vero细胞的致病变作用,对进一步研究HFRS病毒的某些生物学特性及实验方法等均有重要意义。     

应用单克隆抗体免疫细胞化学法分析尸检组织中肾综合征出血热病毒G2，NP及HA结构蛋白抗原

本文应用15株分别抗肾综合征出血热(HFRS)病毒糖蛋白(Glycoprotein Ⅱ G2),核蛋白(Nuclcocapsid,NP)及血凝素(Hemagglutinin,HA)抗原的单克隆抗体免疫细胞化学方法对19例HFRS尸检病例的16种组织中的病毒抗原进行了定位和分布的研究及抗原分析。结果表明,死于早期HFRS人体组织内病毒抗原量大,分布广泛,主要以可溶性和颗粒性两种形式存在,前者存在于细胞内和细胞外,呈G2,NP及HA抗原阳性,是参与形成免疫复合物的主要抗原形式;后者是以单纯病毒NP或HA抗原阳性的病毒包涵体(IB)形式存在于细胞内,是病毒直接作用所致细胞病变的标志,IB的广泛分布但只有极个别阳性细胞发生坏死,说明该病毒具有泛嗜性感染和弱致细胞病变能力的特性。抗原分析结果显示,组织细胞中病毒抗原的表达及其抗原量受宿主细胞的种属,组织结构特点及病期的影响,也存在个体差异以及因感染病毒株或血清型不同产生差异的可能性。病毒抗原染色形态学证实,NP上具有HA抗原位点,其抗原决定簇有三类,其中的某些抗原决定簇可因病毒宿主动物或细胞的种属不同,表达也不同。HA抗原在人体组织细胞中的高表达和广泛分布也说明HFRSV对人体有很强的侵袭力。     

仙台病毒抗血清与补体对靶细胞的免疫溶解作用

靶细胞免疫溶解作用在病毒感染时所产生的免疫病理和疾病恢复等方面具有一定意义。本文报告了仙台病毒感染的地鼠肾细胞在病毒特异抗体和豚鼠补体作用下产生细胞溶解的体外试验结果。细胞溶解率可达90％左右。抗体补体对靶细胞的免疫溶解作用和下列因素有关．