PCR－ELISA在检测血清中丙型肝炎病毒上的应用

建立了一个替代目前使用的套式ＰＣＲ的血清中丙型肝炎病毒ＲＮＡ检测的新方法。该方法只需经过一次ＰＣＲ扩增,即可通过对掺入标记物的ＰＣＲ产物的ＥＬＩＳＡ检测得到与套式ＰＣＲ相同的结果。与套式ＰＣＲ相比,该方法具有耗时少、易操作、较少产生假阳性等特点。     

套式PCR检测婴幼儿巨细胞病毒感染

本文采用套式ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术对６１例婴儿肝炎综合征（Ｎｅｏｎａｔａｌｈｅｐａｔｉｔｉｓ）患者进行了ＨＣＭＶ（Ｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）检测,结果表明,当只用一对引物进行ＰＣＲ时,检出３３例患者为ＨＣＭＶ阳性,阳性检出率为５４．１％;而采用套式ＰＣＲ后,有１７例为ＨＣＭＶ阳性,阳性检出率提高到７７．０％。可见套式ＰＣＲ方法的阳性检出率明显高于单一ＰＣＲ,并远高于目前使用的其它方法。同时也说明ＨＣＭＶ是导致肝炎综合征的主要病原体之一。此外,灵敏性和特异性试验表明,套式ＰＣＲ技术的敏感度高、特异性强、简单快速,在临床检测和诊断中具有很大的潜力。     

应用套式PCR选择性卡他热病毒在不同动物体内变异的研究

应用本实验建立的三组套式ＰＣＲ（ＰＣＲ１、２、３）和一组以前报道的套式ＰＣＲ（ＰＣＲ４）,对５９份外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）ＤＮＡ样品进行了恶性卡他病毒核酸序列的检测。这些样品来自５１只羊,以及与羊接触而发病的６头牛和２只鹿。除ＰＣＲ４外,其它三组ＰＣＲ都能扩增现有４个角马型ＭＣＦＶ分离株。有６只羊在４组ＰＣＲ中都呈阴性,其余５３份样品经ＰＣＲ４检测均呈阳性。ＰＣＲ１只有从４５只羊体检出ＭＣＦＶＤＮ     

HCV RNA的检测方法简介

本文讨论了检测丙型肝炎病毒核糖核酸（ＨＣＶＲＮＡ）的样本来源和处理,引物的设计,合成和选择等问题;重点介绍了蛋白酶Ｋ消化法,聚乙二醇沉淀法,异硫氰酸胍一步法,硅凝胶提取法和直接捕获法提取ＨＣＶ　ＲＮＡ的５种方法,以及一步ＰＣＲ法,常规ＲＴ－巢式ＰＣＲ,直接ＲＴ－巢式ＰＣＲ,化学修饰的ＲＴ－巢式ＰＣＲ,联合ＰＣＲ,双温ＰＣＲ和定量竞争性ＰＣＲ等７种ＰＣＲ方法检测ＨＣＶ　ＲＮＡ,用ＰＣＲ检测ＨＣＶ　ＲＮＡ方法的标准化以及检测ＨＣＶＲＮＡ具有非常重要的意义。本文还介绍了一种新型的定量方法－ｂＤＮＡ信号放大技术检测ＨｃＶＲＮＡ。     

应用循环逆转录PCR技术检测丙型肝炎病毒RNA

循环逆转录（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ,ＣＲＴ）是线性增长逆转录ｃＤＮＡ产量的一种新技术。为了将该技术用于检测ＨＣＶ ＲＮＡ,通过改变ＣＲＴ的循环次数,结合竞争ＰＣＲ,作出标准曲线。采用１６次ＣＲＴ加３４次循环ＰＣＲ检测了１３６例ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ阳性、５４例ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ阴性和１０８例临床可疑病人全血标本,并与逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）和巢式ＰＣＲ（     

免疫聚合酶链反应技术的建立及其对甲胎蛋白的检测

免疫ＰＣＲ是一种新的具高敏感性的抗原检测技术,它类似传统的ＥＬＩＳＡ法,若与抗体连接的酶用ＤＮＡ片段代替,则该ＤＮＡ片段可用于ＰＣＲ扩增。以链酶亲合素搭桥将生物素标记的抗体与ＤＮＡ相连建立了免疫ＰＣＲ技术,并将其用于检测甲胎蛋白（ＡＦＰ）,其敏感性比ＥＬＩＳＡ法高１０４。因此,免疫ＰＣＲ有可能作为一种具高敏感性的检测手段用于临床早期诊断     

HLA—DRB1基因位点多态性的PCR—RFLP分析

设计并建立了一套适合国内应用的改良ＰＣＲ－ＲＦＬＲ方法,分５组特异性扩增ＤＮＡ样品,随后进行酶切定型分析,准确检测了编码ＤＲ抗原特异性ＨＬＡ－ＤＲＢ１基因位点的多态性,该法采用分组扩增,不发生与其它ＤＲＢ位点等位基因的交叉扩增,不仅适合纯合子的区分而且可以清楚准确地检测杂合子样品。     

应用反转录——套式PCR方法检测肾综合征出血热病人血清中的汉坦病…

采用５’端生物素标记汉滩病毒特异性寡核苷酸探针,结合磁性分离技术和异硫氰酸胍－酚一步法（胍酚法）提了病毒ＲＮＡ,进行反转录－套式ＰＣＲ,检测肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病人血清样本,胍酚法能检测血清中至少几个ＰＦＵ病毒的ＲＮＡ〉比磁珠法敏感１０倍,整个检测过程在５小时完成。应用该方法对１３７份汉滩型和汉城型ＨＦＲＳ病人血清进行检测分型,总阳性率达６０．５０％。其中,病程在７日以内（急性期）的从血清仍     

随机引物PCR技术在个体认定及亲权鉴定中的应用

随机引物ＰＣＲ技术（ＡＰ－ＰＣＲ）检测人ＤＮＡ指纹图用于法医学个体认定及亲权鉴定是一个非常有效和经济的方法。应用该技术对１００例无关个体ＡＰ－ＰＣＲ的ＤＮＡ指纹进行分析和１０个肯定亲生关系的家庭进行亲权鉴定,结果该技术的个体识别力非常高,亲权鉴定时的非父排除率也很高,且操作简便、快速,是一个值得推广的方法。     

应用反转录-套式PCR方法检测肾综合征出血热病人血清中的汉坦病毒特异性RNA

采用５′端生物素标记汉滩病毒特异性寡核苷酸探针,结合磁性分离技术和异硫氰酸胍－酚一步法（胍酚法）提取病毒ＲＮＡ,进行反转录－套式ＰＣＲ,检测肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病人血清样本,胍酚法能检测血清中至少几个ＰＦＵ病毒的ＲＮＡ,比磁珠法敏感１０倍,整个检测过程在５小时完成。应用该方法对１３７份汉滩型和汉城型ＨＦＲＳ病人血清进行检测分型,总阳性率达６０．５０％。其中,病程在７日以内（急性期）的病人血清仍能检测到２２．７３％阳性率。扩增产物经打点杂交检测证实为特异性扩增,并能准确分型。与空斑减少中和试验（ＰＲＮＴ）分型的符合率为１００％。对２０份正常人及２４份非ＨＦＲＳ患者血清进行ＰＣＲ扩增,结果均为阴性。将全部试剂做成试剂盒,为基层单位早期诊断肾综合征出血热病人提供了操作简便、特异、敏感、快速、直接的诊断方法。     

轮状病毒基因重配株血清型鉴定方法的研究

Ａ组轮状病毒中根据基因９的不同目前至少已发现有１３个不同Ｇ血清型,其中能引起人类致病的有Ｇ１－Ｇ４,Ｇ８,Ｇ９和Ｇ１２型。建立可靠的血清型鉴定技术对于轮状病毒疫苗的研制和分子流行病学的研究具有重要意义。本文首次报导了一种鉴定轮状病毒Ｇ血清型的新方法,利用已知有关轮状病毒ＶＰ７基因的序列资料,设计合成了一套鉴定轮状病毒Ｇ血清型的寡核苷酸探针,利用地高辛标记上述探针。待检品经反转录ＰＣＲ扩增后与上述一套寡核苷酸探针分别进行杂交得以确定其血清型。这一方法与目前常用的套式ＰＣＲ方法相比更适合于大量样品的操作而且结果可靠。用这一方法对本实验室组建的四株基因重配疫苗株进行实验,其结果与套式ＰＣＲ方法完全一致。     

免疫聚合酶链反应技术的建立及其对甲脂蛋白的检测

免疫ＰＣＲ是一种新的具高敏感性的抗原检测技术,它类似传统的ＥＬＩＳＡ法,若与抗体连接的酶用ＤＮＡ片段代替,则该ＤＮＡ片段可用于ＰＣＲ扩增。因此,免疫ＰＣＲ有可能作为一种具高敏感性的检测手段用于临床早期诊断。     

应用套式PCR对恶性卡他热病毒在不同动物体内变异的研究

应用本实验建立的三组套式ＰＣＲ（ＰＣＲ１、２、３）和一组以前报道的套式ＰＣＲ（ＰＣＲ４）,对５９份外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）ＤＮＡ样品进行了恶性卡他热病毒（Ｍａｌｉｇｎａｎｔｃａｔａｒｒｈａｌｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ,ＭＣＦＶ）核酸序列的检测。这些样品来自５１只羊,以及与羊接触而发病的６头牛和２只鹿。除ＰＣＲ４外,其它三组ＰＣＲ都能扩增现有４个角马型ＭＣＦＶ分离株。有６只羊在４组ＰＣＲ中都呈阴性,其余５３份样品经ＰＣＲ４检测均呈阳性。ＰＣＲ１只能从４５只羊体检出ＭＣＦＶＤＮＡ,未能从牛和鹿体检出病毒ＤＮＡ。ＰＣＲ２检测的所有样品均呈阴性。在ＰＣＲ３扩增中,除２头牛外,其它５１份样品均呈阳性。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和限制性酶切分析,对ＰＣＲ１－４产物的特异性进行了鉴定。此外,敏感性实验表明,四组ＰＣＲ的差异也不明显。因此,本实验结果说明ＭＣＦＶ基因组在不同种动物之间发生了变异,羊体内的变异株可能是导致其它反刍动物发病的病原     

应用单克隆抗体测定人弓形虫IgM抗体的研究

为了检测人血清弓形虫ＩｇＭ抗体,采用抗人ＩｇＭ单克隆抗体和特异性抗弓形虫单克隆抗体建立捕获ＥＬＩＳＡ法,并与ＰＣＲ方法进行了比较。结果检测１０６５份献血员血清,检出阳性３例,用ＰＣＲ方法检测呈阳性结果;检测２３例类风湿病人血清及２份弓形虫ＩｇＧ抗体阳性血清均为阴性反应。说明该方法不受类风湿因子（ＲＦ）和特异性ＩｇＧ抗体的干扰,同时也表明捕获ＥＬＩＳＡ检测人血清中弓形虫ＩｇＭ抗体特异性,敏感性良好。     

一步多重PCR同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒研究

建立的一步ＰＣＲ方法即反转录和ＰＣＲ在同一管中进行,同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒病毒ＲＮＡ。实验中对不同的反转录温度以及一步多重ＰＣＲ的特异性和灵敏度进行了探讨。结果表明：４２℃、５０℃反转录时ｐｏｌｉｏ有非特异性条带出现,６０℃反转录特异性较好,而ＨＡＶ在三种不同的反转录温度下均得到牧场划性较好的条带;应用一步ＰＣＲ同时检测两种病毒与检测单一病毒的灵敏度基本一致,但在同等反应条件下后者的反应效率高于前者,特别是在检测ＨＡＶ时。     

HLA－DRB1基因位点多态性的PCR－RFLP分析

设计并建立一套适合国内应用的改良ＰＣＲ－ＲＦＬＲ方法,分５组特异性扩增ＤＮＡ样品,随后进行酶切定型分析,准确检测了编码ＤＲ抗原特异性的ＨＬＡ－ＤＲＢ１基因位点的多态性,该法采用分组扩增,不发生与其它ＤＲＢ位点等位基因的交叉扩增,不仅适合纯合子的区分而且可以清楚准确地检测杂合子样品,已报道过的ＤＲＢ１位点编码的特异性组合都可以通过这个方法得到准确分析。所使用的Ⅱ类限制性内切酶均价格便宜、易购。     

荧光素标记的庚型肝炎病毒基因探针的制备及应用

参考国内外已完成测序的庚型肝炎病毒（ＧＢＶＣ／ＨＧＶ）基因序列,选取毒株间系列较保守的基因片段,并合成与之互补的核苷酸序列（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）,用末端转移酶将荧光素Ｎ６ｄｄＡＴＰ标记该片段,制成庚肝病毒基因探针。在严格控制温度的条件下,与固定于硝酸纤维膜（ＮＣ膜）上血清斑点杂交,洗膜后与抗荧光素碱性磷酸酶（ＡＰ）结合,加底物后化学发光自显影判断结果。该方法检测与套式逆转录聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＲＴＰＣＲ）检测结果的阳性符合率为８８．２％,阴性符合率为１００％;并且与其他相关病毒基因无交叉反应,具有较好的特异性与灵敏性。其检测结果比ＥＩＡ法检测庚肝病毒抗体更具临床意义。     

猪水泡病病毒强致病性毒株主要保护性抗原蛋白基因cDNA的序列测定 …

从猪水泡病病毒细胞培养物的ＰＥＧ浓缩毒中提取病毒ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ和套式ＰＣＲ扩增病毒主要保护性抗原蛋白基因,将扩增产生１．６ｋｂ插入ｐＵＣ１８载体中,经亚克隆后用双脱氧链终止法测定其序列,与已发表的ＳＶＤＶ分离物该区序列作比较。     

甲状腺良、恶性病变中增殖细胞核抗原、P_(53)蛋白与AgNOR的检测及相关性研究

本文应用ＬＳＡＢ免疫组织化学方法及ＡｇＮＯＲ技术对７３例甲状腺良、恶性病变ＰＣ－ＮＡ、Ｐ５３蛋白及ＡｇＮＯＲ进行了检测并对其相关性进行了研究。结果显示①ＰＣＮＡ表达在良、恶性病变中有显著差异（Ｐ＜０．０１）;②ＡｇＮＯＲ颗粒均数及其形态在良、恶性病变中有较显著差异;③ＰＣＮＡ表达与ＡｇＮＯＲ计数呈显著正相关性（Ｐ＜０．０１）;④Ｐ５３蛋白在良、恶性病变中的表达均呈阴性,只是在淋巴结转移灶内呈阳性表达。根据研究我们认为检测甲状腺良、恶性病变中ＰＣＮＡ及ＡｇＮＯＲ颗粒对甲状腺良、恶性病变的鉴别、预后及对临床治疗均有意义     

一种新的免疫—PCR系统的建立和应用研究

把ＰＣＲ技术作为指示系统引入免疫检测中,建立了免疫－ＰＣＲ技术。在本研究中,以ＰＥＩ作交联剂,首次成功地将特异性抗体直接与ＤＮＡ交联,构建了三种Ａｂ－ＤＮＡ基因探针,组成新的免疫－ＰＣＲ检测系统。此三种特异性Ａｂ－ＮＤＡ探针可用于检测三种相应抗原。检测ＨＳＡ抗原的最低含量可达１０＾－１８ｍｇ／ｍｌ,灵敏度比ＥＬＩＳＡ高１０＾６倍。