蟾蜍血清梭曼水解酶的酶学性质研究

蟾蜍血清梭曼水解酶已被纯化。该酶有两个温度作用高峰,最适为ｐＨ１０,其次为ｐＨ７。最适温度为３０℃。以梭曼为底物,在ｐＨ７．７３条件下测定其米氏常数为５．８６４ｍｍｏｌ／Ｌ,最大反应速度为６９２μｍｏｌ／Ｌ。过高的底物浓度对酶活性有抑制作用。Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋对酶有激活作用,而Ｎｉ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｎａ＋、Ｋ＋对酶活性无明显影响。     

蟾蜍血清梭曼水解酶的酶学性质及其单克隆抗体的制备

蟾蜍血清梭曼水解酶(TSS)已被纯化.采用微量联苯胺法对该酶的酶学性质进行研究表明,该酶有两个最适pH,分别是pH7和pH10;最适作用温度为30℃;以梭曼为底物,在pH7.73,1/15 mol/L PB, 30℃条件下测定该酶的米氏常数为5.864 mmol/L,最大反应速度为692 μmol/L. Mg2+、Ca2+对TSS有激活作用,而Ni2+、Cu2+、Fe2+、Na+、K+对酶活性无明显影响.用TSS免疫Bal b/c小鼠,取其脾细胞在PEG4000作用下与P3x63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞进行融合,获得8株能分泌抗TSS单克隆抗体的杂交瘤细胞株:AC11,AE8,DA3,DE5,DG3,EB4,EC4,EH4.用酶联免疫吸附试验对其分泌的抗体滴度进行检测,其腹水滴度最高可达2×107,对其中4株杂交瘤分泌的抗体相对亲合力进行测定,它们的大小顺序为DA3＞EH4＞DG3＞EC4;对其中6株杂交瘤分泌的抗体进行免疫球蛋白类型鉴定表明,6株单抗均为IgG1类.上述8株杂交瘤在体外连续培养6个月,分泌抗体水平未见下降.     

大肠杆菌梭曼水解酶的纯化和性质

大肠杆菌梭曼水解酶的纯化和性质邵煌,刘昌玲,肖美珍,孙曼霁（北京军事医学科学院毒物药物研究所,北京１００８５０）梭曼属Ｇ类神经性有机磷毒剂．自然界发现多种细菌中均存在梭曼水解酶（Ｓｏｍａｎａｓｅ）活性［１－３］．研究细菌梭曼水解酶,寻求生物解毒的方法...     

蟾蜍血清梭曼水解酶（somanase）的纯化及性质的研究

从蟾蜍血清中发现并纯化出了一种与血清载脂蛋白有关的可催化神经性军用毒剂梭曼的水解酶,此酶全部与高密度脂蛋白以复合形成存在于血清中,我们经过多种纯化手段,从ＨＤＬ中分离纯化出了酯酶的最小分子量组分,得到了高活性、高纯度的酶蛋白,在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳及等电聚焦电泳中呈单一区带,分子量４２ｋＤ,等电点ｐＨ５．２并证明此酶不是ＨＤＬ中的任何一种已知载脂蛋白,也不是磷脂酶Ａ２和磷脂酶Ｃ以及存在于ＨＤ     

蟾蜍血清梭曼水解酶（somanase）的纯化及性质的研究

从蟾蜍血清中发现并纯化出了一种与血清载脂蛋白有关的可催化神经性军用毒剂梭曼（０－１,２,２－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｆｌｕｏｒｉｄａｔｅ,ｓｏｍａｎ）的水解酶,此酶全部与高密度脂蛋白（ＨＤＬ）以复合形式存在于血清中。我们经过多种纯化手段,从ＨＤＬ中分离纯化出了酯酶的最小分子量组分,得到了高活性、高纯度的酶蛋白,在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳及等电聚焦电泳中呈单一区带,分子量４２ｋＤ,等电点ｐＨ５．２,并证明此酶不是ＨＤＬ中的任何一种已知载脂蛋白,也不是磷脂酶Ａ_２和磷脂酶Ｃ以及存在于ＨＤＬ中的卵磷脂胆固醇酰基转移酶（ＬＣＡＴ）。它是与ＨＤＬ中的主要载脂蛋白ａｐｏＡ_１比较牢固地连接在一起并含量甚微的一种酶蛋白,水解梭曼的Ｋｍ值ｐＨ７．２、３７℃时为３．１３ｍｍｏｌ／Ｌ。可被对氯汞苯甲酸、ＨＣｌ－胍和ＥＤＴＡ－Ｎａ_２所抑制,二硫苏糖醇对酶活性有恢复作用。     

N-氨甲酰水解酶的纯化及性质

从Burkholderiacepecianjut1分离纯化N氨甲酰D氨基酸水解酶(NDase)。实验表明,该酶亚基35KD,最适温度为52℃,最适pH为7.2左右。以N氨甲酰D苯丙氨酸作底物,其米氏常数Km为10.22mmol/L,最大反应速度Vmax为0.27mmol/(L·min)。实验表明二价金属离子对酶活有重要影响。     

四季豆幼苗尿囊酸酰胺水解酶的纯化和性质研究(简报)

从四季豆幼苗提取、部分纯化尿囊酸酰胺水解酶,分离出两个同功酶：一分子量同功酶（尿圳酸酰胺水解酶Ⅰ）,另一为小分子量同功酶（尿囊酸酰胺水解酶Ⅱ）,并对后者的性质进行研究。     

黑曲霉纤维素酶系中β-葡聚糖纤维二糖水解酶的提纯和性质

通过硫酸铵分段,Sephadex G-100凝胶过滤及DEAE-SephadexA-25(A-50)离子交换柱层析等提纯步骤,从黑曲霉(Aspergillus niger)培养液中分离到β-葡聚糖纤维二糖水解酶的两个组分(Ⅰ-3a,Ⅰ-3b),经凝胶电泳鉴定均为单一带,Ⅰ-3a和Ⅰ-3b的最适pH分别为4.0及4.5,最适温度50℃及45℃,在pH2.0—8.0之间稳定,保温1h时的半失活温度t 1/2分别为52℃及48℃。SDS-凝胶电泳法测得Ⅰ-3a和Ⅰ-3b的分子量分别为57000及55000;聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦法测得二者的等电点分别为3.2和3.0。在所测定的化学试剂中,Ag~+、Hg~(2+)和Cu~(2+)对该酶均有较强的抑制作用。     

耐盐氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质

氨基甲酸乙酯是发酵食品中存在的一种致癌物质,酶法去除发酵食品中的氨基甲酸乙酯是消除氨基甲酸乙酯危害的一种重要方法。从小鼠的胃部获得了一株产氨基甲酸乙酯水解酶的肺炎克雷伯氏菌,为了解该氨基甲酸乙酯水解酶的酶学性质,从肺炎克雷伯氏菌中提取获得氨基甲酸乙酯水解酶粗酶液,经硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析分离得到氨基甲酸乙酯水解酶纯酶。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析,估计该酶的分子量约为55 kDa。其水解氨基甲酸乙酯的Km值为74 mmol/L。酶反应的最适温度为55℃,最适pH为7.0。乙二胺四乙酸(EDTA)和二硫苏糖醇(DTT)对该酶有较强的激活作用,而Cu2+和Zn2+则有较强的抑制作用。该酶可耐受高浓度NaCl,对低浓度乙醇也有一定的耐受性,对于酱油中氨基甲酸乙酯的消除有一定的参考意义。     

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的快速纯化及性质

通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析及阴离子交换层析等三步 ,有效地从一菌株NO .2 2 6 2中纯化了N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶。结果表明 ,酶活性回收约 2 0 %,纯化了 8 4倍。天然PAGE与SDS PAGE分析表明 ,该酶分子为同源四聚体 ,单体分子量约为 3 5kD。酶催化反应的最适pH为 7 7～ 8 0 ,最适温度为 45℃。以N 氨甲酰 DL 丙氨酸为底物时 ,Km =1 3×1 0 - 3 mol L ,Vmax=0 .3 3mol min。二价金属离子Ni2 + 有激活作用 ,Zn2 + 有明显的抑制作用 ,而Co2 + 对酶活无影响。该酶N 末端 8个氨基酸残基依次为TRQKILAF。     

重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶的纯化及其性质

[目的]研究工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-dexYG产右旋糖酐蔗糖酶的纯化和酶学性质.[方法]工程菌经过IPTG诱导后生产含His-tag融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶,通过硫酸铵沉淀、Ni-NTA亲和层析纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究.[结果]经过SDS-PAGE测得该酶的分子量约为170 kDa,与理论推测值基本相同.以蔗糖为底物,酶促反应的最适温度为25～30℃,最适pH值为5.4,动力学常数Km值为10.43 mmol/L;酶活在pH 5.0～8.0较为稳定,在室温(25 ℃)保藏4天仍有59%的酶活力,4℃保存7周酶活力仅下降一半,但在35℃以上失活很快;Ca2 对催化作用有较大的促进,Mg2 有微弱的促进作用,K 对催化反应无影响,Cu2 的抑制作用最强.其他试剂对重组酶的活性有不同程度的影响,其中SDS抑制作用很强.[结论]研究为重组右旋糖酐蔗糖酶纯酶的获取、得到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数.     

甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究

用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因,构建了重组表达质粒pET29a_mpd,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,得到C末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶,用NiNTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数。甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时,最适pH86～8.8,最佳反应温度15℃;Mn2+、Zn2+、Cu2+可使酶活性增加15%～20%,Ca2+、Mg2+微弱地促进酶的作用,Ni2+对酶活性几乎无影响;1mmol/L EDTA·Na2+几乎不影响酶的活性,而10mmol/L EDTA·Na2+对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时,最适pH86。25℃时,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km为（68.6 ± 5.1）μmol/L,kcat为（45 ± 6 ）S-1;对乙基对硫磷的米氏常数Km为（59.5 ± 6.0）μmol/L,kcat为（8 ± 1） S-1。Kcat/Km表明甲基对硫磷水解酶对甲基对硫磷的催化效率更高。     

重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶的纯化及性质研究

将产热稳定性过氧化氢酶的重组大肠杆菌培养后菌体破碎得到的粗酶液经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sephadex A\|50离子交换层析、HiPrep16/10 Phenyl疏水作用层析、Superdex200 HR 10/30凝胶层析提纯后得到电泳纯的酶,比酶活达到15629U/mg。此酶的最适温度为70℃,最适pH70,在60℃保温60min酶活力基本不变,在pH3～8的范围内比较稳定。此酶的Km和Vmax分别为775mmol/L和278mmol\5min\+\{-1\}·mg-1。1mmol/L的Zn2+、Ba2+、Mn2+可使该酶完全失活,KCN、NaN\-3、Na\-2S\-2O\-4、巯基乙醇对酶活力有抑制作用,50mmol/L的EDTA不影响酶活性。     

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的快速纯化及性质

通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析及阴离子交换层析等三步 ,有效地从一菌株NO .2 2 6 2中纯化了N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶。结果表明 ,酶活性回收约 2 0 %,纯化了 8 4倍。天然PAGE与SDS PAGE分析表明 ,该酶分子为同源四聚体 ,单体分子量约为 3 5kD。酶催化反应的最适pH为 7 7～ 8 0 ,最适温度为 45℃。以N 氨甲酰 DL 丙氨酸为底物时 ,Km =1 3×1 0 - 3 mol L ,Vmax=0 .3 3mol min。二价金属离子Ni2 + 有激活作用 ,Zn2 + 有明显的抑制作用 ,而Co2 + 对酶活无影响。该酶N 末端 8个氨基酸残基依次为TRQKILAF。     

白桂木凝集素的纯化与性质的研究

白桂木种子粉经抽提、３０～６０％饱和度硫酸铵沉淀和亲和层析,已获得纯化的白桂木凝集素（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓｈｙｐａｒｇｙｒｂｕｓｌｅｃｔｉｎ）。浓度梯度ＰＡＧＥ,显示基本是均一的蛋白质带,分析表明,它是由分子量为１５０００和１９０００两种亚基组成,Ｎ端为精氨酸和丙氨酸,ｐＩ９．１０、８．４５、８．１０,中性精含量约６．９％,氨基糖约０．４％,能凝集多种动物红细胞和人Ａ、Ｂ、Ｏ和ＡＢ血型红细胞,凝集活力受Ｇａ１ＮＡｃ、Ｇａｌ和棉子糖的抑制,对热较敏感,在ｐＨ４．５～９．５的范围内．ｐＨ的改变不影响它的血凝活力。     

内内葡聚糖苷水解酶的分离纯化和内源荧光性质

利用离子交换和分子筛层析技术从拟康氏木霉Ｓ－３８固态发酵液中提纯了两个内切葡聚糖苷酶组分。测定了一个组分的内源荧光性质。结果表明：该酶分子的内源荧光几乎都来自色氨酸。Ｎ－溴代琥珀酰亚胺（ＮＢＳ）修饰导致了酶活力的完全丧失,但是酶荧光残留了２５％,抑制剂纤维二糖与酶结合可使部分酶荧光得到保护,同时这种结合也可以保护一定的色氨酸荧光不被外来淬灭剂淬灭。     

烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征

采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤和SP Sephadex C-25阳离子交换柱层析等步骤,对烟草磷酸吡哆醛水解酶进行了分离纯化。结果表明:该酶被纯化了119.6倍,得率为28.49%,经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为49.6kDa,亚基分子量约为25kDa;该酶最适温度为50℃,最适反应pH为5.5;Mg2+、Ca2+、Mn2+等对该酶有激活作用,金属离子螯合剂EDTA对酶有抑制作用,加入Mg2+后抑制作用得到解除;在最适反应条件下,测得反应底物磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)的Km值分别为0.23mmol/L和0.56mmol/L。