有机盐对基因启动子的σ因子选择性的影响

用σ￣（７０）或σ￣（３８）和核心酶（Ｅ）组成的大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶全酶（Ｅσ）对四种启动子进行了体外转录。结果表明：ｌａｃＵＶ５,ｒｐｌＪ主要被Ｅσ￣（７０）识别,ｋａｔＥ主要被Ｅσ￣（３８）识别,ｆｉｃ在低盐浓度时被Ｅσ￣（７０）识别,在高浓度盐时被Ｅσ￣（３８）识别;Ｅσ￣（３８）转录特异性启动子所需酶量大于Ｅσ￣（７０）转录特异性启动子的酶量;在含有分别对σ￣（７０）或σ￣（３８）亲和性大的混和启动子的体外转录中,启动子之间不存在干扰和竞争,转录水平与启动子浓度成正相关。     

σ~(38)识别的启动子-35区核酸序列特征研究

依据部分资料假定大肠杆菌ＲＮＡ聚合酶的σ３８亚单位在特异启动子的－３５区识别的保守序列是－ＴＣＴＣＣＣ－,合成用其它碱基分别取代这一区域每一个碱基的引物,以ｏｓｍＹ基因片段为模板,通过ＰＣＲ扩增成－３５区含不同碱基序列的转录模板,用体外重组的由σ３８和核心酶（Ｅ）组成的全酶（Ｅσ３８）对这些启动子进行体外转录．结果显示含－ＴＣＴＣＣＣ－序列的启动子的转录水平既低于原始的ｏｓｍＹ启动子,又低于经ＰＣＲ扩增的其它序列．综合研究结果推测,这一区域的保守序列是－ＴＣＴＣＴＣ－．     

与结瘤基因nodF的启动子相互重叠的启动子起始一个 …

在根瘤菌中,结瘤基因的表达以转录水平上复杂的调控。通过体外转录、引物延伸等一系列实验在豌豆根瘤菌中发现一个与结瘤基因ｎｏｄＦ的启动子相互重叠,但转录方向相反的启动子,该启动子特异起始一个新的ＲＮＡ分子－ｐｘ２的转录。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹确定ｐｘ２的长度为０．７２ｋｂ,并且证明ｐｘ２的转录是依赖于根瘤菌的与Ｅ．ｃｏｌｉσ＾７０同源的ｓｉｇｍａ因子。ｐｘ２的转录启始位点在体内、体外均相同,它坐落在结瘤     

rmf基因启动子识别因子选择性研究

分别用σ^(70)或σ^(38)因子和核心酶(Core enzyme)重建RNA聚合酶全酶(Holoenzyme)对含有rmf基因启动子的DNA模板进行体外转录。不同的限制性内切酶酶切片段模板证实了rmf基因转录起始位点,尽管rmf基因在大肠杆菌进入稳定期大量表达,但是其启动子对稳定期起重要作用的σ^(38)因子的识别能力很低,而只能被σ^(70)所识别。rmf基因启动子体外转录的最适温度为37℃,最适NaCl浓度为50mmol/L。     

σ^32（sigma—32）及其对热应激蛋白的调控

σ＾３２是由Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｐｏＨ基因编码的一为３２ＫＤ的热应激蛋白转录调控因子。当热应激或其它应激反应发生时,它迅速激活热应激基因的启动子,大量转录其ｍＲＮＡ,合成热应激蛋白。本综述了σ＾３２在细胞内的表达及其对热应激基因转录的调控。     

细胞信号转导分子在TNF—α诱导c—jun基因表达中的作用

前期研究表明ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）通过磷酸化心肌细胞增强因子２（ｍｙｏｃｙｔｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆａｃｔｏｒ２,ＭＥＦ２）转录因子家族成员调节ｃ－Ｊｕｎ蛋白表达。ｃ－ｊｕｎ的启动子区存在ＭＥＦ２位点,ＭＥＦ２转录因子家族成员以同源或异源二聚体形式与其结合。研究了ｐ３８和ＢＭＫ１（ｂｉｇ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ１）在ＴＮＦ－α诱导ｃ－ｊｕｎ基因表达中的调控作用。ｐ３８上调ＭＥＦ２Ａ的转     

阴沟肠杆菌（nifL—A^c）工程菌株的构建

采用基因定位突变的方法,在体外把来自ｐＢＲ３２２的四环素抗性基因片段插入由ｐＳＴ１１４２质粒所携带的阴沟肠杆菌ｎｉｆＬ基因３－端的ＳｍａⅠ位点、再经细胞体内同源基因片段的重组交换,选择获得了在染色体上ｎｉｆＬ突变的阴不直菌Ｅ１２和Ｅ１３,两者Ｔｃ＾ｒ基因插入ｎｉｆＬ的转录方向相反。经分析显示,Ｅ１３（ｎｉｆＬ）由于Ｔｃ＾ｒ基因插入后,在ｎｉｆＡ上 生具有启动子核苷酸序列（－ＴＴＴＣＡＴＡ－）,激活     

热休克蛋白70可加速哺乳动物细胞热休克反应的恢复

热休克蛋白７０可加速哺乳动物细胞热休克反应的恢复热休克转录因子（ＨＳＦ）是一种特殊序列的ＤＮＡ结合蛋白,可以三聚体的形式紧密结合于被称做热休克元件（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｅｌｅｍｅｎｔ,ＨＳＥ）的热休克基因启动子区域,促进热休克基因表达。最近,Ｋｉｍ等在...     

T7启动子在哺乳类动物细胞中启劝外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（ＬＤＬ）受体基因ｃＤＮＡ和氯霉素乙酰转移酶基因（ＣＡＴ）及ｐｏｌｙＡ信号序列被克隆进行ＰＧＥＭ４载体的Ｔ７噬菌避动子下游,构建成质粒ＰＴ７ＬＤＬＲ和ＰＴ７ＣＡＴ,两个重组质粒转化ＣＨＯ细胞,ＰＣＲ和ＣＡＴ酶实验显示：两个基因被Ｔ７噬菌体启动子所启动,结果证实真核生物ＲＮＡ聚合酶能够识别Ｔ７启动子,转录外源基因,常用的含有Ｔ７启动子的质粒可同时的核生物和真核生物的表达载体。     

枯草杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆及表达

以质粒Ｐｕｃ１８为载体,从枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＢ１０４基因组中克隆到一个内切葡聚糖酶基因。限制酶切分析表明重组质粒中的插入片段为３.５ｋｂ,其中各含有一个ＥｃｏＲＩ,ＨｉｎｄⅢ和ＰｖｕⅡ位点。该插入片段含有一完整的内切葡聚糖酶基因,其自身启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。当加入ｌａｃＺα基因启动子的诱导物ＩＰＴＧ后,内切葡聚糖酶表达量提高２.８倍。加入０.５％葡萄糖能抑制该基因的表达。该基因在大肠杆菌ＤＨ５αＦ′中表达的内切葡聚糖酶分布为：胞外６７.３％,胞间周质３.９％,胞内２８.８％。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实了该插入片段来自供体菌Ｂ．ＳｕｂｔｉｌｉｓＤＢ１０４。     

豌豆卷须肌动蛋白Ⅱ类异型体cDNA克隆的序列分析

分析１５个豌豆卷须肌动蛋白ｃＤＮＡ 克隆的限制性内切酶图谱,发现在豌豆卷须中至少存在三类肌动蛋白异型体,分别命名为Ⅰ类（ＰＥＡｃ Ⅰ）、Ⅱ类（ＰＥＡｃ Ⅱ）和Ⅲ类（ＰＥＡｃ Ⅲ）异型体．三类异型体的克隆数目分别为１０、４和１个,表明三类异型体在豌豆卷须中的表达是不同的,很可能具有组织或发育阶段的特异性．对Ⅱ类异型体的三个ｃＤＮＡ 克隆ＰＥＡｃ３、ＰＥＡｃ９和ＰＥＡｃ１１进行了全序列测定,所测定的序列已被ＧｅｎＢａｎｋ 数据库所接受．测序结果表明,ＰＥＡｃ３、ＰＥＡｃ９和ＰＥＡｃ１１的序列长度分别为１５５０、１６８０和１０９１个核苷酸,其中编码区长１１３４个核苷酸,编码的氨基酸长度为３７７（ＰＥＡｃ１１缺少编码氨基端前９６个氨基酸的核苷酸序列）．三个克隆的核苷酸序列完全相同,差别仅在于３′非翻译区的长度不同,即ｐｏｌｙ（Ａ）的加入位点不同．这说明它们可能是由同一基因转录而来,但转录后的加工过程不同．豌豆卷须中肌动蛋白基因ｐｏｌｙ（Ａ）加入位点的使用,可能与组织或发育的特异性表达有关．此外,豌豆卷须肌动蛋白三类异型体之间的核苷酸序列同源性为８０％ ,氨基酸序列同源性为９４％ ．     

hsp70与c—myc,c—fos和p50的结构及功能联系

热休克蛋白７０基因启动子部位有ｍｙｃ原癌基因产物的两个结构位点,分别位于ｈｓｐ７０基因５＇上游－１６０和－２３０碱基处,ｍｙｃ蛋白可以与其结合调节ｈｓｐ７０基因的转录活性,ｃ－ｆｏｓ基因启动与ｈｓｐ７０启动子区域存在着一种共同的反式作用因子结合区,可能受一种共同的特异性反式作用的调节,野生型Ｐ５３对ｈｓｐ７０启动子的抑制可能与ＣＣＡＡｂｏｘ结合因子有关;ｈｓｐ７０resume     

青霉胞外菊粉酶的纯化和性质研究

青霉菌（ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍＳＰ．９１－４）产生的胞外菊粉酶（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｎｕｌｉｎａｓｅ）粗酶液,经硫酸铵沉淀,超滤浓缩,Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ－１００凝胶过滤,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ离子交换柱层析等步骤,得到提纯３０倍的酶Ｅ。酶Ｅ反应时最适ｐＨ４．５,最适温度为５０℃,在ｐＨ４．７～７．６范围内,温度５０℃以下酶Ｅ活性稳定;其活性受Ａｇ＾＋,Ｃｕ＾２＋ＰＣＭＢ强烈抑制。采用     

牛免疫缺陷病毒长末端重复序列(BIV一LTR)在大肠杆菌中的启动子功能

牛免疫缺陷病毒（ＢＩＶ）的长末端重复序列（ＬＴＲ）含有病毒的启动子,调控病毒在真核细胞中的表达。我们将ＢＩＶＬＴＲ与萤火虫荧光素酶基因连接构建成重组质粒ｐＢＩＶ一Ｌｕｃ,该质粒能在Ｅｃｏｌｉ中有效地表达出荧光素酶的活性,从而证明ＢＩＶＬＴＲ在大肠杆菌中也具有启动子功能。Ｍｕｎｇｂｅａｎ核酸酶作图分析发现,ＢＩＶＬＴＲ在Ｅｃｏｌｉ中的转录起始位点位于Ｕ_３区,而不是在真核细胞中的Ｕ＿３一Ｒ交界处。同时我们也证实了ＢＩＶＬＴＲ在Ｅ,ｃｏｌｉ中仍可被ＢＩＶｔａｔ蛋白特异性地反式激活,为研究ｔａｔ蛋白的作用机制提供了一条新的途径。     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｃ２总ＤＮＡ经ＰｓｔＩ部分酶切后分离２～１０ｋｂ的片段,插入质粒ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点,转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）,利用几丁质平板从约８０００个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆（命名为ｐＣＨＴ１）。用１２种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长３０ｋｂ,其中各有一个ＫｐｎＩ,ＳａｃＩ和ＳｓｐＩ位点。把该克隆片段反向插入ｐＵＣ１９的ＰｓｔＩ位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实了该片段来自于Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓＣ２基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它７株几丁酶产生菌的总ＤＮＡ杂交。     

HIV－1外膜（env）基因在重组痘苗病毒中的高效表达

应用重组痘苗病毒作载体,在ＡＴＩ、Ｐ７．５突变型早期启动子控制下,高效表达了（经定点突变去除一处早期终止信号的）ＨＩＶ－１ｅｎｖ基因。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证明,晚期启动子活性强的ｐＳＦＪ２－３８能更高效地表达ｅｎｖ基因。经Ｌｅｎｔｉｌ－Ｌｅｃｔｉｎ提取以及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后的激光扫描测定结果,在１０７个感染细胞中可产生５０－７０μｇ的Ｅｎｖ蛋白。     

抗水稻条纹叶枯病毒核酶的设计,克隆及体外活性测定

为探索控制水稻条纹叶枯病毒（Ｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ,ＲＳＶ）设计合成了特异切割该病毒ＲＮＡ保守区及编码病害特异性蛋白（ＤｉｓｅａｓｅＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰ）基因的核酶,核酶基因的长度均为４０个碱基,用化学合成方法合成其正链及与其３＇－末端互补的１５个碱基引物,用ＴａｇＤＮＡ多聚酶合成其互补链。双链ＤＮＡ直接插入克隆载体ＰＧＥＭ３ｚｆ（＋）的Ｓｍａｌ位点。序列测定表明,克隆得到的核酶序列与设计的核酶序列完全一致。经ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶体外转录得到核酶ＲＮＡ。当核酶ＲＮＡ与以同样方法转录得到的靶基因ＲＮＡ混合反应,可得到预期结果相同的切割片段,表明两种核酶在体外均具有特异性切割活性。     

亚硒酸钠对大鼠晶体上皮细胞αA晶体蛋白基因转录的影响

在体外观察了亚硒酸钠（Ｎａ２ＳｅＯ３）作用于大鼠晶体上皮细胞（ＲＬＥｃｅｌｌｓ）而引起其晶体蛋白基因转录的改变,对不同浓度的硒在体外对αＡ晶体蛋白基因转录的影响作了初步的研究,结果发现,随着亚硒酸钠浓度的升高,αＡ基因的转录下降;而当亚硒酸钠浓度升至５×１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ时,αＡ基因的转录又呈反跳性回升,提示硒在致障过程中对晶体蛋白基因转录的影响作用不可忽视。同时αＡ晶体蛋白在晶体细胞内,至少应     

鸡AChRγ亚基基因远端E盒子与myogenin的相互作用

业已证明,鸡ｎＡｃｈＲγ亚基基因５＇连接区,－５０９／－３０２,－３２４／＋３６片段可独立激活异源启动子ＳＶ４０的转录活性;γ基因近端两个Ｅ盒子（ＣＡＮＮＴＧ）与生肌调节因子（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）的相互作用及转录激活分析表明,近端两个Ｅ盒于是γ启动子活性必不可少的,但却是不充分的。利用胶阻滞和ＤＮａｓｅⅠ足纹试验观察了鸡ｎＡｃｂＲγ基因远端Ｅ盒子与ＧＳＴ－ｍｙｏｇｅｎｉｎ融合蛋白的相互作用。胶阻滞试验证明,－５３８／－２８８片段可与ｍｙｏｇｅｎｉｎ相互结合,引起（３２）￣ｐ标记的ＤＮＡ片段在ＰＡＧＥ中迁移率减慢,这种胶阻滞现象可被含Ｅ盒子的未标记片段消除,并被抗鸡ｍｙｏｇｅｎｉｎ单克隆抗体或抗血清所改变。ＤＮａｓｅⅠ足纹试验证明,ｍｙｏｇｅｎｉｎ系通过γ基因转录起始点上游－４２９／－４２４及－４６３／－４５８两个Ｅ盒子与γ基因５＇连接区－５３８／－２８８相互作用。     

T7 启动子作用下人尿激酶原 cDNA 在大肠杆菌中的高效表达及分离纯化

化学合成的人尿激酶原ｃＤＮＡ克隆在表达质粒ｐＥＴ－１１ｄ中,在Ｔ７启动子的作用下,经０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得表达。其表达量占菌体总蛋白的１５％,表达产物以无活性的包涵体形式存在。经体外变复性,Ｚｎ＾２＋选择性沉淀,抗体亲和柱层析,及Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ亲和吸附,所表达的人尿激酶原被纯化为单一条带,其比活约１１００００ＩＵ／ｍｇ。