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1.
大鼠20α羟类固醇脱氢酶(20α-Hydroxysteroiddehydrogenase,20αHSD)cDNA片段,被插入杆状病毒(BacuIovirus)的转移载体pBlueBacⅢ,经野生型病毒DNA的共转染,从被转染的昆虫细胞中获得重组病毒。Northernblot分析,重组病毒感染细胞有20αHSD基因表达。感染细胞裂解液的Western印迹法分析,37kD的蛋白带被20αHSD抗体识别.体外酶活性测定发现,感染细胞裂解液中含有20αHSD酶促活性以上结果提示,大鼠20αHSD在杆状病毒昆虫表达系统成功地获得表达,为今后大量制备和纯化20αHSD创造条件。 相似文献
2.
为建立鸭乙型肝炎病毒LJ-76的转染细胞系,将LJ-76病毒DNA插入到pUC19的EcoRⅠ位点上,分离得到含有双拷贝LJ-76DNA的重组质粒.通过磷酸钙沉淀方法,将经CsCl等密度离心纯化的LJ-76DNA双体导入到人肝癌细胞BEL7402中.收集转染细胞的培养液进行蔗糖密度梯度离心,所得沉淀经检测发现含有LJ-76DNA并具有特异性DHBV内源性DNA多聚酶活性;对上述样品通过DotEIA检测DHBV核心抗原及表面抗原结果为阳性.Southernblot分析表明转染细胞内存在病毒DNA复制中间体cccDNA、ssDNA和rcDNA,而cccDNA被认为是复制活动较为活跃的标志.电镜观察转染细胞的上清发现有病毒颗粒的存在. 相似文献
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抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达 总被引:2,自引:1,他引:1
应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)人-鼠嵌合抗体重,轻链基因,鼠源单克隆抗体OH3重,轻链可变区(VH,VL)cDNA分别与人免疫球蛋白恒区γ3,k,cDNA拼接成人-鼠嵌合抗体基因,含嵌合抗体的转移载体与线性化病毒DNA共转染Sf9细胞,并通过点杂交PCR扩增和Southernblot分析获得重组病毒。Westernblot和竞争ELISA表明以重组病毒感染的 相似文献
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Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因在哺乳动物传代细胞中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)是由病毒编码的主要的与病毒致宿主细胞潜伏感染有关的蛋白之一。我们用基因重组技术,把含有LMP基因(BNLF1)3个外显子(exon)开放阅读框架(ORF)的长1.80kbp的DNA片段,和能分解HygromycinB的含有SV40早期启动子和HgryomycinB磷酸转移酶全基因(长1025bp)的DNA片段(长1.60bp),同时重组于亚克隆载体pBluescriptSK(pBS)中,并使该重组质粒pBS-LMP-Hyg(长5767bp)在乳地鼠肾传代细胞(BHK)中获得表达。BHK细胞在经此重组质粒转染后,LMP阳性细胞是2%,在HygromycinB的持续压力下,LMP表达细胞率可达20%。3个月后,LMP表达细胞逐渐减少。5个月后,不能测到LMP表达细胞。经免疫荧光和蛋白印迹(Westemblot)实验证实,人鼻咽癌、风湿性关节炎和正常人血清中不含有抗LMP抗体。 相似文献
5.
CD40配体(CD40L)是TNF超家族成员,表达于人活化的CD4^+T细胞表面,与存在于B细胞、抗原递呈细胞表面的相就受体CD40分子相互作用,促发并调节机体的体液免疫和细胞免疫应答。用PCR法从CD40L全长cDNA质粒中扩增CD40L胞外段编码cDNA,即可溶性CD40L(sCD40L)编码cDNA,并克隆入pSK质粒;cDNA序列经测序证实后与pPICZαA质粒重组构建成pPICZαA-s 相似文献
6.
SA脂质体介导DNA转染细胞的进一步研究 总被引:3,自引:0,他引:3
SA脂质体可高效介导DNA转染CV-1细胞,本文进步研究表明,SA脂质体还可介导DNA高效瞬时和稳定地转染CHO和COS细胞。SA脂质体和DNA形成复合物可保护DAN不被核酸内切酶和DNaseI降解。荧光标记和细胞松驰素B抑制实验分别表明,SA脂质体易被细胞吸附,主要通过内吞传送DNA进入细胞,而Lipofectin主要通过融合传送DNA进细胞。 相似文献
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毛积芳 《中国生物化学与分子生物学报》1996,12(6):633-636
利用谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)融合基因表达系统,大鼠20α羟类固醇脱氢酶(20αHydroxysteroidDehydrogenase,20αHSD)在大肠杆菌中得以成功地表达。亲和层析和Thrombin消化,可从融合蛋白中回收和纯化重组20αHSDSDS-PAGE、Western印迹法和酶活性测定显示,重组20αHSD具有天然蛋白质相同分子量、相似的抗原性和酶催化活性,其对NADP的K_m值和V_(max)分别为9.5μmol/L、334nmo1/(min·mg),对底物20α羟孕酮(20αHydroxyprogesterone,20αOHP)的K_m值和V_(max)分别为5.9μmol/L和347nmol/(min·mg),利用该表达系统大量制备大鼠重组20αHSD,为深入研究20αHSD的生理活性和功能创造条件。 相似文献
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通过测试γ射线辐照下超螺旋pBR322 DNA分子单链断裂(SSB),双链剂量效应,得到SSB、αDSB产额与DNA现含一定浓度甘露醇的DNA溶液体系中,G(SSB)、G(αDSB)的例数与c(DNA)的倒数成线性关系,并以二级动力学描述了DNA和甘露醇分子对.OH的竞争反应,得到.OH引起SSαDSB的速率常数及其效率。 相似文献
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将我国单纯疱疹病毒I型168株基因组DNA中扩增出的糖蛋白D基因,插入痘苗病毒p7.5启动子下游,使其在痘苗病毒天坛株表达,免疫荧光分析表明,产生的重组病毒糖蛋白D能被运到被重且病毒感染的143细胞表面表达,表达的产物经Westenblot鉴定为分子量约50kD的多肽,Southernblot证明重组病毒基因组中整合有HSV-1168株糖蛋白基因片段,重组病毒免疫家兔后,产生了高滴度的HSV特异性 相似文献
11.
将抗癌胚抗原(CEA)单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK-His,与修饰的家蚕核型多角体病毒Bm-BacPAK DNA共转染家蚕细胞,经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗CEA ScFv基因的重组病毒Bm-BacScFv。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫,在两者中均得到了高效表达,产物分子量为28kD,前者占细胞总蛋白的6%,后者为0.3mg/蚕。目的基因在家蚕细胞和 相似文献
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应用亲和层析法是纯鸡马立克氏病病毒PP38基因重组产物 总被引:3,自引:0,他引:3
利用鸡马立氏病病毒(MDV)I型特异单克隆抗体H19致敏Sepharose4B-CNBr,从感染重组病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞中提纯鸡马立克氏病毒PP38基因重组产物,获得良好效果,提纯的蛋白质的SDS-PAGE中表现出一条分子量约为38kDa的蛋白质条带,在免疫印迹试验中该蛋白质带也能被单克隆抗体H19识别。利用该提纯的重组PP38免疫小鼠,所制备的小鼠抗血清在免疫荧光染色试验中不仅能与感染重组病 相似文献
14.
牛病毒性腹泻病毒基因组cDNA文库的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)┥nL株的基因组RNA为模板,经逆向转录酶作用,合成第一链cDNA,再以RNadse/H与DNA聚合酶I联合作用合成dscDNA,并以dC同聚物尾化。pUC8DNA在Pst I酶解后,以dG同聚物尾化,两者退火构成重组质粒,转化到E.coli JM101受体菌中,另以γ-^32P-ATP标记BVDV RNA制备探针,通过菌落原位杂交筛选重组子。酶切分配表明重组质粒插入 相似文献
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一种新型家蚕核多角体病毒Bac to Bac系统的构建 总被引:9,自引:0,他引:9
用家蚕核型多角体病毒的全基因组DNA与Ac-BacimidDNA共转染家蚕BmN细胞,构建转座一穿梭载体Bm-Bacmid。另一供体质粒以转座方式将乙肝病毒e抗的基因HBeAg整合到Bm-Bacmid的attTn7位点上成为重组rBmHBe。结果表明Bm-Bacmid既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制,又能在家蚕BmN细胞和草地夜蛾Sf9细胞中复制,形成感染性病毒粒子。Southernblottin 相似文献
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由含有BHBV-1(BovineHerpesVirus-1)前早期基因的基因组片段亚克隆BICPO(BHV-1InfectedCellProteinO)的DNA序列至表达载体pSVK3,构建质粒pSV2.9。将该质粒与pBLTR-Luc共转染小牛肺细胞,检测转染细胞裂解物的荧光素酶活性,BICPO的表达产物可以显著地激活BIVLTR启动子控制下的荧光素酶基因的表达。根据pSV2.9与含有BIVLTR不同区段缺失的质粒pD-319-Luc、pD-115-Luc、pD-52-Luc共转染小牛肺细胞的实验结果,推测BIVLTR-319位上游区的DNA序列影响BICPO基因产物对BIVLTR表达的激活作用。 相似文献
17.
用重组痘苗病毒表达pGHcDNA的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
构建了含有pGHcDNA的重组痘苗病毒,用ELISA证明该重组病毒在被感染的h143细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为1.05μg/10^6细胞(24h),用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达pGHcDNA,同时还构建了含双拷贝pGHcDNA的重组痘苗病毒,并证明其pGH表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为1.50μg/10^6细胞(24h) 相似文献
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人巨细胞病毒的分子克隆及其特异性DNA探针的制备 总被引:6,自引:0,他引:6
从人巨细胞病毒(HCMV)培养物中提取HCMV并抽提其DNA,经限制性内切酶BamHI完全消化后,与质粒pBluescript-SK重组建立了HCMV的DNA文库,从此文库。中随机筛选出两个重组质粒(pCMV-1和pCMV-2),用BamHI分析证明其中所含的病毒DNA片段的大小分别为1.0kb和7.5kb,将这两种质粒大量扩增纯化后,用光生物素进行标记作为探针,证明其只与HCMV反应,与正常人细胞DNA及Ⅰ型和Ⅱ型单纯疤疹病毒DNA无交叉反应。 相似文献
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NNK诱发BEP2D细胞产生活性氧及其对DNA的损伤 总被引:4,自引:0,他引:4
通过测定细胞内和细胞上清中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,以及DNA 加合物——8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷(8-hydroxydeoxyguanosine,OH8dG)含量,对烟草特异亚硝胺类化合物4-甲基亚硝胺-1(3-吡啶基)-1-丁酮(4-(m ethylnitrosam ino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone,NNK)诱发人乳头状病毒永生化的人支气管上皮细胞(hum an papillom avirus-im m ortalized hum anbronchialepithelialcellline,BEP2D)产生的ROS及其对DNA 的氧化损伤进行研究,并观察纳米硒的保护作用.结果表明,BEP2D 细胞经不同浓度的NNK 作用后,细胞内和细胞上清中ROS以及OH8dG含量均显著增加,并有较好的剂量效应关系.1 μm ol·L- 1纳米硒(nanoselenuim ,NS)能明显抑制NNK 诱发BEP2D细胞产生的ROS及OH8dG 水平.揭示NNK 能造成细胞的氧化损伤,而NS对NNK 所致细胞的氧化损伤有保护作用. 相似文献
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重组家蚕病毒表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白 总被引:6,自引:1,他引:5
将传染性囊病病毒HZ96株主要宿主保护性抗原VP2的cDNA基因克隆到杆状病毒转移载体pBac-PAK8中,获得重组转移载体pBacPAK-VP2,载体pBacPAK-VP2与修饰病毒Bm-BacPAK6线性化基因组DNA共转染单层家蚕Bombyx mori(Bm)N细胞,经细胞内同源重组,筛选到重组病毒。ELISA和Western免疫鲩迹结果表明,VP2在家蚕培养细胞和家蚕幼虫中均得到了表达。 相似文献