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1.
利用PCR扩增和合成突变引物的方法,将PAL-1的Glu350和Glu351分别突变为Gly和Lys,在大肠杆菌中表达并分离纯化突变体PAL-1(E350G,E351K),用盐酸胍激活并以ELISA法确定它与野生型rPAI-1的相对含量。通过对u-PA,t-PA抑制的动力学研究表明,突变体与野生型rPAI-1相比,对u-PA和t-PA的抑制活性都有明显下降,由活性态向潜伏态转变的半寿期也由0.83h缩短为0.57h。 相似文献
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纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)是组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿型纤溶酶原激活物(u-PA)的特异性抑制剂。对PAI-1分子的结构与功能的认识,有助于了解PAI-1作用的机理。本综述了近年来对PAI-1蛋白分子结构与功能研究的进展,介绍了PAI-1分子中一些区域的作用以及影响PAI-1抑制活性的一些因子。 相似文献
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为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAL-1抗性的新型t-PA溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44~Ser50置换为纤粘蛋白Ⅰ型F区间连接序列GluSerLysProGluAlaGluGlu的t-PA组合突变体FrGGI,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,FrGGI在大鼠血浆中的半衰期延长了15倍,并获得了PAI-1抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。 相似文献
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肿瘤是严重危害人类健康的疾病.研究表明,实体瘤周围环境中的胞外基质蛋白、浸润性免疫细胞和间充质细胞分泌的蛋白质组等均与肿瘤的发生、发展以及肿瘤治疗的耐受性等密切相关.肿瘤微环境中一个重要调控因子,纤溶酶原激活物抑制剂1 (plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1),不仅与组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activators,tPA)构成调节纤溶活性的一对关键物质,而且参与肿瘤的侵袭、浸润和转移等多个环节并扮演重要角色.本文针对近年来PAI-1的结构和功能方面研究新进展及其与肿瘤微环境的相关性进行综述,并提出PAI-1可作为抗肿瘤治疗的重要靶点.同时,本文也分析了PAI-1抑制剂对肿瘤干预的研究现状,指出PAI-1抑制剂对肿瘤治疗的潜在应用价值. 相似文献
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糖基化,非糖基化,重组PAI—1功能和性质的比较 总被引:2,自引:0,他引:2
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卵巢纤蛋白溶酶原激活因子及其抑制因子的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
本文综述了近年来作者在研究卵巢纤蛋白溶酶原激活因子(PA)及其抑制因子(PAI)的某些成果。PA是一种高效能蛋白水解酶激活因子,它激活纤蛋白溶酶原成为纤蛋白溶酶,此酶在纤蛋白水解过程中起重要作用。已有证据表明,PA与排卵有关。我们进一步研究发现:(1)在大鼠卵巢体细胞中存在两种PA,即组织型PA(tPA)和尿激酶型PA(uPA);而在卵细胞中只发现tPA;(2)大鼠卵巢tPA明显受促性腺激素和其他激素调节,并在排卵前达到高峰,而uPA没有明显变化;(3)在卵巢体细胞中还发现一种PA的抑制因子(PAI),它与PA结合形成复合体,能部分或完全消除PA活性;(4)只有tPA与大鼠排卵有关;PA和PAI间的相互作用和随激素的波动而引起的动态变化可能对维持卵巢正常生理功能和排卵起重要作用。 相似文献
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为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有PAI-1抗性的新型t-PA溶性剂,利用基因重组及定位突变技术构建了t-PA的K1、K2区糖基化位点消除,PAI-1结合位点缺失,F与E区连接序列His44 ̄Ser50置换为纤粘蛋白I型F区间连接序列Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu Glu的t-PA组合突变体FrGGI,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达,对表达产物的生物学特性分析表明 相似文献
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半衰期延长获得PAI-1抗性的t—PA突变体的构建、表达及特性分析 总被引:3,自引:1,他引:2
用基因重级及定位突变技术成功地构建了t-PA的K1区缺失突变体t-PAdelK1、PAI-1结合位点缺失突变体t-PAdel(296-302)及两的组合突变全t-PAdel(K1,296-302),并在COS-7细胞中实现三的暂时性表达,在CHO细胞中实现了t-PAdel(K1,296-302)的稳定性表达。对表达产物的生物学特性分析表明,t-PAdel(296-302)及t-PAdel(K1 相似文献
10.
用羊β-乳球蛋白基因(BLG)5’区5*10^3b(10^3b,旧称kb)为调序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体载体。对540枚小鼠受精卵进行显微注射,经PCR和Southernblot检测,获得6只整合有人La-tPA的转基因小鼠,整合率为32%。 相似文献
11.
目的:观察糖尿病肾脏病进展过程中血纤溶酶原激活物抑制剂-1的水平变化及应用药物干预其变化后产生的对糖尿病肾脏病的影响。方法:选择于聊城市人民医院就诊的糖尿病肾脏病患者88例,DKDⅢ期43例,DKDⅣ期45例。分别检测各期患者血PAI-1水平,观察其变化趋势。针对DKDⅢ期患者分为对照组(DKDⅢ-C组)和观察组(DKDⅢ-O组),对照组给予常规降糖、保护肾脏及血管紧张素转化酶抑制剂等药物治疗。观察组在对照组治疗的基础上给予尿激酶5万U加入100ml生理盐水静脉滴注,每天1次,共14d。比较两组治疗前后血PAI-1水平、24 h尿白蛋白量、血肌酐、空腹血糖和凝血酶原时间的变化。结果:DKDⅣ期患者血PAI-1水平明显高于DKDⅢ期患者(P<0.001)。DKDⅢ-O组患者治疗后血PAI-1水平下降(P<0.01),且尿白蛋白减少程度有统计学意义(P<0.01),空腹血糖、血肌酐、凝血酶原时间影响无统计学差异(P>0.05)。DKDⅢ-C组治疗前、后血PAI-1、24h尿白蛋白量、空腹血糖、血肌酐、凝血酶原时间变化均无统计学差异(P>0.05)。结论:随糖尿病肾脏病进展,血PAI-1水平呈上升趋势,应用药物降低其水平后可减少早期DKD患者尿白蛋白量,对保护肾功能、延缓肾脏病进展有积极意义。 相似文献
12.
目的:观察糖尿痛肾脏病进展过程中血纤溶酶原激活物抑制剂-1的水平变化及应用药物干预其变化后产生的对糖尿病肾脏病的影响。方法:选择于聊城市人民医院就诊的糖尿病肾脏病患者88例,DKDⅢ期43例,DKDⅣ期45例。分别检测各期患者血PAI-1水平,观察其变化趋势。针对DKDⅢ期患者分为对照组(DKDⅢ-C组)和观察组(DKDⅢ-O组),对照组给予常规降糖、保护肾脏及血管紧张素转化酶抑制剂等药物治疗。观察组在对照组治疗的基础上给予尿激酶5万U加入100ml生理盐水静脉滴注,每天1次。共14d。比较两组治疗前后血PAI-1水平、24h尿白蛋白量、血肌酐、空腹血糖和凝血酶原时间的变化。结果:DKDⅣ期患者血PAI-1水平明显高于DKDⅢ期患者(P〈0.001)。DKDⅢ-O组患者治疗后血PAI-1水平下降(P〈0.01),且尿白蛋白减少程度有统计学意义(P〈0.01),空腹血糖、血肌酐、凝血酶原时间影响无统计学差异(P〉0.05)。DKDⅢ-C组治疗前、后血PAI-1、24h尿白蛋白量、空腹血糖、血肌酐、凝血酶原时间变化均无统计学差异(P〉0.05)。结论:随糖尿病肾脏病进展,血PAI-1水平呈上升趋势,应用药物降低其水平后可减少早期DKD患者尿白蛋白量,对保护肾功能、延缓肾脏病进展有积极意义。 相似文献
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了解性激素对血栓形成的影响。方法:用发色底物方法测定去卵巢大白鼠及对照组血浆组织型纤溶酶原激活物(tPA)与其抑制物(PAl)活性。结果:去卵巢组大白鼠血浆tPA与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。而去卵巢组大白鼠血浆PAI比对照组明显降低,两组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:去卵巢组血浆中PAI降低,可能与卵巢激素的减少有关。卵巢激素会促使PAI合成释放增加,这可能是服用雌激素等避孕药者纤溶活性降低,血液呈高凝状态的重要机制之一 相似文献
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大鼠卵巢细胞分泌纤溶酶原激活因子抑制因子(PAI—1)的... 总被引:1,自引:0,他引:1
Rat ovarian cells produce not only plasminogen activator (tPA) but also plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1), and their coordinated geneexpression induced by gonadotropins are thought to be responsible for follicular rupture. In this study, it was demonstrated that (1) theca-interstitial compartment synthesizes the majority of PAI-1 activity in the ovary before ovulation, the follicular wall may therefore serve as a specific barrier to prevent the secretion of PA into the extrafollicular compartment; (2) Granulosa cells contribute only small amount of ovarian PAI-1 activity, but synthesize most of tissue-type plasminogen activator activity involved in the process leading to ovulation: (3) Since only matured cumulus-oocyte complexes secrete high level of tPA and PAI-1, both tPA and PAI-1 activity in the conditioned medium may be used as reliable markers for evaluating oocyte quality for in vitro fertilization. 相似文献
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新鲜猪心组织制成丙酮粉后,用0.45mol/L,pH4.2醋酸钾抽提组织型纤溶酶原活化物(t-PA)。抽提液经硫酸铵盐析,Benzamidine和血纤维蛋白亲和层析,Sephadex G-150凝胶过滤,纯化得到t-PA。比活11000IU/mg,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,分子量为67000。 本文比较了t-PA、高分子量尿激酶(H-UK)和低分子量尿激酶(L-UK)的热稳定性及抑制剂对它们的抑制作用。结果表明,抑制剂对H-UK的抑制作用最强,L-UK次之,t-PA最弱;三者的热稳定性相似。 相似文献
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人肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物cDNA克隆和高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用逆转录 聚合酶链式反应 (RT- PCR)方法 ,从中国正常人肾小球系膜细胞总RNA中扩增出人纤溶酶原激活物抑制物 (PAI 1 )基因cDNA编码区序列 ,并定向亚克隆至pUC1 9质粒 ,克隆的PAI -1cDNA去除了信号肽核苷酸序列并加入新的起始密码ATG ,编码区序列与文献报道的人内皮细胞PAI -1cDNA序列完全相同 .将PAI -1cDNA定向亚克隆至原核表达质粒 pBV2 2 0 ,构建了重组PAI -1基因表达质粒pBV2 2 0 PAI -1 ,在大肠杆菌中得到了高效表达 ,重组PAI -1蛋白表达占菌体总蛋白 45 % .Westernblotting检测 ,在分子量约为 43.0ku处出现一特异性蛋白质条带 .对形成包涵体的表达产物进行变复性处理及FPLC纯化 ,获得纯度 97%以上的潜伏态重组PAI -1 .经 4mol/L盐酸胍激活后 ,重组PAI- 1具有与天然PAI- 1同样的生物学活性 ,对尿激酶型纤溶酶原激活物 (u- PA)具有显著抑制活性 . 相似文献
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人组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)组合突变体FrGGl在CHO细胞中的… 总被引:3,自引:0,他引:3
为了得到t-PA组合突体FrGGl在CHO细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子(enhancer)去除,构建了FrGGl真核表达质粒pZLFrGGI。酶切线化后,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr)。氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在1×10^-7mol/LMTX压力下,获得表达水平达1500~2500IU/1 相似文献
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目的:重组表达抗PAI抑制作用的t-PA突变体,经诱导表达、复性、纯化后进行生物学活性和酶动力学分析。方法:构建pBV220-tpa重组表达质粒,经DNA测序确认后,转化至大肠杆菌DH5a,温控诱导表达,凝胶过滤法对包涵体蛋白进行初步纯化,复性后,过刺桐胰蛋白酶亲和层析柱纯化,酶动力学分析其活性。结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,表达蛋白占总菌体蛋白的30%,经纯化后纯度达90%以上,比活性为7.0×108IU/mg,t-PA突变体与PAI-1反应后,其活性未受到抑制。t-PA突变体酶的米氏常数Km为0.5298,最大水解速度Vmax为0.0595。结论:经生物学活性测定,表达蛋白能够明显抵抗PAI的抑制作用,并具有良好的生物活性,该突变体有可能成为用量更少、疗效更佳的新型溶栓药物。 相似文献
19.
纤溶酶原K5抗血管增生活性依赖其完整Kringle结构域 总被引:6,自引:0,他引:6
根据K5蛋白(Pro451—Ala541)的结构特征和二硫键分布特点,设计K5的两个缺失突变体K5 mut1(Cys461—Cys540,保留K5 kringle环3个完整二硫键但去除N端和C端多余氨基酸)和K5 mut2 (Cys482—Cys535,打开kringle环,只保留2个二硫键).以野生型人纤溶酶原K5 cDNA为模板,用PCR方法得到编码缺失突变体的DNA片段,定向克隆入pET22b(+)质粒载体,重组体转化进大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达,产物经亲和层析和高浓度甘油透析纯化后进行鉴定和生物活性测定.K5 mut1蛋白特异性抑制人视网膜微血管内皮细胞增殖,且活性强度是完整的K5蛋白2倍;K5 mut2对人视网膜微血管内皮细胞无显著抑制作用.结果提示,完整的Kringle结构(包含3个二硫键)是维持人纤溶酶原K5抗血管增生活性的必需结构域,而K5分子中Kringle结构域外的N端和C端氨基酸臂则并非其活性所必需. 相似文献
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亲和层析纯化HepG2细胞分泌的PAI—1 总被引:1,自引:0,他引:1
本文报道用抗PAI-1单克隆抗体(McAb)亲和层析建立了纯化PAI-1的简便方法。经免疫亲和层析,Sephacryl S200凝胶过滤,从HepG2细胞培液中分离到糖基化和非糖基化两种形式的PAI-1,回收率为84%,PAI-1比活性为6.1×10^4IU/mg。糖基化PAI-1分子量为50kD,比活性5.8×10^4IU/mg。非糖基化PAI-1分子量43kD,占总PAI-130%,仍具有PA 相似文献