3-甾酮-1-脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达及甾体转化研究

将简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶基因(ksdD)克隆到大肠杆菌表达载体pET-22b( )上,构建重组质粒pET-ksdD,利用IPTG诱导酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达,4h后取样,分别对超声破碎后的上清和沉淀进行SDSPAGE和酶活分析,结果表明表达出的3-甾酮-1-脱氢酶的分子量大约为56kD,超声破碎后的细胞破碎液对4-AD的转化率较简单节杆菌提高了近10倍.     

IL-1023-57-PE40分泌表达的初步研究

将IL-1023-57-PE40基因与pelB信号肽融合置于pET-20b构建分泌表达质粒pET-20b-IL-1023-57-PE40,然后将pET-20b-IL-1023-57-PE40分别转化至BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Rosetta(DE3),E·coliK12TB1,ER2566中。无论是在37℃或是在26℃,亦或在培养基中添加葡萄糖的情况下,IPTG诱导后,IL-1023-57-PE40蛋白只在BL21(DE3)pLysS菌中以可溶分泌形式表达,其中以37℃时培养基中不添加葡萄糖表达量为最高,占菌体蛋白总量的15%,说明蛋白的分泌表达与菌种的选择有关。表达产物经免疫印记检测可被抗PE40的特异抗体识别。通过质粒稳定性实验证明,pET-20b-IL-1023-57-PE40在BL21(DE3)中不稳定,导致蛋白的不表达,在Rosetta(DE3)BL21,E·coliK12TB1,ER2566中稳定但不表达,因此,以Rosetta(DE3)BL21为例,通过SDS-PAGE、DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对本室构建的几种PE重组毒素进行比较分析,我们发现:并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,PE重组毒素分泌表达还可能与导向部分的性质有关。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

趋磁菌AMB-1超氧化物歧化酶Fe-SOD在大肠杆菌中的表达及生理活性研究

超氧化物歧化酶(SOD)可以减轻超阳阴离子O2-对细胞的毒害作用,提高菌体的抗氧化能力,从而改善菌株的生理状态.利用PCR技术,将趋磁菌AMB-1的超氧化物歧化酶基因esod克隆至原核表达载体pET-20b(+),并在E coli BL21(DE3)有效表达.重组菌株BL21 (DE3)/(pET-20b-fesod-histag)在0.6 mmol/L IPTG诱导浓度下进行发酵培养,在生长前期2-14 h生长速率优于对照组E.coli BL21(DE3)/(pET-20b).通过亲和层析柱纯化后,重组酶蛋白纯度达电泳均一,超氧化物歧化酶fesod活性最造作用温度为25℃,在25℃和45℃下酶热稳定较好,pH4.2-8.2之间酶活力稳定.趋磁菌AMB-1来源的Fe-SOD作为一种抗氧化酶,在大肠杆菌中的有效表达从一定程度上改善了宿主菌的生长情况.     

不同载体表达的家蝇β-葡萄糖苷酶生物学活性比较

克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BG)基因,建立两种原核表达体系和一种真核表达体系,分别检测表达产物的活性,比较不同表达体系对其表达水平及重组蛋白酶学性质的影响,为进一步研究和利用家蝇BG酶奠定基础。本研究根据BG酶基因的cDNA序列设计引物扩增BG酶基因成熟肽的基因片段,分别采用表达载体pET-28a(+)和pEGX-4T-1构建原核表达体系并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。在65 kDa附近均出现特异性蛋白条带,进行Western Blotting鉴定证实重组质粒在其宿主菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,命名为MDBG-1蛋白和MDBG-2蛋白。同时选用真核表达载体pPICZa A构建酵母分泌型表达体系在酵母细胞GS115中获得稳定的表达,将其命名为MDBG-3蛋白。采用七叶苷平板法和DNS法对三种表达体系所重组表达的蛋白进行酶活性鉴定和检测,显示3种表达体系所表达的融合蛋白均具有BG酶活性,其酶活力有所不同,且真核表达体系所表达的蛋白酶活性最高。本研究对家蝇β-葡萄糖苷酶基因表达的重组蛋白特性进行初步研究,为发现新的有效纤维素酶体系提供基础数据。     

吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达

利用重叠延伸(SOEing)PCR技术,将吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)ZQ0910株表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因通过Linker序列融合,构建成为Sip-GAPDH融合基因。将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明,重组质粒pET-32a-Sip-GAPDH在大肠杆菌BL21(DE3)中表达后所获得的融合蛋白Sip-GAPDH分子量为102.01 kD,表达最佳条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导5 h。Western blot鉴定结果表明融合基因得到了成功表达。     

α1,2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)基因组DNA中获得α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fuco-syltransferase,α1,2-fuct)基因,得到大小为906 bp的目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中,得到重组表达载体pET-fuct。将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,25℃,0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,可表达出相对分子质量为33 kD的蛋白,与预期分子量一致,说明α1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌BL21中实现表达,应用HPLC法进行酶活检验,酶活达到了13.21 pmol/(mgPr.h)。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.     

克雷伯肺炎杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因克隆及表达条件研究

1,3-丙二醇氧化还原酶是甘油歧化为1,3-丙二醇的一种关键酶。本研究从克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组中,用PCR方法克隆了其编码基因dhaT。TA克隆测序正确后,构建胞内表达载体pET-28a-dhaT和分泌表达载体pET-22b-dhaT,然后转化E.coliBL21(DE3)进行原核表达。表达部位确定、SDS-PAGE和酶活分析表明,该酶得到了高水平表达。其中使用pET-22b表达的目的蛋白大都是不溶的包涵体;而使用pET-28a表达的目的蛋白胞内可溶,占胞内可溶总蛋白的45%,占菌体总蛋白的25%。常规(30℃)诱导表达即呈现1,3-丙二醇氧化还原酶活性,但低温(20℃)14 h诱导显示3.7倍的酶活性。     

线虫抗凝血蛋白c2的融合表达及其抗凝活性分析

目的:在大肠杆菌中表达硫氧还蛋白-线虫抗凝血蛋白c2(Trx-NAPc2)融合蛋白,并检测其抗凝活性。方法:将扩增的NAPc2基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到表达载体pET-32a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),分别经IPTG和乳糖诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用体外凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)试验检测抗凝血活性。结果:构建了pET-32a/NAPc2表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,纯化的Trx-NAPc2融合蛋白能明显延长PT及aPTT。结论:在大肠杆菌中高效表达了具有生物活性的Trx-NAPc2融合蛋白,为进一步研究NAPc2的功能及应用奠定了基础。     

两种茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA在原核中表达的研究

采用原核表达系统pET-32a( )载体和BL21trxB(DE3)菌株对两条茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA(GluⅠ和GluⅡ)进行了表达,研究了不同诱导时间、不同诱导温度对两个茶树β-葡萄糖苷酶表达量的影响并测定了两者的活性。表达分析结果表明,诱导6h、25℃时,GluⅠ在总蛋白中所占比例最高;诱导6h、37℃时,GluⅡ在总蛋白中所占比例最高,活性测定结果表明,两种表达蛋白均具有正常的β-葡萄糖苷酶活性,在相同的测定条件下,GluⅡ活性(0.310±0.03U·ml-1)比GluⅠ(0.234±0.03U·ml-1)活性更高。     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶基因的克隆表达与纯化

以克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板, 运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶(GDH)的基因(gldA), 并克隆到pMD-18T载体上, 构建克隆载体pMD-gldA。经测序正确后, 将gldA亚克隆至表达载体pET-32a(+)上构建表达质粒pET-32gldA。在乳糖诱导下, 携带pET-32gldA的E. coli BL21 (DE3)高效表达分子量约为54 kD的可溶性蛋白。表达产物带有His6-tag标记, 选用Ni柱对表达产物进行纯化, 纯化后酶液的比活为188 u/mg, 纯化倍数和回收率分别为3倍和67.5%。     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶基因的克隆表达与纯化

以克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板, 运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶(GDH)的基因(gldA), 并克隆到pMD-18T载体上, 构建克隆载体pMD-gldA。经测序正确后, 将gldA亚克隆至表达载体pET-32a(+)上构建表达质粒pET-32gldA。在乳糖诱导下, 携带pET-32gldA的E. coli BL21 (DE3)高效表达分子量约为54 kD的可溶性蛋白。表达产物带有His6-tag标记, 选用Ni柱对表达产物进行纯化, 纯化后酶液的比活为188 u/mg, 纯化倍数和回收率分别为3倍和67.5%。     

手掌参γ-硫素的原核表达及纯化

目的：在原核系统中高效表达手掌参γ-硫素,并对其进行纯化。方法：通过筛选手掌参cDNA文库获得γ-硫素基因（gcthionin）,分别对其全长及信号肽编码序列缺失的cDNA片段进行PCR扩增,克隆入原核表达载体pET-32（a）,构建重组质粒pET-32（a）/gcthionin和pET-32（a）/Δgcthionin;测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白;SDS-PAGE分析后,采用Ni-NTA亲和层析柱及凝胶柱对可溶性蛋白进行纯化,Western blotting鉴定。结果：gcthionin基因开放式阅读框全长225nt,编码一个由74个氨基酸残基组成的蛋白;带有信号肽的重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中以包涵体形式表达;信号肽缺失可以极大地提高外源蛋白的可溶性,该可溶性产物经Ni-NTA柱及凝胶过滤后可获得纯度较高的蛋白,经Western blotting分析,相对分子质量约21.9×10^3处有明显的蛋白条带,与预期蛋白分子大小一致。结论：信号肽编码序列缺失的Δgcthionin可在大肠杆菌中可溶、高效表达。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

刺五加内生青霉鲨烯合酶蛋白表达和定位

目的:对刺五加的内生菌青霉属Penicillium minioluteum P116-1a的鲨烯合酶(Squalene synthase,PmSS)进行原核表达和荧光定位。方法:将PmSS基因连接pET-30a(+),转化BL21(DE3)后诱导表达,通过SDS-PAGE分析表达效果。利用荧光表达载体pDsRed2-N1对PmSS蛋白定位。结果:成功构建了PmSS基因的体外表达载体pET-30a-PmSS,在BL21(DE3)能表达出约60 kDa的蛋白。温度为30℃,IPTG浓度为0.6 mmol/L时的表达量最高。荧光定位结果显示,PmSS呈点状或面状集中分布于内质网上。结论:获得了PmSS重组蛋白并确定了PmSS的表达部位,为进一步研究P.minioluteum提高刺五加皂苷含量的机制奠定基础。     

简单节杆菌3-甾酮-△1 -脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究

目的:将来源于简单节杆菌的3-甾酮-△~1-脱氢酶(3-ketosteroid-Delta(1)-dehydrogenase,KSDD)在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶;利用计算机预测KSDD的三级结构,并通过定点突变确定酶的关键位点以期优化脱氢酶的活性及性质。方法:克隆简单节杆菌编码KSDD的基因ksdd构建原核表达载体,以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主构建重组菌并诱导表达,HPLC法检测重组酶催化4-AD脱氢的转化率;通过SWISS-MODEL同源建模分析KSDD结构,对预测的催化关键位点氨基酸残基进行定点突变并研究突变后重组酶的活性变化。结果:成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组菌E.coli pET-22-ksdd,21℃下诱导表达后,重组酶对4-AD的转化率为27%;通过SWISS-MODEL同源建模预测出脱氢酶结构并对4个关键位点进行定点突变设计,获得突变子Y120R、Y320L、Y488F和G492Y。突变子Y120R和Y488F失活,证明其为酶的活性位点;突变子Y320L的转化率与野生型基本一致,但37℃反应条件下稳定性有所提高;突变子G492Y对4-AD的转化率是野生型的1.2倍,37℃条件下稳定性有所提高,是突变后氨基酸位点疏水性增加和周围静电作用改变所导致。结论:目前对简单节杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶结构分析及催化机理相关的研究较少,本研究验证了KSDD的活性位点,优化了酶的稳定性,为进一步对酶的性质进行定向改造打下了基础。     

淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值.     

枯草杆菌manA基因的克隆及定点突变

manA是编码β-甘露聚糖酶(β-1,4-mannan mannohydrolase EC3.2.1.78)的基因。将枯草杆菌A33株的manA基因插入到pET-32a载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了异源非融合表达,表达活力为41.58U/mL。为了提高酶的表达活力,当采用PCR介导的定点突变技术将该基因第2号密码子CUU突变为GUU,构建成突变表达载体pET-32a-manA*并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,目标酶表达活力增加到138.65U/mL。说明当β-甘露聚糖酶N端第二号氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸后,酶在大肠杆菌中的表达活力大大提高。推测是由于突变后的β-甘露聚糖酶在大肠杆菌中的稳定性增强所致。突变表达的β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH值并没有发生明显改变。     

睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达

从土壤中分离睾酮假单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶（3α-hsd）基因,将扩增产物用NdeⅠ/BamHⅠ消化,切下目的基因片段克隆到质粒pET-15b中构建重组pET-15b.将重组pET-15b转化入E.coli DH5α中,经酶谱分析和测序,鉴定出正确的重组质粒pET-15b.将重组pET-15b转化入宿主菌E.coli BL21(DE3) pLysS中,用硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.提取细菌总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析并测定酶活性.粗提物中酶活性高达2.45×10⁵ U/L.利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析,经一步金属螯合亲和层析纯化后,重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的单一条带,回收率达68%.活性和纯度均较高的目的蛋白3α-HSD的获得,为血清总胆汁酸酶循环法测定奠定了基础.