谷氨酸发酵菌——Brevibacterium ketoglutaricum nov.sp.北京2990-6的代谢 还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸的氧化

(1)对2990-6号菌的NADH_2,NADPH_2的氧化酶系和转氢酶做了初步的观察并与2990-6号菌在发酵产生大量谷氨酸时的酶系活力的变化做了比较。(2)本工作表明NADH_2氧化酶系以及某些与NAD联结的脱氢酶,NADPH_2氧化酶系以及某些与NADP联结的脱氢酶在细胞内的分布上有着明显的区分。(3)应用比较简便的方法测定了2990-6号菌在各不同生理状态下的NAD,NADH_2,NADP,NADPH_2的含量。(4)对2990-6号菌的谷氨酸发酵机制作了简要的讨论。     

鼻硬结克雷白氏杆菌细胞色素b-563的研究 Ⅰ.细胞色素b-563的分离、纯化和鉴定

兼性厌气菌鼻硬结克雷白氏杆菌(klebsiella rhinoscleromatis)具有不完整呼吸链,主要含细胞色素b-563,还可能含细胞色素d。可以用冻化法直接从鼻硬结克雷白氏杆菌丙酮干粉中分离及抽提细胞色素b-563。应用硫酸铵分部沉淀、Zerolit 226阳离子树脂柱层析及DEAE纤维素柱层析可将细胞色素b-563从粗抽出液中纯化800倍以上。纯化的细胞色素b-563在琼脂糖凝胶电泳中均一。氧化型细胞色素b—563的吸收峰为420、535毫微米,还原型为430、583、563毫微米。吡啶血色素原的吸收峰为419、527、557毫微米。根据光谱特性可以说明上述细胞色素属于b 型细胞色素。     

鼻硬结克雷白氏杆菌细胞色素b-563的研究——Ⅰ.细胞色素b-563的分离、纯化和鉴定

兼性厌气菌鼻硬结克雷白氏杆菌(Klebsiella rhinoscleromatis)具有不完整呼吸链,主要含细胞色素b-563,还可能含细胞色素d。可以用冻化法直接从鼻硬结克雷白氏杆菌丙酮干粉中分离及抽提细胞色素b-563。应用硫酸铵分部沉淀、Zerolit 226阳离子树脂柱层析及DEAE纤维素柱层析可将细胞色素b-563从粗抽出液中纯化800倍以上。纯化的细胞色素b-563在琼脂糖凝胶电泳中均一。氧化型细胞色素b-563的吸收峰为420、535毫微米,还原型为430、533、563毫微米。吡啶血色素原的吸收峰为419、527、557毫微米。根据光谱特性可以说明上述细胞色素属于b型细胞色素。     

鼻硬结克雷白氏杆菌细胞色素b-563的研究 Ⅱ.细胞色素b-563的物理、化学性质和生物活力

用正铁氰化钾-亚铁氰化钾系统,测得在pH7.0,30℃时鼻硬结克雷白氏杆菌(Klebsiellarhinoscleromatis)细胞色素b-563的氧化还原电位为+0.127伏。纯化的细胞色素b-563含铁量为0.28%,依此计算得最低分子量为20000。还原型α、β及Soret 带吸收峰的毫克分子消光系数分别为35.2、20.1和197.5mM~(-1)厘米~(-1)。细胞色素b-563能自身氧化,一氧化碳和氰化钾对细胞色素b-563的吸收光谱没有影响。细胞色素b-563在鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂存在下,能被还原辅酶Ⅰ.乳酸、甲酸及琥珀酸还原,相对还原速度依次为1.6、1.5、1.24和1.0,说明纯化细胞色素b-563具有一定的生物活力。细胞色素b-563可用盐酸-丙酮方法将辅基分离。经光谱、纸层析及重组合等试验,证明辅基为氯正铁血红素。细胞色素b-563可以酶蛋白及氯正铁血红素重组合,重组合细胞色素b-563在光谱上和原细胞色素完全相同。酶蛋白和氯正铁血红素之重组合不受对氯汞苯甲酸的抑制,说明两者可能不是通过巯基相联。重组合的细胞色素b-563仍能为鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂及乳酸在厌气下还原,说明仍具部分生物活力。     

鼻硬结克雷白氏杆菌细胞色素b-563的研究——Ⅱ.细胞色素b-563的物理、化学性质和生物活力

用正铁氰化钾-亚铁氰化钾系统,测得在pH7.0,30℃时鼻硬结克雷白氏杆菌(Klebsiella rhinoscleromatis)细胞色素b-563的氧化还原电位为+0.127伏。纯化的细胞色素b-563含铁置为0.28%,依此计算得最低分子量为20000。还原型α、β及Soret带吸收峰的毫克分子消光系数分别为35.2、20.1和197.5mM~(-1)厘米~(-1)。细胞色素b-563能自身氧化,一氧化碳和氰化钾对细胞色素b-563的吸收光谱没有影响。细胞色素b-563在鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂存在下,能被还原辅酶Ⅰ.乳酸、甲酸及琥珀酸还原,相对还原速度依次为1.6、1.5、1.24和1.0,说明纯化细胞色素b-563具有一定的生物活力。细胞色素b-563可用盐酸-丙酮方法将辅基分离。经光谱、纸层析及重组合等试验,证明辅基为氯正铁血红素。细胞色素b-563可以酶蛋白及氯正铁血红素重组合,重组合细胞色素b-563在光谱上和原细胞色素完全相同。酶蛋白和氯正铁血红素之重组合不受对氯汞苯甲酸的抑制,说明两者可能不是通过巯基相联。重组合的细胞色素b-563仍能为鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂及乳酸在厌气下还原,说明仍具部分生物活力。     

甲烷古菌群感效应信号分子的检测

竹节状甲烷鬃菌(Methanosaeta harundinacea)6Ac是本实验室分离自厌氧颗粒污泥中的甲烷古菌新种。该菌具有短杆(3μm-5μm)和长链状(>200μm)两种细胞形态,且与细胞密度相关,暗示该菌可能存在群感效应调控的细胞形态变化。【目的】验证该菌存在群感效应信号分子并与细胞形态变化相关。【方法】用高丝氨酸内酯指示菌Agrobacterium tumefaciens NTL4检测菌株6Ac的培养液,并用购买的高丝氨酸内酯标准品加入短杆菌株6Ac检测形态变化。【结果】菌株6Ac的培养液中含有高丝氨酸内酯类物质。实验证明化学合成的高丝氨酸内酯N-(β-酮基)辛酰高丝氨酸内酯能够促进竹节状甲烷鬃菌的长链细胞形成。而且在马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)和甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum)的培养液中也检测到了高丝氨酸内酯。【结论】多种甲烷古菌可以产生高丝氨酸内酯类物质,并可能以此类物质作为群感效应的信号分子。     

光合磷酸化的研究 XV.含有2,6-二氯酚靛酚的叶绿体系统光促电子传递的作用光谱

利用菠菜叶绿体为材料,比较了K_3Fe(CN)_6和DOPIP+K_3Fe(CN)_6系统在620—705mμ光谱区段中的作用光谱。发现两者是完全一致的,在620—685mμ区段中量子效率相仿,当波长大于685mμ后则效率显著下降。同时还测定了不包括放氧步骤的NADP+DCPIPH_2+维生素C及NADP+DCPIPH_2+维生素C+CMU两系统的作用光谱,它们在620—685mμ范围内的相对量子效率与K_3Fe(CN)_6系统相仿,但对705mμ光的利用效率相对地要比K_3Fe(CN)_6系统高一些。在620—685mμ范围内,所有各系统的作用光谱中,均未见到Arnon所报告的显著的峰和谷,从而认为Arnon根据他所作的各系统的作用光谱的形状而作出的一些推论是有问题的。     

单细胞拉曼光谱在微生物研究中的应用

拉曼显微光谱是一种能够提供0.5–1.0μm空间分辨率的单个微生物细胞内化学结构信息的研究技术。近几年来,拉曼显微光谱被越来越多地应用于微生物单细胞的研究中,它可以快速无损地检测微生物细胞内的特征化学组分。典型的单个微生物细胞的拉曼光谱包含核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质和色素(例如类胡萝卜素)等信息,这些信息能够表征微生物细胞的基因型、表型和生理状态。所以单细胞拉曼显微光谱是一种可用于区分微生物样品的"全生物指纹"技术,它可用于研究单个微生物细胞生命阶段的转变、鉴定微生物单细胞中的色素及其他化合物的含量变化等。本文综述了目前拉曼显微光谱在微生物单细胞研究上的应用,主要包括与稳定同位素标记(stable isotope probing,SIP)、拉曼成像、光谱分类和细胞分选技术结合来探究微生物单细胞对物质吸收后特征峰的变化、推导物质循环过程、进行微生物分类鉴定和探索基因型与表型的关系。拉曼显微光谱作为微生物单细胞研究的手段之一,在代谢过程的研究、活细胞分选和细胞对物质的利用上具有广泛的应用前景。     

光合磷酸化的研究——XVI.甘薯叶细胞制剂光合磷酸化的作用光谱及双光增益效应

我们利用光强效应较不显著的甘薯叶细胞制剂为材料,测定了循环(内源、PMS)及非循环光合磷酸化[K_3Fe(CN)_6,NADP~+]在橙—红光区段的作用光谱及双光增益效应,所得的主要结果如下: (1)在620—680mμ范围内,各系统作用光谱的起伏均很小,没有出现显著的高峰或低谷。(2)当波长超过680mμ时,非循环光合磷酸化系统的效率大降,出现与光合作用及希尔反应中相似的“红降”现象。以640mμ光与708mμ光同时照射,见到双光增益效应的存在。(3)循环光合磷酸化在700mμ光照下,相对效率与短波长光下相近或稍高。波长再向上移则效率也迅速降低。在有氧条件下,708mμ光下的效率也受同时加照的640mμ光的增益,但在无氧条件下则不显示增益效应。作者认为由于部分循环光合磷酸化辅助因子的自动氧化,远红光下放氧反应受阻,影响了光氧化物的还原及重复使用,因而使相对效率降低。本文结果从光合磷酸化的角度,支持叶绿体中存在着两个独立的、有不同色素参与的光化学反应。     

谷氨酸醱酵菌—Brevibacterium ketoglutaricum nov.sp.北京2990-6的代谢 葡萄糖的降解途径

酮戊二酸短杆菌,北京2990-6是一株新的谷氨酸醱酵菌种。周光宇等曾对这株菌的谷氨酸醱酵条件进行了系列研究。这株菌在种子培养基中是不能堆积谷氨酸的,只有在醱酵培养基中才能堆积。因此要了解这株菌的谷氨酸醱酵机制就必须首先了解醱酵     

酮古龙酸菌细胞色素c的表达、成熟及活性分析

目的:从酮古龙酸菌Y25中扩增细胞色素c基因,在大肠杆菌中表达、成熟并进行生物活性分析。方法:从酮古龙酸菌Y25基因组中PCR扩增细胞色素c基因,构建pET22b表达载体;从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增细胞色素c成熟基因簇ccmABCDEFGH,连接到带有山梨糖脱氢酶组成型启动子的pBBR1MCS2-P200载体中;将构建的2个质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行血红素染色检测;通过氧化还原光谱法对Ni柱亲和纯化的重组蛋白进行活性分析。结果:扩增得到1404 bp的细胞色素c基因及6481 bp的ccmABCDEFGH基因簇;重组菌株经IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析,可见相对分子质量为50×103的表达条带;血红素染色显示重组蛋白结合有血红素;经氧化还原光谱扫描,显示亲和层析纯化得到的目的蛋白有细胞色素c特征吸收峰。结论:从酮古龙酸菌Y25中扩增得到了细胞色素c基因,在大肠杆菌中进行了表达和成熟,表达蛋白具有细胞色素c生物活性。     

光合细菌H3菌株色素分析

H3菌株系由盐田微生物层中分离获得的光合细菌株。具有丰富的天然色素。经活细胞色素光谱吸收峰值测定,色素经有机溶剂提取、硅胶薄板层析、SDS－PAGE电泳等,结果表明H3菌株的主要色素包括细菌叶绿素a、细菌脱镁叶绿素（Bacteriophaeophytin）和三种类胡萝卜素。总胡萝卜素含量占细胞于重的0．6％,胡萝卜素蛋白复合体的分子量约11,000.培养条件的差异对色素形成及相对含量有不同程度的影响。     

龙须藤叶粗提物的分离纯化及生物活性初探

为进一步研究和开发新植物源农药,拓宽龙须藤(Bauhinia championii)的生物活性研究,探索其不同组分潜在的杀菌和除草活性,该研究通过常温冷浸提取法提取、真空浓缩得到甲醇提取物。结果表明:用硅胶柱层析分离纯化,经TLC检识和碘缸显色后整合得到9个组分。反复重结晶7号和8号组分中析出的物质,经TLC检识和测熔点,得到1个纯化合物,编为33号,经波谱数据分析与molbase库对照,鉴定该化合物为(1R,2S,3S,4S,5S,6S)-6-甲氧基-1,2,3,4,5-环己烷五醇,是一种重要的工业原料。杀菌和除草活性试验结果显示,粗提物在1 000μg·m L~(-1)时对水稻稻瘟病菌的抑制率为(40.84±1.00)%,对稗草根的抑制率为(49.18±2.33)%;各组分在500μg·m L~(-1)时,4号组分对水稻稻瘟病菌的抑制率达到(44.19±0.76)%,2号和3号组分对稗草根的抑制率分别为(88.92±1.31)%和(90.99±1.45)%,3号和6号组分对马齿苋根的抑制率分别为(72.06±1.31)%和(89.92±1.73)%。这表明龙须藤叶提取物对水稻稻瘟病菌、稗草根和马齿苋根有良好的抑制效果,可进一步分离2号、3号、4号、6号组分,以获得高活性的单体化合物。     

银胶菊丙二烯氧化物合成酶的表达纯化及其活性分析

植物来源细胞色素P450的表达和结晶都十分困难,成为成功解析该类蛋白晶体结构的瓶颈。探索了使用大肠杆菌表达系统表达、纯化银胶菊丙二烯氧化物合成酶(allene oxide synthase,AOS)的方法。氨基酸序列比对分析显示,银胶菊AOS缺失N-末端的膜锚定序列和信号肽序列,推测其在大肠杆菌中应表达为水溶性蛋白质。试验中纯化得到的银胶菊AOS是一个分子量为54.5 kD的八聚体分子,均一性好,不含去垢剂,达到毫克量级,适合下一步的晶体培养研究;还原一氧化碳差示光谱显示该酶在450 nm处有特征吸收峰,酶活性测定得到该酶的米氏常数为45.3μmol/L,显示该重组AOS具有很高的酶活性。     

短梗霉黑色素的分离纯化及结构的初步分析

采用热碱提取、水煮酸沉法从短梗霉发酵液中提取得到黑色素粗品,再经DMSO萃取、酸性甲醇(pH=2)沉淀得到不含多糖和蛋白的短梗霉黑色素。此黑色素不溶于水及常规有机溶剂,可溶于碱性溶液和DMSO;离子交换色谱分析表明黑色素组分均一,出峰时间26±0.5 m in;紫外光谱谱图最大吸收峰为215 nm左右,未见蛋白(280 nm)与核酸(260 nm)的特征吸收峰;红外光谱谱图具有黑色素3μm和6μm的特征吸收峰,并含大量的羟基、氨基,与核磁共振和液质联机谱图结合分析推出短梗霉黑色素可能含有酚羟基、羧基和吲哚等官能团,主要结构骨架为5,6-二羟基吲哚-羧酸和多巴醌,推断该黑色素为酪氨酸酶控制合成的真黑素。     

氟曲马唑对足癣分离病原菌的体外抗菌活性研究

目的评价氟曲马唑对足癣分离病原菌的体外抗菌活性,并与联苯苄唑相比。方法采用CLSI推荐的M-38 A2(皮肤癣菌)和M27-A3(酵母菌)微量液基稀释法对病原菌进行体外药物敏感性测定。结果氟曲马唑对红色毛癣菌最小抑菌浓度(MIC)范围为0.031~2μg/m L,MIC50为0.5μg/m L,MIC90为1μg/m L,GM值为0.637μg/m L;联苯苄唑分别为0.031~16μg/m L,0.25μg/m L,2μg/m L,0.634μg/m L;两药对红色毛癣菌MIC GM值比较差异无统计学意义(P=0.974)。氟曲马唑对趾(指)间毛癣菌MIC范围为0.031~1μg/m L,MIC50为0.031μg/m L,MIC90为0.5μg/m L,GM值为0.17μg/m L;联苯苄唑分别为0.125~16μg/m L,1μg/m L,2μg/m L,1.886μg/m L;两药对趾(指)间毛癣菌MIC GM值比较差异具有统计学意义(P=0.001)。尽管酵母菌菌株数偏少,但研究结果显示两药对念珠菌属和毛孢子菌属MIC GM值比较差异具有统计学意义(P=0.000和P=0.031)。结论氟曲马唑对红色毛癣菌的抗菌活性与联苯苄唑相似,但对趾(指)间毛癣菌、念珠菌属和毛孢子菌属的抗菌活性明显优于联苯苄唑。     

细胞色素f在光合膜上功能的初步探讨

用阳离子一竭尽的菠菜叶绿体膜作为实验材料,比较研究了胰蛋白酶消化的叶绿体膜和非消化的叶绿体膜的四阶导数吸收光谱、细胞色素f的还原减氧化差异光谱和电子传递速率的变化,试图探索细胞色素f在光合膜上的功能.主要结果于下:(1)胰蛋白酶消化引起叶绿体膜四阶导数吸收光谱位于554nm吸收峰(CYT.f的特征吸收峰)下降和细胞色素含量的明显减少.说明胰蛋白酶损伤细胞色素f.(2)胰蛋白酶消化对叶绿体膜从DCIPH_2到甲基紫精的非循环式电子传递速率没有影响,而对PMS存在下的甲基紫精光还原速率有明显的刺激作用.说明胰蛋白酶损伤与循环式电子流有关的细胞色素f.根据试验结果的分析.我们推测,在光合膜上可能存在两种类型的细胞色素f.一种可能与循环式电子流有关.另一种可能与非循环式电子流有关.     

华泽兰根的化学成分及其体外抑菌活性研究

利用硅胶、Sephadex LH-20、HPLC等各种色谱分离技术,从华泽兰根的乙醇提取物中分离得到9个化合物,通过理化性质和NMR波谱数据对它们进行了结构鉴定,分别为:达玛二烯醇乙酸酯(1)、(2R,3S)-5-乙酰基-6-羟基-2-异丙烯基-3-乙氧基苯并二氢呋喃(2)、豆甾醇(3)、邻苯二甲酸二丁酯(4)、12,13-dihydroxyeuparin(5)、5-乙酰-6-羟基-2-异丙烯基苯并呋喃(6)、2,5-二乙酰基-6-羟基苯并呋喃(7)、ruscodibenzofuran(8)、2-乙酰-5-(1-炔丙基)-噻吩-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)。化合物1、2、4和8为首次从该种植物中分离得到,其中2、4和8为首次从该属植物中分离得到。采用牛津杯法评价部分化合物对5种病原菌的抑菌活性,并用肉汤稀释法测定各自的MIC值,结果显示,测试化合物对5种菌具有不同程度的抑菌活性,其中,1、6和8对肺炎克雷伯菌有较强抑菌活性,MIC值分别为0.98、0.98μg/m L和0.49μg/m L,化合物7对大肠埃希菌显示较强抑菌活性(MIC≤3.91μg/m L),化合物1、2、6和7对铜绿假单胞菌有较强抑菌活性,MIC值均为7.81μg/m L,可见化合物1及苯并呋喃类化合物2、6、7、8为华泽兰根主要抑菌活性成分。     

华泽兰根的化学成分及其体外抑菌活性研究北大核心CSCD

利用硅胶、Sephadex LH-20、HPLC等各种色谱分离技术,从华泽兰根的乙醇提取物中分离得到9个化合物,通过理化性质和NMR波谱数据对它们进行了结构鉴定,分别为:达玛二烯醇乙酸酯(1)、(2R,3S)-5-乙酰基-6-羟基-2-异丙烯基-3-乙氧基苯并二氢呋喃(2)、豆甾醇(3)、邻苯二甲酸二丁酯(4)、12,13-dihydroxyeuparin(5)、5-乙酰-6-羟基-2-异丙烯基苯并呋喃(6)、2,5-二乙酰基-6-羟基苯并呋喃(7)、ruscodibenzofuran(8)、2-乙酰-5-(1-炔丙基)-噻吩-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)。化合物1、2、4和8为首次从该种植物中分离得到,其中2、4和8为首次从该属植物中分离得到。采用牛津杯法评价部分化合物对5种病原菌的抑菌活性,并用肉汤稀释法测定各自的MIC值,结果显示,测试化合物对5种菌具有不同程度的抑菌活性,其中,1、6和8对肺炎克雷伯菌有较强抑菌活性,MIC值分别为0.98、0.98μg/m L和0.49μg/m L,化合物7对大肠埃希菌显示较强抑菌活性(MIC≤3.91μg/m L),化合物1、2、6和7对铜绿假单胞菌有较强抑菌活性,MIC值均为7.81μg/m L,可见化合物1及苯并呋喃类化合物2、6、7、8为华泽兰根主要抑菌活性成分。     

冬虫夏草菌NADPH-细胞色素P450还原酶基因的生物信息学分析

细胞色素P450家族和真菌致病性有关,而细胞色素P450的催化活性又依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶(CPR)提供的电子.为进一步探讨NADPH-CPR基因多样性对冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis侵染寄主的影响,扩增获得2个冬虫夏草菌NADPH-CPR基因,利...