泛素连接酶E3

蛋白质的泛素化修饰具有高度的特异性,它参与调节细胞内许多的生理活动。蛋白质的泛素化修饰涉及一系列的酶参与反应,包括泛素激活酶E1、结合酶E2以及连接酶E3。而其中泛素连接酶E3对靶蛋白的特异性识别起关键作用。泛素连接酶E3主要由HECT结构域家族、RING结构域家族和U-box结构域家族组成。现对泛素连接酶E3的分类、结构及其对靶蛋白的识别机制等进行综述。     

E3泛素连接酶基因CG4911敲除和功能的初步研究

蛋白质的泛素化是一种重要的翻译后修饰过程,参与调控细胞周期、基因转录、信号转导、炎症反应和干细胞的维持等过程。泛素连接酶E3（ubiqutin ligase）是泛素化过程中关键酶。但许多E3基因在发育中的功能和作用机制还不明确。该研究以黑腹果蝇为模式动物,研究泛素连接酶家族一个重要基因CG4911的功能及分子机制。获得CG4911基因敲除果蝇,CG4911敲除果蝇纯合子可活。原位杂交结果显示,CG4911在胚胎发育早期表达。通过构建CG4911-pUAST-3HA重组子转染Hela细胞,确定CG4911定位于细胞质中,其表达并无修饰作用,并且过表达基因CG4911可导致背板发育缺陷。该研究首次获得了CG4911基因敲除果蝇和CG4911转基因果蝇,并初步探索了F-box基因CG4911的功能,为进一步阐明泛素连接酶的功能及分子机制提供了科学依据。     

泛素连接酶和去泛素化酶在帕金森病中的作用

中脑黑质多巴胺能神经元特异性损伤和α突触核蛋白聚集的分子机制是帕金森病（Parkinson’s disease,PD）研究领域亟待解决的问题。蛋白质异常聚集很大程度上是由于泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）功能障碍引起的。蛋白质泛素化由一系列泛素化酶级联反应促进，并受去泛素化酶（deubiquitylases,DUBs）的反向调节。泛素化和去泛素化过程异常导致蛋白质异常聚集和包涵体形成，进而损伤神经元。近来研究报道，蛋白质的泛素化和去泛素化修饰在PD的发病机制中发挥重要作用。E3泛素连接酶促进蛋白质的泛素化，有利于α突触核蛋白的清除、促进多巴胺能神经元的存活、维持线粒体的功能等。DUBs可以去掉底物蛋白质的泛素化修饰，抑制α突触核蛋白的降解，调控线粒体的功能和神经元内铁的稳态。本文以E3泛素连接酶和DUBs为切入点，综述了蛋白质泛素化和去泛素化修饰参与多巴胺能神经元损伤机制的最新研究进展。     

快速高效检测植物体内蛋白泛素化修饰研究方法

UPS参与植物中绝大多数的信号转导通路。其中, 一些激素的受体本身就是E3泛素连接酶, 如茉莉酸(JA)受体COI1和生长素(auxin)受体TIR1都是F-box蛋白, 它们通过特异性介导相应转录抑制子的泛素化降解来传递激素信号, 但对于整个UPS体系而言, 由于技术的限制, 迄今为止仅见少量泛素连接酶与特异性底物间生化机制的报道。用大肠杆菌(Escherichia coli)表达蛋白实施泛素连接酶泛素化修饰底物的体外实验是验证泛素连接酶/底物对的常用方法, 但由于体外实验缺乏某些蛋白必需的转录后修饰, 导致实验结果有时存在假阴性。利用农杆菌注射烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达蛋白的方法, 建立高效的植物体内检测蛋白泛素化系统, 可以快速检测蛋白泛素化, 包括检测泛素连接酶和底物的特异性相互作用、底物蛋白的自身泛素化、泛素连接酶对底物降解的促进作用、26S蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用以及用植物内源表达蛋白进行体外泛素化反应。     

快速高效检测植物体内蛋白泛素化修饰研究方法

UPS参与植物中绝大多数的信号转导通路。其中, 一些激素的受体本身就是E3泛素连接酶, 如茉莉酸(JA)受体COI1和生长素(auxin)受体TIR1都是F-box蛋白, 它们通过特异性介导相应转录抑制子的泛素化降解来传递激素信号, 但对于整个UPS体系而言, 由于技术的限制, 迄今为止仅见少量泛素连接酶与特异性底物间生化机制的报道。用大肠杆菌(Escherichia coli)表达蛋白实施泛素连接酶泛素化修饰底物的体外实验是验证泛素连接酶/底物对的常用方法, 但由于体外实验缺乏某些蛋白必需的转录后修饰, 导致实验结果有时存在假阴性。利用农杆菌注射烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达蛋白的方法, 建立高效的植物体内检测蛋白泛素化系统, 可以快速检测蛋白泛素化, 包括检测泛素连接酶和底物的特异性相互作用、底物蛋白的自身泛素化、泛素连接酶对底物降解的促进作用、26S蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用以及用植物内源表达蛋白进行体外泛素化反应。     

ANKIB1相关泛素结合酶的筛选

含锚蛋白重复和IBR结构域蛋白1（ankyrin repeat and IBR domain containing protein 1,ANKIB1）属于RING-IBR-RING (RBR)蛋白家族,也是该家族中唯一含有泛素结合模体的成员,能促进某些蛋白的泛素化．几乎所有的RBR蛋白都具有泛素连接酶（E3）活性. ANKIB1也被推测为一种E3,但迄今尚未证实．RBR型E3能够与多种泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme,Ubc,统称E2）互作并发挥催化作用,其中最常见的是UbcH7,UbcH8和UbcH5B次之．为了筛选ANKIB1相关的E2,本研究在大肠杆菌BL21 (DE3)中分别表达了UbcH5B、UbcH7和UbcH8蛋白,并采用GST沉降（GST pull-down）实验验证3种E2与ANKIB1的相互作用. 实验结果表明,内源性及过表达的ANKIB1均能与UbcH5B、UbcH7或UbcH8相互作用,同时ANKIB1也是唯一能与这3种E2互作的RBR蛋白．本研究为ANKIB1可能是1种E3的假说提供了支持,并为后续研究ANKIB1的E3活性和催化机制提供了线索．     

泛素连接酶的结构与功能研究进展

泛素化是体内蛋白质翻译后重要修饰之一,是蛋白质降解的信号.泛素连接酶E3是泛素化过程中的关键酶之一,介导活化的泛素从结合酶E2转移到底物,不同的泛素连接酶作用于不同的底物蛋白,决定了泛素化修饰的特异性.根据结构与功能机制的不同,可将泛素连接酶E3分为HECT (homologousto E6AP C terminus)家族和RING-finger家族,前者含有HECT结构域,可直接与泛素连接再将其传递给底物.RING-finger家族的E3发现较晚,庞大且功能复杂,是近年来研究的热点,此家族均包含相似的E2结合结构域和特异的底物结合部分,作为桥梁将活化的泛素从E2直接转移到靶蛋白,其本身并不与泛素发生作用.总结了这2种E3连接酶家族成员的三维结构及功能机制研究的最新进展.     

.HECT类泛素连接酶对p53家族的调控作用

p53家族成员在细胞生长、组织发育及肿瘤形成等方面都具有十分重要的生物学功能,其自身受到严格调控,泛素化修饰就是其中非常重要的方式之一,作为泛素化过程中决定底物特异性的泛素连接酶E3作用则更加突出.泛素连接酶E3可以分为两类：RING（really interesting new gene）类和HECT（homologous to E6AP C-terminus）类E3近年来,HECT类E3对p53家族的调控效应不断得到揭示.本文综述了HECT类E3在调控p53家族转录活性、稳定 性方面的重要作用、分子机制以及其作用对生物体肿瘤形成和生长发育等产生的影响,为进 一步完善p53家族调控网络,揭示HECT类E3在肿瘤发生发展及防治中的作用提供参考.     

泛素化在调控铁死亡中的作用

铁死亡是一种由脂质过氧化驱动的铁依赖性的新的细胞死亡方式,越来越多的证据表明,铁死亡与各种病理状态有关,如神经退行性疾病、糖尿病肾病、癌症等,脂质过氧化驱动的铁死亡可能促进或抑制这些疾病的发生发展,细胞中抗氧化系统通过抑制脂质过氧化在抵抗铁死亡过程中发挥着重要作用。铁死亡的关键通路有以SLC7A11-GPX4为关键分子的氨基酸代谢通路、以铁蛋白或转铁蛋白为主的铁代谢通路,以及脂质代谢通路。铁死亡的发生受到细胞内蛋白质的调节,这些蛋白质会发生各种翻译后修饰,包括泛素化修饰。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）是细胞内主要降解系统之一,通过酶促级联反应催化泛素分子标记待降解蛋白,随后由蛋白酶体识别并降解目标蛋白质。UPS根据其降解底物的不同在调节铁死亡的反应中发挥双重作用。UPS通过促进铁死亡关键分子（如SLC7A11、GPX4、GSH）以及抗氧化系统成分（如NRF2）的泛素化降解从而促进铁死亡,也可以通过促进脂质代谢通路中相关分子（如ACSL4、ALOX15）的泛素化降解从而抑制铁死亡。本综述介绍泛素化修饰在调控铁死亡进程中作用的最新研究进展,总结了已发表的关于E3泛素连接酶和去泛素酶调控铁死亡的研究,归纳了泛素连接酶、去泛素酶调控铁死亡的作用靶点,有助于确定人类疾病中新的预后指标,为这些疾病提供潜在的治疗策略。     

泛素化在植物抗病中的作用

泛素化作为植物体内一种广泛存在的调控细胞反应的机制,参与调控植物抗病反应。本文综述了泛素化系统在植物抗病反应中的功能及作用机制,重点介绍了CRLs型E3泛素连接酶和RING/U-box型E3泛素连接酶如何参与调控植物抗病信号途径,以及病原物通过效应蛋白和毒性因子调控植物抗病性的分子机理,为阐明植物抗病机理和植物病害防治方法提供参考。     

植物泛素结合酶E2功能研究进展

泛素-26S蛋白酶体途径是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径,广泛参与植物生长发育相关过程。该途径中关键酶主要包括泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3),对靶蛋白泛素化起重要作用。在简单概述泛素化过程的基础上,主要对近年来植物E2蛋白在DNA修复、光周期和维管分化调控,缺素及抗逆胁迫响应中的功能进行综述,为今后该蛋白功能的深入研究及木本植物中该功能基因的发掘奠定基础。     

E3泛素连接酶Smurf家族在骨形态发生蛋白和转化生长因子信号转导中的作用

泛素-蛋白酶体降解系统广泛存在于各种真核细胞中,参与调控细胞多种生理进程.作为该系统中行使调控降解功能的核心成员,E3泛素连接酶的重要作用已经越来越引起人们的重视.BMP和TGF-β是骨组织中调控成骨细胞和软骨细胞增殖、分化和凋亡的关键分子,通过不同的信号通路体系调控骨生理代谢,参与骨组织的多种生理进程.最近的研究表明,泛素-蛋白酶体降解系统在骨细胞和骨组织中具有十分重要的作用,E3泛素连接酶Smurf作为这一系统的核心,参与调控骨组织中BMP和TGF-β两个家族的分子信号转导过程.在前期成果的基础上,结合最新的研究进展,系统阐述了骨组织中E3泛素连接酶的发现,及其调控BMP和TGF-β信号通路的机制以及其对成骨细胞和软骨细胞增殖和分化的影响.     

RNF149通过泛素化介导的CD9降解调控细胞增殖

选取功能未知的泛素连接酶RNF149作为研究对象．该分子同GRAIL(gene related to anergy in lymphocytes)具有较高的同源性,属于Ⅰ型跨膜蛋白．激光共聚焦显微镜的观察结果显示,RNF149是一个定位在溶酶体上的蛋白质,它与CD9在细胞内有共定位．免疫共沉淀实验证明RNF149与CD9有相互作用．RNF149通过泛素分子的第48位赖氨酸多泛素化CD9．在HeLa细胞中转染数量一定的CD9质粒和数量梯度增加的RNF149质粒24 h后,蛋白质印迹检测外源RNF149和CD9的表达,结果表明,随外源RNF149表达量梯度增高,外源CD9的表达量梯度降低．在HEK293T细胞内以shRNA敲低内源的RNF149,并检测内源CD9的变化,发现RNF149被敲低后内源CD9的量增多．上述结果提示,CD9很有可能是RNF149的底物,被RNF149通过泛素化降解．此外,RNF149被敲低的HEK293T细胞增殖受到抑制,这可能与其内源CD9的量增多有关,提示RNF149可能是一种细胞增殖的调控因子．     

Mex-3C研究新进展：结合RNA的泛素E3连接酶与染色体不稳定性抑制基因

Mex-3C蛋白（又称RKHD2）具备2个串联重复的KH结构域和1个环指结构域,具备结合RNA的能力,同时也是泛素E3连接酶家族的一员.它可以诱导某些mRNA降解,并且这一过程可以被一种去泛素化酶USP7阻断,据此产生了结合RNA的泛素连接酶的概念并暗示泛素化可能与mRNA降解之间存在某种联系. Mex-3C可能通过利用该特性参与调节某些生理功能.另一方面,结直肠癌细胞MEX3C基因缺陷可以导致染色体不稳定性的产生,由此提出了染色体不稳定性抑制基因的观点.DNA复制应激被证实介导了两者之间的相互作用.本文将从这两个新概念出发介绍Mex-3C现有的研究进展,并指出后续的研究方向.     

重组泛素连接酶tTRIP-U-box的构建与表达

目的：构建重组泛素连接酶tTRIP-U-box,并克隆进入pFLAG—CMV4真核表达载体,为研究通过靶向降解接头蛋白TRAF（TNFReceptorAssociatedFactor）家族蛋白,从而抑制破骨细胞活性提供基础。方法：分别设计引物,扩增tTRIP（TRAF-interactingprotein）分子C端伸展的coiled．coiled结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box结构域,再利用重组PCR,将tTRlP与U-box进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG．CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK-293T细胞系,Western印迹验证重组质粒的表达。结果：PCR结果显示tTRIP截短分子和tTRIP—U-box条带大小分别为660bp和1188bp,重组质粒经酶切鉴定和测序证实正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论：成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4一tTRIP-U—box,并且转染HEK-293T细胞系后证实其能够正确表达。     

泛素连接酶E3介导的植物干旱胁迫反应

干旱胁迫严重影响农作物的产量和质量,制约全球的农业生产。泛素连接酶E3是一个种类繁多的大家族,涉及对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中关键步骤的控制。该文概述了植物干旱胁迫的调控机制和植物的泛素连接酶E3,并着重阐述了泛素连接酶E3介导的植物干旱胁迫反应及其作用机制。     

小鼠和鸡的类E1酶新基因UBAL的克隆和表达分析

根据含有UBA_NADbindingdomain的EST序列,利用同源性序列查找和EST拼接的方法,克隆得到鼠、鸡的新基因UBAL(ubiquitin-activatingenzymelikeprotein),它们都具有泛素活化酶Uba1的保守结构域Ⅰ,可能的ATP结合序列GVGGVG和Cys活性位点.用半定量RT-PCR分析11种成年小鼠组织的mUBAL表达量,显示mUBAL在成年小鼠多种组织中都有表达,在肾、睾丸、脑、心脏中尤为丰富.用mUBAL的编码区为探针进行的小鼠胚胎整体原位杂交显示,mUBAL在胚胎发育早期即开始表达,并随着前内脏内胚层(AVE)的向前迁移而迁移,随后在胚胎的端脑区特异性表达.与小鼠胚胎的表达谱相类似,gUBAL在HH14、HH16和HH18期鸡胚中的表达主要集中在头部.根据mUBAL和gUBAL的序列相似性保守结构域和活性位点,可以初步断定它们可能是类泛素活化酶E1的新成员,可能通过活化类泛素蛋白参与胚胎脑部的发育和调控成体组织的功能.     

人泛素连接酶AREL1催化结构域的晶体结构

泛素化是一种重要的翻译后修饰,几乎调控着生命活动的所有方面.泛素连接酶是泛素化过程中唯一对底物蛋白质有特异性识别能力的一类酶,它们在泛素化过程中是不可或缺的,起到非常关键的作用.人抗凋亡E3泛素连接酶(AREL1)是HECT泛素连接酶家族成员之一,它能够泛素化促凋亡蛋白SMAC、HtrA2和ARTS,并通过蛋白酶体将它们降解,从而发挥抵抗细胞凋亡的作用.本文解析了3.2?分辨率的人AREL1蛋白催化结构域(AREL1^HECT)的晶体结构,并将其与HECT家族中其他成员的结构进行了比对.尺寸排阻色谱和X射线小角散射的结果表明,AREL1^HECT在溶液中是以多种聚集状态形式存在的,小角散射的3D模型进一步表明AREL1^HECT在溶液中会发生二聚化.这些结果将为AREL1^HECT与泛素复合物结构的解析及功能的分析提供坚实的结构基础,为揭示AREL1泛素化底物蛋白质的分子机制提供重要的依据.     

CUL4A作用机制研究进展

Cullin4A (CUL4A)是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)中泛素E3连接酶家族的重要成员之一.UPS是细胞内蛋白降解的重要途径,越来越多的证据表明CUL4A可以通过CUL4A-DDB1-E3途径调节细胞中的一些功能蛋白质,产生相应的作用.本文就CUL4A在基因组的稳定、细胞周期的调控、恶性肿瘤的发生发展、胚胎发育、造血干细胞及脑缺血性损伤等方面的作用进行综述.     

非经典泛素化的研究进展

泛素化是真核生物最普遍最重要的翻译后修饰之一,控制基因转录表达、细胞生长死亡、分子运输、代谢、发育和免疫反应等大多数生理过程。经典泛素系统的通路和机制越来越明晰,同时非经典的泛素化也逐渐被发现。本文将对经典泛素系统进行简单回顾,并且对非蛋白底物泛素化、非赖氨酸位点泛素化、非经典E3泛素连接酶等最新非经典泛素化进行阐述。