利用微束激光穿刺法将菜豆几丁质酶基因导入油菜的研究

利用微束激光穿刺法将菜豆几丁质酶基因导入油菜的研究杨仲毅王兰岚刘志岩张铁汉刘桂珍陈正华（中国科学院遗传研究所,北京,１００１０１）ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＢｅａｎＣｈｉｔｉｎａｓＧｅｎｅｉｎｔｏＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｂｙＬａｓｅｒＭｉｃｒｏｂ...     

一种将外源基因导入植物的新方法：激光微束穿刺法

一种将外源基因导入植物的新方法──激光微束穿刺法王兰岚,周奕华,宋桂英,陈正华（中国科学院遗传所,北京,１００１０１）关键词转基因植物;转化作用;激光微束穿刺法ＡＮＥＷＷＡＹＯＦＦＯＲＥＩＧＮＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＯＦＰＬＡＮＴ—ＬＡＳ...     

利用激光微束穿刺法将外源基因导入小麦的研究

用激光微束穿刺法将携带有新霉素磷酸转移酶（ＮＰＴ－Ⅱ）基因的质粒ｐＪＩＴ１０１导入京花１号小麦幼胚细胞。方法是将小麦幼胚细胞进行高渗缓冲液预处理,用微米级的激光微束处理,然后在卡那霉素培养基上筛选出具抗性的愈伤组织及绿色小植株。第一年,从１５０个小麦幼胚中,在卡那霉素培养基上筛选出４株绿苗,取两株进行ＮＰＴ－Ⅱ酶活性分析,测到了ＮＰＴ－Ⅱ酶的活性。第二年重复实验,从２４５个小麦幼胚中,经筛选获得１株绿苗,进行了叶片ＤＮＡＰＣＲ扩增检测,转化的绿色小苗扩增出所导入的ＮＰＴ－Ⅱ基因编码的片段。结果表明,外源ＮＰＴ－Ⅱ基因已导入了小麦,并实现了整合表达。     

利用激光微束穿刺法将GUS基因导入百脉根并获得转基因植物的研究

利用激光微束穿刺法将ＧＵＳ基因导入百脉根并获得转基因植物的研究周奕华韩厉玲王兰岚宋桂英陈正华（中国科学院遗传研究所北京１００１０１）ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＧＵＳＧｅｎｅｉｎｔｏＬｏｔｕｓａｎｄＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｏｆＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａ...     

利用激光微束穿刺法将杀虫蛋白基因导入油菜的研究

利用激光微束照射油菜子叶柄,将来自苏云金杆菌的杀虫蛋白（Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｃｒｙｓｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ,ＩＣＰ）基因导入油菜细胞中,经植株再生和卡那霉素筛选,获得了转基因植株。对转基因植株进行了ＰＣＲ检测和饲虫实验,发现转基因植株为ＰＣＲ扩增阳性,某些植株表现出了较强的抗虫性。实验结果表明外源抗虫基因已被整合到油菜基因组并得到了表达。     

利用微束激光穿刺法将菜豆几丁质酶基因导入油菜的研究

本文以甘蓝型“双低”油菜新品种Ｈ１６５为实验材料,以子叶柄为外植体,研究了微束激光转化系统中的一些关键因素,如取材时间以播中后４－５天为宜;高渗液预处理２０－４０分钟者最佳;外源ＤＮＡ浓度以０．０５－０．１μｇ／μｌ获得转基因植株最有利等。已建立一种操作简便,重复性好,并能准确定位于靶体细胞的转化体系,并用这个转化体系成功地将菜豆几丁酶基因导入油菜,并获得转基因植株。经ＰＣＲ扩增检测为阳性,实验结     

利用微束激光穿刺法将抗真菌基因导入棉花的研究初报

以棉花感受态萌动种胚作为外源基因转化的受体,用激光微束穿刺法将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶双价基因导入棉花,所构建的植物表达载体pB IBGC携带有筛选标记npt-Ⅱ(新霉素磷酸转移酶)基因。激光转化处理的种胚经卡那霉素筛选,已经获得抗性小植株。研究了微束激光转化法用于棉花感受态萌动胚转化预培养的时间、高渗液对材料的处理等。研究表明:用微束激光转化处理种胚是一种操作简便、重复性好的转化方法,用该法可将外源基因导入植物感受态萌动胚,避开植株离体再生的困难。     

将抗真菌病基因导入马铃薯的研究

实验采用微束激光穿刺技术和农杆菌介导方法,将携带有Ⅰ型烟草β－１,３－葡聚糖酶基因和Ⅰ型菜豆几丁质酶基因的ｐＢＬＧＣ质粒导入马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）品种“津引８号”。微束激光穿刺技术转化中,获得了７株卡那霉素抗性再生苗,分子检测证明,其中有１株为菜豆几丁质酶基因单基因转化植株。在农杆菌介导方法中得到了１３株卡那霉素抗性再生苗,其中有３株为烟草β－１,３－葡聚糖酶基因单基因     

激光微束技术及其在基因转移研究中的应用

本文中介绍了我们设计和安装的一套激光微束系统,该系统分为二部份:激光源和显微镜.工作波长355nm是由电子调Q Nd:YAG激光经KDP倍频和混频后得到的.这束光从显微镜的左边引入45°反射,再经×100物镜聚焦.光束直径小于1μ.这束激光可给细胞打孔,约在1秒内小孔自行修复,在修复之前荧光物质和质粒可以扩散进细胞.我们成功地把GUS基因导入烟草花粉细胞中并得到瞬间表述,还把DAPI-λDNA导入M85胃癌细胞必观察到兰色荧光.从本工作初步表明这种导入方法很有发展前途.     

用激光微束穿刺法转化甘蓝型油菜小孢子的研究

建立了油菜小孢子再生胚状体的实验体系,掌握了受体最佳发育时期,使再生频率高达２１．２个胚状体／花蕾。以油菜游离小孢子为受体,用微束激光穿刺法导入芜菁花叶病毒外壳蛋白基因（ＴｕＭＶ）,成功地获得了转基因植株。研究结果表明,用预培养３天的小孢子进行转化得到的１５个胚状体,再生出一株绿苗,２株白苗。而未经预培养的小孢子未能得到转基因植株。用植物总ＤＮＡ以ＰＣＲ法扩增ＴｕＭＶ基因产物片断,然后进行电泳检测,证明该绿苗带有芜菁花叶病毒外壳蛋白基因。     

花烛无菌苗液体增殖培养的影响因子

以花烛(Anthurium andraeanum Lind.)品种Sonate无菌苗为材料,研究了液体培养条件下不同植物生长调节剂、蔗糖浓度、培养方式等因子对腋芽增殖的影响,并比较了Sonate、Valentino和Julanba 3个品种间腋芽增殖的差异。结果表明:在液体振荡培养条件下,以Nitsch BA0.5mgL-1 KT1.0mgL-1 蔗糖30gL-1为Sonate品种适宜的增殖培养基;在20μmolm-2s-1弱光下培养25d后转至40μmolm-2s-1正常光照下培养,对Sonate品种的增殖效果较好,腋芽诱导数平均可达11.1个,腋芽平均长度为1.4cm。花烛腋芽增殖能力在品种间存在差异,但3个品种均可在以上培养基和光照条件下快速增殖,其中以Sonate和Valentino品种的增殖较快。     

6-BA对红掌组织培养中红叶变异的影响

以红掌盆栽品种‘Avo-Gloria’为试材,以MS＋0.2mg·L^-12,4-D为基本培养基,分别在添加1～10mg·L^-16-BA的10种脱分化培养基上,诱导其叶柄外植体产生愈伤组织;再以MS＋2mg·L^-16-BA＋0.2mg·L^-1 NAA为分化培养基诱导分化不定芽;以MS＋0.2mg·L^-1 NAA为生根培养基,从不定芽获得再生植株。结果显示：（1）在MS＋0.2mg·L^-12,4-D＋8～10mg·L^-16-BA的3种脱分化培养基上可产生9%～10%的绿色、质地较硬的愈伤组织;（2）愈伤组织在MS＋2mg·L^-16-BA＋0.2mg·L^-1 NAA的分化培养基上,经6～8次继代培养,可获得3%～7%的不定芽,并可生根长成再生植株;（3）再生植株定植3个月后,有3%～7%植株出现红叶变异,此红叶可终生表现为红色。     

利用RNA干涉技术及微束激光转化法培育抗病毒马铃薯

针对马铃薯生产中危害严重、分布广泛并且具有强烈协生作用的马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒,开展了抗病毒病的育种研究。采用RT-PCR技术分别克隆了267 bp的编码马铃薯X病毒外壳蛋白(PVX-cp)基因的相对保守区段X和294 bp的编码马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVY-cp)基因的相对保守区段Y两个片段,将其按顺序连接,形成融合基因XY,然后分别将融合基因XY正向和反向插入到载体pHANN IBAL中,得到了载体pH IV,再用NoⅠt对pH IV进行酶切,将产生的大片段插入到载体pART27中,得到同时以PVX-cp基因和PVY-cp基因为靶标的XY的RNA i载体pAR IV。采用微束激光穿刺转化技术转化马铃薯品种Favorita的愈伤组织,得到了14株表型正常的转基因植株,转基因植株的southern b lot分析表明,导入的外源融合基因拷贝数介于2~4之间。攻毒实验表明,其中11株转基因植株对PVX、PVYo以及PVX和PVYo混合侵染均表现免疫,而其它3株的病毒浓度也低于对照。这一结果将为利用RNA i干涉技术开展植物抗多种病毒病的育种提供重要依据,验证了所构建的RNA干涉(RNA interference RNA i)载体具有良好的功能,同时又一次证明微束激光穿刺法是一种有效的遗传转化手段。     

红掌组织培养污染率控制研究(简报)

为解决红掌组织培养过程中污染率较高的问题,就降低组织培养污染率的措施进行了研究。结果表明,在继代培养的固体培养基中加入5～20 mg/L硫酸阿米卡星,污染的培养基表现为无菌状态,试管苗生长正常。     

红掌再生团块和不同愈伤组织衰老指标的比较研究

以愈伤组织再生体系的4种愈伤组织和气生根再生体系的再生团块为材料,测定它们的超氧化物含量、保护酶活性和丙二醛含量等相关衰老生理指标.结果显示:超氧化物含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及过氧化氢酶(CAT)活性均为黄绿愈伤组织最高,金黄愈伤组织和深绿愈伤组织居中、再生团块和褐色愈伤组织较低;总谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性以褐色愈伤组织最高,深绿、金黄和黄绿愈伤组织次之,再生团块最低;丙二醛(MDA)含量以金黄愈伤组织最高,褐色、黄绿和深绿愈伤组织次之,再生团块最低.研究表明,再生团块的保护酶活性、超氧化物含量和MDA含量均比4种愈伤组织低,其细胞膜脂过氧化程度最低,而抗氧损伤的能力更强;再生团块的抗衰老能力最强,其次为分化能力较强的黄绿愈伤组织,而分化能力较差的深绿愈伤组织、金黄愈伤组织和褐色愈伤组织的抗衰老能力较弱;利用气生根再生团块建立的快繁体系比用愈伤组织建立的快繁体系分化能力强、不易衰老,更具优越性.     

转BmK IT4基因烟草的抗虫性

用酶切方法从「ｐＢＳ－ＢｍＫ ＩＴ４质粒中获得ＢｍＫ ＩＴ４基因片段,并构建ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子下的ＢｍＫ ＩＴ４基因表达质粒ｐＥ３－ＢｍＫ ＩＴ４,以根癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）介导的叶盘法转化云烟（Ｎｉｃｏ－ｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）Ｋ３２６叶片,获得４５株抗卡那霉素的再生植株。用这些再生植株进行抗虫