立克次体病的检疫和诊断(续二)

<正> (三)血清学鉴别诊断 血清学是鉴别诊断细菌、病毒、立克次体等微生物及其疾病的重要力法。熟练而准确地运用血清学技术才能做出正确、可靠的实验诊断。应用于立克次体和立克次体病的血清学诊断方法很多,最常用的有:补体结合试验、立克次体凝集及外斐氏凝集试验、间接血凝和反相血凝及其抑制试验、中和试验等。近年来免疫萤光抗体染色、酶免疫吸附及细胞免疫试验也常被采用。本文着重立克次体学上最常用的几种方法做一介绍。 血清学诊断的基本原则:(1)是应用已知的某种病原体或抗原去测知未知抗体的存在和滴度,以确定系由何种病原体而感染。当人或动物被某种病原体感染后,常在患者     

重庆市斑疹伤寒病原体的分离

本文报告1963年3—4月份重庆市某单位斑疹伤寒流行当中,从4例典型病人分离出3株立克次体。该3株立克次体不适应于鸡胚而能使豚鼠产生典型的发热反应,发烧期间多数感染豚鼠出现轻微的暂时性阴囊反应,并在睾丸涂片中查到少量的典型立克次体,感染豚鼠的血清补体结合试验,普氏滴度高于莫氏2倍以上,证明这3株病原系普氏立克次体。除此,由病人体虱戚染豚鼠试验,亦证明体虱确携带了普氏立克灰体。由此说明重庆市此次所发生的斑疹伤寒确系流行性斑疹伤寒。     

斑点热群新疆立克次体对宿主细胞感染过程的形态学研究

对新疆立克次体(精河株,下同)感染体外培养的人胚肾传代细胞(简写MERN)和体内鸡胚卵黄囊膜细胞的标本进行了电镜观察。发现立克次体以宿主细胞膜内翻形式进入宿主细胞,在胞浆和胞核内寄生,以二分裂方式增殖;并能察见多个立克次体的链状结构;胞浆内的菌体以核膜内翻方式进入核内,以密集成丛或散在方式生长;在感染后第5—8天的MERN中,立克次体以出芽方式释放,在第8天后通过宿主细胞解体方式释放。文中讨论了新疆立克次体感染宿主细胞过程中的有关机制。我们还发现在宿主细胞内立克次体的附近有直径为20—23nm的微管结构,其功能待深入研究。     

HAV病毒液的3种浓缩方法比较

目的:对HAV病毒液的3种常见浓缩方法进行分析比较,为HAV病毒研究及规模化疫苗生产提供参考。方法:使用MILLIPORE PELLICON超滤、PEG 6000沉淀、蔗糖-甘油垫三种方法对纯化HAV病毒液进行浓缩,用ELISA方法对浓缩液进行抗原滴度检测,计算不同浓缩方法的回收率。结果:HAV病毒液经过7次超滤循环浓缩,平均回收率为86%;PEG浓缩方法回收率平均72.5%;蔗糖-甘油离心浓缩方法平均回收率53.3%。结论:蔗糖/甘油超离心法,集纯化浓缩一体,适用于样品量较少,需要高浓度样品的试验;PEG浓缩得率适中,操作简单,应用范围较广;超滤膜浓缩在大规模疫苗生产或样品量较大时适用,但需控制样品浓度及浓缩倍数不能太高,以免样品损失。     

HAV病毒液的3种浓缩方法比较

目的：对HAV病毒液的3种常见浓缩方法进行分析比较,为HAV病毒研究及规模化疫苗生产提供参考。方法：使用MILLIPOREPELLICON超滤、PEG6000沉淀、蔗糖．甘油垫三种方法对纯化HAV病毒液进行浓缩,用ELISA方法对浓缩液进行抗原滴度检测,计算不同浓缩方法的回收率。结果：HAV病毒液经过7次超滤循环浓缩,平均回收率为86％;PEG浓缩方法回收率平均72．5％;蔗糖．甘油离心浓缩方法平均回收率53．3％。结论：蔗糖／甘油超离心法,集纯化浓缩一体,适用于样品量较少,需要高浓度样品的试验;PEG浓缩得率适中,操作简单,应用范围较广;超滤膜浓缩在大规模疫苗生产或样品量较大时适用,但需控制样品浓度及浓缩倍数不能太高。以免样品损失。     

纯化乙型脑炎疫苗的研制

将乙脑P3毒株接种地鼠肾细胞,制备病毒原液,经灭活、浓缩、层析纯化后收集抗原,再经除菌、配制,制备乙脑纯化疫苗。结果表明：病毒浓缩液经纯化后,杂蛋白去除率大于99％,牛血清蛋白残留量也明显降低;纯化疫苗主要指标检定均达到预期效果;效力试验结果显示当纯化原液蛋白含量稀释至15μg/ml时,疫苗效力符合要求。     

精河株斑点热立克次体在非洲钝缘蜱体内的分布

本文报告用乙二醇甲基丙烯酸(GMA)包埋、切片和姬姆萨染色观察精河株斑点热立克次体在非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)体内的分布情况。接种立克次体后2天,即可从蜱的血淋巴涂片中查见立克次体,但各器官和组织的切片6天后才开始出现阳性,尤以中肠最迟。叮咬感染的蜱的中肠感染较早也较严重。无论接种或叮咬感染,除睾丸和精子外,所查的器官和组织包括涎腺、基节器、中肠、直肠、卵巢以及雄蜱的附腺和贮精囊等切片中都查见立克次体。有的蜱感染很严重,立克次体充满了许多器官和组织的细胞。     

以豆腐柴叶为原料提取果胶工艺研究

本文开发了一条从豆腐柴叶中提取果胶的新工艺。该工艺中,树脂吸附纯化、超滤浓缩和喷雾干燥是三个重要的单元操作。为了确定最佳提取条件和考察树脂吸附纯化和超滤浓缩两个单元操作的商业应用可行性,进行了三种不同规模的试验。结果表明,所开发的工艺在能耗和果胶质量方面明显优于传统的醇沉淀法。     

Vero细胞狂犬病疫苗在凝胶柱层析工艺中样品浓度对纯化效果的影响

为研究浓缩Vero细胞狂犬病疫苗蛋白浓度对纯化效果的影响。用超滤浓缩法对狂犬病疫苗进行不同倍数的超滤浓缩,将浓缩后不同倍数的样品分别用凝胶柱层析法进行纯化,结果样品浓度在40mg/ml以下时,狂犬病毒收集液中杂蛋白去除率可达99%以上,小牛血清含量在25-37.5ng/ml之间;浓缩超过40mg/ml时,并随着样品浓度的增加,狂犬病毒收集液中杂蛋白去除率逐渐下降,且有病毒丢失,因此采用凝胶柱层析法纯化狂犬病疫苗,蛋白浓度应低于40mg/ml。     

狂犬病疫苗蔗糖密度梯度离心纯化工艺开发

目的:开发冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的连续流蔗糖密度梯度离心纯化工艺。方法:分别比较两种不同初始蔗糖浓度和不同上样速度对纯化效果的影响,初步确定纯化工艺;通过多批次实验确定样品收集范围;比较不同浓缩倍数条件下杂质去除和抗原回收情况,确定合适的收获液浓缩比例;比较不同批次样品纯化后的杂质去除率和重复性,判定本纯化工艺的稳定性。结果:选取60%作为初始蔗糖浓度,在上样速度为150～200ml/min时,可以有效地对10倍浓缩的病毒收获液进行纯化;卵清蛋白、牛血清白蛋白和庆大霉素去除率分别达到99%,95%和95%,且工艺具有极好的稳定性。结论:开发的连续流蔗糖密度梯度离心技术可以作为冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的产业化纯化工艺。     

人β-干扰素粗制品的浓缩与纯化

本文报道了采用Millipore超滤膜浓缩人β-干扰素粗制品,滤速快,活性回收率高,同时又具有一定的纯化作用。浓缩后的干扰素样品,再经过一次蓝色葡聚糖——Sepharose CL-6B柱层析,可将其纯化2800倍,特异活性可达10⁶μ／mg蛋白以上的国际临床标准。     

脊髓灰质炎减毒活疫苗的高效纯化及特性研究

应用Q-Sepharose Fast Flow对Vero细胞基质制备的I型口服脊髓灰质炎减毒活疫苗悬液进行纯化.病毒液经滤过澄清和超滤浓缩,获得85%的病毒感染性滴度回收率,而经Q-Sepharose F.F.纯化的病毒悬液,病毒感染性滴度回收率达100%.纯化后的病毒液用α-32P dATP标记DNA探针膜杂交法测定,宿主Vero细胞基质DNA残余含量远低于100 pg/剂量的标准;rct/40特征、病毒形态及病毒衣壳蛋白组份等生物学性状无显著变化.研究结果提示,Q-Sepharose F.F.是Vero细胞制备口服脊髓灰质炎减毒疫苗的理想纯化材料.     

非洲钝缘蜱感染Q热立克次体敏感度的测定

Q热立克次体以10^-1—10^-12不同稀释度,用血腔注射法感染非洲钝缘蜱,感染35天,取蜱血淋巴液,分别用Gimenez染色法及免疫荧光技术检查,在10^-1—10^-5的稀释度,两种方法检出率基本相似。10^-6以下各组,免疫荧光尚可检出少数阳性标本,而Gimcnez法则无阳性,前者总阳性率为48.28%,后者为40.68%。感染的蜱悬液接种豚鼠,12组动物血清做Q热补体结合试验全部阳性。动物发病情况如潜伏期长短、发烧天数等似与蜱内立克次体的含量有关。     

粗制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺的建立

分别用Sepharose 4B、Sephacryl-200HR和Sepharose6-Fast flow柱色谱进行地鼠肾细胞狂犬疫苗浓缩原液纯化试验,试制精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗。对疫苗的残余牛血清含量、效力、收获率和安全性进行检测,优化和建立了精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺。     

发热伴血小板减少综合征病毒灭活病毒的纯化及免疫原性初步研究

为了解纯化后灭活发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的免疫原性,本研究通过超滤浓缩和分子筛层析相结合的方法对灭活的SFTSV进行纯化,采用Western blot和SDS-PAGE对灭活病毒的纯化样品进行分析和鉴定,采用双抗夹心ELISA方法对其中糖蛋白(Glycoprotein,GP)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)的抗原含量进行检测。浓缩纯化的SFTSV灭活病毒,经电镜观察并通过BCA法测定其总蛋白浓度。然后,将纯化的灭活SFTSV按两种不同的免疫程序免疫新西兰兔,评价免疫原性和比较免疫效果。结果显示,SFTSV灭活并超滤浓缩后,分子筛层析可观察到两个洗脱峰,其中之一为灭活病毒颗粒,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法分析均可检测到GP和NP抗原,而另一洗脱峰主要成分则为NP。浓缩后的纯化病毒纯度达90%以上,总蛋白浓度约为1.1mg/mL,且具有典型的布尼亚病毒电镜形态。纯化的SFTSV灭活病毒免疫实验动物后,可在血清中检出高滴度病毒特异性IgG和中和抗体,但抗体滴度受免疫程序的影响,0d、14d和28d天三针程序免疫动物的效果明显优于0d、7d和28d免疫程序组。本研究显示了灭活SFTSV培养液中除完整病毒颗粒外,还含有大量游离的NP,经分子筛层析纯化可获得高纯度灭活病毒,同时明确了纯化的SFTSV灭活病毒具有良好的免疫原性,可诱导产生高滴度中和抗体和病毒特异IgG抗体,可为灭活病毒疫苗的进一步研究提供重要的线索。     

气相色谱-质谱法对斑点热群立克次体

本文报告应用气相色谱-质谱法分析了13株斑点热群立克欢体(7株中国分离株和6株国际标准株）泛影葡胺密度梯度离心纯化物的全细胞脂肪酸成分。结果表明,各被检测的立克次体株所含主要脂肪酸成分百分含量有区别,所得色谱图经多兀聚类法处埋的7株中国分离株与国际标准株中的西伯利亚立克次体相近,而与其它国际标准株则有明显区别。     

精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺的建立

分别用Srpharose4B、Sephacryl-200HR和Sepharose6-Fastflow柱色谱进行地鼠肾细胞狂犬病疫苗浓缩原液纯化试验,试制精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗.对疫苗的残余牛血清含量、效力、收获率和安全性进行检测,优化和建立了精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺.     

《微生物与感染》稿约

<正>本刊重点介绍国内、外微生物学基础与临床相结合的研究成果和新进展,主要内容涉及与人类、动物和植物感染有关的微生物如病毒、细菌、真菌、立克次体、螺旋体、     

快速纯化重组腺联病毒的受体结合捕捉方法

【目的】建立用于重组腺联病毒(AAV)纯化的受体结合捕捉方法。【方法】将AAV受体的多囊肾病(PKD)结构域1和2与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,利用相变循环(ITC)纯化ELP-PKD融合蛋白;分别用昆虫和AAV-293细胞制备rAAV-GFP,与ELP-PKD融合蛋白共孵育后进行ITC,从沉淀复合物提取病毒DNA进行PCR检测;在优化条件下利用ELP-PKD蛋白结合捕捉rAAV-GFP,利用电子显微镜观察、免疫转印和细胞感染试验进行rAAV鉴定。【结果】ELP-PKD融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC纯化的蛋白纯度大于90%;ELP-PKD蛋白能特异结合rAAV-GFP,结合具有p H、温度和时间依赖性,受体结合捕捉方法可在1h内完成,从两种细胞纯化rAAV-GFP的回收率分别为58%和56%;rAAV-GFP洗脱具有p H和温度依赖性,洗脱rAAV-GFP的回收率分别为46%和44%;纯化rAAV-GFP具有AAV的典型形态和结构蛋白。【结论】建立的ELP-PKD结合捕捉法可用于不同细胞源rAAV的快速纯化。     

快速纯化重组腺联病毒的受体结合捕捉方法（英文）

【目的】建立用于重组腺联病毒(AAV)纯化的受体结合捕捉方法。【方法】将AAV受体的多囊肾病(PKD)结构域1和2与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,利用相变循环(ITC)纯化ELP-PKD融合蛋白;分别用昆虫和AAV-293细胞制备rAAV-GFP,与ELP-PKD融合蛋白共孵育后进行ITC,从沉淀复合物提取病毒DNA进行PCR检测;在优化条件下利用ELP-PKD蛋白结合捕捉rAAV-GFP,利用电子显微镜观察、免疫转印和细胞感染试验进行rAAV鉴定。【结果】ELP-PKD融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC纯化的蛋白纯度大于90%;ELP-PKD蛋白能特异结合rAAV-GFP,结合具有p H、温度和时间依赖性,受体结合捕捉方法可在1h内完成,从两种细胞纯化rAAV-GFP的回收率分别为58%和56%;rAAV-GFP洗脱具有p H和温度依赖性,洗脱rAAV-GFP的回收率分别为46%和44%;纯化rAAV-GFP具有AAV的典型形态和结构蛋白。【结论】建立的ELP-PKD结合捕捉法可用于不同细胞源rAAV的快速纯化。