胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C端片段除“工”字肽的免疫活力比A链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N端区域比C端重要。同样,B链可能比A链重要。     

胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N 端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C 端片段除“工”字肽的免疫活力比A 链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A 链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N 端区域比C 端重要。同样,B 链可能比A 链重要。     

胰岛素作用原理的研究——Ⅰ.胰岛素及其类似物与其受体的相互作用

研究了一些胰岛素B链羧端肽段改变了的类似物与肝细胞及脂肪细胞的受体蛋白结合性质。这些结果说明,去B链羧端五肽胰岛素与胰岛素有相同的结合能力;去B链羧端六肽胰岛素及B_(23)被D-丙氨酸取代的去B链羧端六肽胰岛素有明显的结合;去B链羧端八肽胰岛素具极微的结合能力;胰岛素A链、促肾上腺皮质素、增血糖素不与胰岛素受体蛋白结合。在此基础上还讨论了B_(24)芳香环参与胰岛素结合部位的可能性,并假设B_(12),B_(16),B_(24),B_(25)疏水平面可能是结合部位的重要内容。而B_(20)～B_(23)U形转折及A_(21)…B_(22)盐键的作用是稳定疏水平面结构。胰岛素与受体的结合类似于胰岛素二体中两个单体的结合。     

B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素晶体结构的分子置换法研究

以B链羧端去五肽胰岛素(DPI)结构为模型,应用分子置换法对B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素(DesB1～2DPI)晶体结构进行了研究.DesB1～2DPI晶体单位晶胞中每个结晶学不对称单位包含1个DesB1～2DPI分子.交叉旋转函数和平移函数搜索均找到了明显突出的峰,确定了DesB1～2DPI分子在晶胞中的取向和位置.进一步的三维模型重建和结构精化结果巩固了DesB1～2DPI的分子置换法研究的正确性.     

B链羧端去七肽(B24～B30)胰岛素:一种新晶型的结构

B链羧端去七肽 (B2 4～B30 )胰岛素 (DHPI)在同样的晶体生长条件下可以得到两种晶型 ,即晶型A和晶型B .测定了 0 .2nm分辨率B型DHPI(DHPI B)的晶体结构 .B型DHPI分子的整体结构与已报道的A型DHPI分子 (DHPI A)很相似 ,但局部区域的构象以及分子在晶胞中的堆积存在较大的差异 .DHPI的晶体结构显示了 ,在结晶条件下 ,一个独立区内 2个DHPI单体分子构成了一个DHPI二体 .DHPI A和DHPI B因二体形成而包埋的作用面 (作用面Ⅱ )面积分别达到 1 8.2 0和 1 6 .95nm2 ,这一面积在目前所有胰岛素及其类似物的晶体结构中是最大的 .仔细考察胰岛素及其截断体类似物的晶体结构可以发现 ,该作用面广泛存在于这些分子的缔合作用中 .研究结果表明 ,作用面Ⅱ在同一晶体生长条件下 2种晶型的形成中起关键作用 .     

去B链羧端九肽胰岛素的制备和性质

去B链C端八肽胰岛素(DOI)经羧肽酶B作用除去B_(22)-精氨酸,产物经SP-SephadexC25分离以后得到电泳均一的去B链C端九肽胰岛素(DNI)。从CD光谱可以看出,在水溶液中DNI的构象比DOI更松散。DNI与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合能力很低,但却比DOI高一些。     

去七肽胰岛素的分子动力学研究

本文用分子动力学的方法对去七肽胰岛素(DHPI)分子的构象进行了研究,首先用分子动力学方法对晶体胰岛素分子的构象能进行了优化,然后除去B链C端的最后七个残基(B24—B30),做分子动力学模拟,得到了DHPI的平衡构象和均方差波动。胰岛素分子的X射线晶体衍射结构和能量优化构象之间的均方根偏差为0.1;所得DHPI构象和胰岛素能量优化构象间C原子间的均方根偏差为1.8。变化最大的区域是A8—A10,A18—A21,B1—B41和B18—B23。     

去B链羧端七肽胰岛素的免疫活性及受体结合能力

测定了胰岛素类似物去B链羧端七肽胰岛素(DHPI)的免疫活性和它与受体的结合能力。DHPI能与豚鼠抗胰岛素血清反应,生成免疫沉淀条纹。经放射免疫测定,它的免疫活力是胰岛素的1.8%。DHPI在低剂量时不能和胰岛素受体(大白鼠脂肪细胞和豚鼠红细胞)结合,高剂量时有明显结合。DHPI与豚鼠红细胞胰岛素受体的结合不显示负协同效应,而胰岛素与它的结合显示负协同效应。     

去B链羧端七肽胰岛素的免疫活性及受体结合能力

测定了胰岛素类似物去B 链羧端七肽胰岛素(DHPI)的免疫活性和它与受体的结合能力。DHPI 能与豚鼠抗胰岛素血清反应,生成免疫沉淀条纹。经放射免疫测定,它的免疫活力是胰岛素的1.8%。DHPI 在低剂量时不能和胰岛素受体(大白鼠脂肪细胞和豚鼠红细胞)结合,高剂量时有明显结合。DHPI 与豚鼠红细胞胰岛素受体的结合不显示负协同效应,而胰岛素与它的结合显示负协同效应。     

去B链C端五肽胰岛素类似物的制备和性质

A_1B_(29)-(MSC)_2胰岛素经胃蛋白酶限制性地水解得A_1-(MSC)-DPI。通过Edman降解方法,从A_1-(MSC)-DPI制备了B链N端缩短的DPI类似物,即:去B_1(Phe)-DPI,去B_(1-2)(Phe Val)-DPI和去B_(1-3)(Phe Val Asn)-DPI。本文还叙述了它们的生物活力。     

B链C端去七肽(B24～B30)胰岛素的分子置换法

一个几近失活的胰岛素类似物———B链C端去七肽 (B2 4～B30 )胰岛素(DHPI)已被结晶 .该晶体属于空间群P2 ₁2 ₁2 ₁,晶胞的 1个独立区内包含有 2个DHPI分子 .应用分子置换法确定了DHPI分子在晶胞中的取向和位置 ,并在 0 .3nm分辨率水平上构建了结构模型 .研究结果表明 ,一个独立区内的 2个DHPI单体分子由一个非晶体学 2次轴联系着 ,该局部 2次轴近似平行于晶体学c轴 .这一特性直接影响了自身旋转函数对该局部对称轴取向的确定     

胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。     

胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。     

胰岛素类似物的直线聚合

与胰岛素相似,去B链羧端五肽胰岛素(DPI)及去B链羧端八肽胰岛素(DOI)的酸性溶液于沸水浴中加热,会转变成粘度很高的溶液,该溶液具有流动双折射性质。于电子显微镜下观察,看到该两种类似物的纤维。这些纤维与胰岛素纤维相似,经常由几根微丝绞合成螺旋状。微丝的直径大约是30,与胰岛素微丝的直径相当。上述现象说明,这些类似物的直线聚合过程与胰岛素者是类同的。因此胰岛素B链羧端肽段并非胰岛素直线聚合所必须。     

胰岛素类似物的直线聚合

与胰岛素相似,去B 链羧端五肽胰岛素(DPI)及去B 链羧端八肽胰岛素(DOI)的酸性溶液于沸水浴中加热,会转变成粘度很高的溶液,该溶液具有流动双折射性质。于电子显微镜下观察,看到该两种类似物的纤维。这些纤维与胰岛素纤维相似,经常由几根微丝绞合成螺旋状。微丝的直径大约是30(?),与胰岛素微丝的直径相当。上述现象说明,这些类似物的直线聚合过程与胰岛素者是类同的。因此胰岛素B 链羧端肽段并非胰岛素直线聚合所必须。     

胰岛素B_(29)-赖氨酸侧链修饰对其与胰岛素抗体结合的影响

本文报道了若干胰岛素B_(29)-赖氨酸侧链氨基修饰的胰岛素衍生物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明B_(29)的侧链氨基用各种不同类型的基团取代后其与胰岛素抗血清的结合能力没有明显变化或有所下降。当两个胰岛素分子的B_(29)-赖氨酸的侧链氨基通过己二酰交联形成二聚体后,其与胰岛素抗体结合力约为胰岛素的38.5±4.9%。     

胰岛素结构与功能关系的研究——Ⅳ.B_(22)-精氨酸的改变对胰岛素生物活性的影响

本文叙述了一系列B_(22)-精氨酸改变的B_(23)-D-Ala去B链羧端六肽胰岛素类似物的半合成。半合成途径是胰岛素六甲酯(INS-OMe)经胰蛋白酶和羧肽酶B作用得到去B链羧端九肽胰岛素五甲酯OMe-(DNIOH),A_1和B_1的α-氨基用Boc-基保护后与X-D-Ala·PheOMe(X=Gly,D-Arg,Val,Arg,Boc-Lys和OTB-Asp)缩合,三氟乙酸和皂化去除所有的保护基。这些类似物的生物活力表明;B_(22)-Arg并非不能改变,它用Lys甚至Asp代替后,不影响活力,活力水平约为天然胰岛素的20%。当B_(22)-Arg用Val代替后活力降低一半,而用Gly或D-Arg代替后,活力很低。文中对B_(22)-Arg在维持胰岛素构象和对胰岛素生物活力的影响以及豚鼠胰岛素活力低的原因等问题进行了讨论。     

去五肽胰岛素晶体生长的进一步探索及某些晶体学观察

用重结晶法得到了去B链羧端五肽胰岛素(DPI)单斜晶系C2空间群的大单晶。该晶体有两个优点:(1)生成的大晶体是单晶而不是双晶,所以不需要在使用前切割双晶,从而避免了晶体的损伤。(2)衍射能力强,可以得到重原子衍生物的好的反常散射数据。对DPI的原料进行了一系列的生化分析,发现DPI原料中有一定量的去六肽胰岛素,这可能是影响晶体生长的原因。经纯化后的DPI制剂可用重结晶法获得适合于X射线衍射用的单晶。     

去五肽胰岛素晶体生长的进一步探索及某些晶体学观察

用重结晶法得到了去B链羧端五肽胰岛素(DPI)单斜晶系C2空间群的大单晶。该晶体有两个优点:(1)生成的大晶体是单晶而不是双晶,所以不需要在使用前切割双晶,从而避免了晶体的损伤。(2)衍射能力强,可以得到重原子衍生物的好的反常散射数据。对DPI 的原料进行了一系列的生化分析,发现DPI 原料中有一定量的去六肽胰岛素,这可能是影响晶体生长的原因。经纯化后的DPI 制剂可用重结晶法获得适合于X 射线衍射用的单晶。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究 Ⅴ.用萤光探针1,8-TNS对疏水区的初步研究

1,8-TNS与溶剂极性和粘度关系的研究,证明正如它们的位置异构物2,6-TNS一样具有萤光疏水探针的性能。我们用此探针比较研究了胰岛素、去B链羧端五肽胰岛素(DPI)、牛血浆白蛋白、溶菌酶、卵白蛋白的疏水表面性质。结果表明DPI和胰岛素相似,存在一个小而确定的疏水区。提示B链羧端五肽的去除并未严重改变其与受体结合有关的疏水面结构。在生理pH值其疏水面暴露较胰岛素略大。但其疏水面构象稳定性较胰岛素弱,随pH升高,分子局部构象可能发生扭动,疏水面构象遭到一定程度的破坏。总的来讲,DPI结构较胰岛素松散,稳定性亦下降。