ATP功能及固氮酶催化机理

一、引言固氮酶能够催化N_2及其它底物(N~-_3、N_2O,C_2H_2,HCN,RCN,RNC,H~ ,丙二烯、环丙烯)的还原反应,ATP水解反应以及Na_2S_2O_4氧化反应。固氮酶究竟是钼铁蛋白,还是由钼铁蛋白     

Na_2MoO_4KBH_4系统模拟固氮酶催化反应的研究

本文报导了以Na_2MoO_4-KBH_4系统模拟固氮酶催化反应的研究工作。钼酸钠是一种最简单的钼的无机化合物。在硼氢化钾存在的情况下,钼酸钠就能催化乙炔还原为乙烯的反应。以反应初速度计,其比活达4.1moleC_2H_4/分·mole Mo,约为固氮酶活性的1%。米氏常数为0.77大气压、2.78×10~(-2)M。表观活化能为6.5千卡/克分子。处于活性状态的钼不是单核的,而可能是双核的。虽然乙炔还原的产物除乙烯外还有乙烷生成,但乙烯不能作为反应底物被还原。乙炔还原为乙烯和乙炔还原为乙烷的反应二者不相关。它们是由不同的活性钼络合物所催化。以20种不同的可作为钼的配位体的有机化合物对Na_2MoO_4-KBH_4系统乙炔还原催化反应的影响在相同条件下进行比较,可以看到一些有趣的规律。α、α′-二巯基己二酸-Na_2MoO_4-KBH_4系统的催化活性最高。二巯基乙烷-Na_2MoO_4-KBH_4系统只表现催化乙炔还原为乙烯的活性,反应产物中只有乙烯而没有乙烷或其他产物生成。象固氮酶一样,Na_2MoO_4-KBH_4系统还具有催化乙腈还原的活性。在相同条件下用钨代替钼,无论Na_2WO_4-KBH_4系统还是半胱氨酸-Na_2MoO_4-KBH_4系统都不表现催化乙炔还原为乙烯的活性。解释了含钨的固氮酶无反应活性的原因。同时还解释了在含钨的固氮酶及其他含钨的“钼”酶中钨不能与相应的蛋白有效地结合这一现象。本文还就Na_2MoO_4-KBH_4固氮酶模型系统的作用,反应规律,以及配位体和不同配位基团的作用等进行了讨论,并对当前通过模型系统来研究固氮酶的结构与功能的工作中的一些问题提出了作者的看法。     

Na_2MoO_4-KBH_4系统模拟固氮酶催化反应的研究

本文报导了以Na_2MoO_4-KBH_4系统模拟固氮酶催化反应的研究工作。钼酸钠是一种最简单的钼的无机化合物。在硼氢化钾存在的情况下,钼酸钠就能催化乙炔还原为乙烯的反应。以反应初速度计,其比活达4.1mole C_2H_4/分·mole Mo,约为固氮酶活性的1%。米氏常数为0.77大气压、2.78×10~(-2)M。表观活化能为6.5千卡/克分子。处于活性状态的钼不是单核的,而可能是双核的。虽然乙炔还原的产物除乙烯外还有乙烷生成,但乙烯不能作为反应底物被还原。乙炔还原为乙烯和乙炔还原为乙烷的反应二者不相关。它们是由不同的活性钼络合物所催化。以20种不同的可作为钼的配位体的有机化合物对Na_2MoO_4-KBH_4系统乙炔还原催化反应的影响在相同条件下进行比较,可以看到一些有趣的规律。α、α′-二巯基己二酸-Na_2MoO_4-KBH_4系统的催化活性最高。二巯基乙烷-Na_2MoO_4-KBH_4系统只表现催化乙炔还原为乙烯的活性,反应产物中只有乙烯而没有乙烷或其他产物生成。象固氮酶一样,Na_MoO_4-KBH_4系统还具有催化乙腈还原的活性。在相同条件下用钨代替钼,无论Na_2WO_4-KBH_4系统还是半胱氨酸-Na_2MoO_4-KBH_4系统部不表现催化乙炔还原为乙烯的活性。解释了含钨的固氮酶无反应潘性的原因。同时还解释了在含钨的同氮酶及其他含钨的“钼”酶中钨不能与相应的蛋白有效地结合这一现象。本文还就Na_2MoO_4-KBH_4同氮酶模型系统的作用,反应规律,以及配位体和不同配位基团的作用等进行了讨论,并对当前通过模型系统来研究固氮酶的结构与功能的工作中的一些问题提出了作者的看法。     

Mo-s结构在含钼酶中的作用——含钼酶模型研究

微量元素钼,在许多氧化还原酶的活性中,起很重要的作用。目前已知有固氮酶、NADH脱氢酶、硝酸还原酶、亚硫酸氧化酶、醛氧化酶、黄嘌呤脱氢酶、黄嘌呤氧化酶等七种含钼酶,它们的共同特点是分子量大,底物专一性差,转换率低。除了酶蛋白以外,还含有其它辅基成分,每分子含1—2个钼原子,金属铁或细胞色素b和黄素。 Schrauzer的钼一半胱氨酸络合物(图1),能够模拟固氮酶的许多功能,我们曾利用它作为固氮酶模型,探讨固氮酶反应中ATP和Fe-S原子簇的作用,初步认为Mo-SH结构参与固氮酶的活性中心,Fe-S原子簇与电子     

钼,铁,硫化合物激活曝氧的棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白的研究

曝氧后,棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白的催化活性和圆二色信号都显著降低,而吸收光谱则显著增加。与钼、铁、硫化合物和二硫苏糖醇组成的重组溶液保温后,曝氢蛋白的圆二色信号和吸收光谱几乎完全恢复至天然状态的同时,乙炔还原活性也得到了显著的恢复,表明重组溶液可使曝氧蛋白中的 P-cluster和其它活性部位都得到了不同程度的修复。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白特性的研究(三)

应用亚铁螯合剂研究了棕色固氮菌固氮酶铁蛋白中Fe_4S4_簇与Mg·ATP的关系。未变性铁蛋白与螯合剂无反应。Mg·ATP和PCMB促进铁蛋白中的铁与螯合剂的反应。Mg·ADP抑制Mg·ATP的作用。加入Mg·ATP或PCMB后1小时内有75％以上的铁被螯合,20小时内几乎全部被螯合(97％以上)。单独的ATP,ADP,Mg~( )无作用。氧钝化铁蛋白中铁能直接与螯合剂反应,Mg·ATP或PCMB浓度与反应速度的关系符合S型动力学。用Hill作图法得到斜率的为2,说明在铁被螯合前Fe_4S_4簇上(或附近)的两个位置已参与反应。Brdicka反应和羟甲基化作用结果表明钼铁蛋白与铁蛋白巯基二者的相互作用。     

固氮酶催化还原C_2H_2和N_2的探讨

自从Dilworth等发现固氮酶对C_2H_2的还原活性以来,用乙炔还原法研究生物固氮作用的文献大大超过~(15)N示踪的方法,这可能是前一方法更灵敏简便.近年来化学模拟生物固氮研究也把催化乙炔还原为乙烯的反应作为固氮酶活性中心模拟物络合活化底物的一种判据,依其还原活性的大小推测模型物与固氮酶活性中心的相似程度,用以指导模型物的合成.然而,固氮酶对乙炔的还原活性是否完全     

固氮酶钼铁蛋白铁钼辅因子的抽提研究进展

固氮酶由两种铁硫蛋白(钼铁蛋白和铁蛋白)组成。由还原剂提供电子经铁(Fe)蛋白传递给钼铁(MoFe)蛋白,在MoFe蛋白的活性中心部位进行N_2、C_2H_2等多种底物的还原[10,11,20]。MoFe蛋白中的Mo、Fe原子和酸不稳定性硫原子(S~*)组成2个M簇(FeM-oco)、3—4个P簇(P-cluster)及1—2个S(2Fe)簇。在底物还原过程中,这些原子簇都可能参与电子的传递。铁钼辅因子(FeMoco)已被认为是络合和还原底物的重要部位。因此,要阐明MoFe蛋白的作用机理就得研究FeMoco的结构和功     

高度缺失金属原子簇的钼铁蛋白的制备及其重组

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白与邻菲罗啉厌氧保温时,尿素可使钼铁蛋白丢失的Ｆｅ原子数目显著增加,在有过量Ｎａ２Ｓ２Ｏ４存在时,每个蛋白分子失去的Ｆｅ原子数猛然增至２６－２８个,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５柱层析得到的蛋白已失去８５％的乙炔还原活性,而蛋白回收率仍可达６０％。与含Ｍｏ重组液重组后,这种失活蛋白的紫外－可见圆二色谱、凝胶电泳图谱和乙炔还少在性均有所恢复,结果表明,尿素可使厌氧钼铁蛋白的ＦｅＭ     

重组溶液对缺失金属原子簇的钼铁蛋白激活作用机理(简报)

金属原子簇受损伤或缺失的固氮酶钼铁(MoFe)蛋白与由Na_2MoO_4、柠檬酸铁、Na_2S和二硫苏糖醇(DTT)组成的重组溶液保温后,活性和结构都得到显著恢复。现就其重组机理进行研究。     

H2O2对棕色固氮菌钼铁蛋白的损伤

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白经Ｈ２Ｏ２作用后,钼铁蛋白的Ｍｏ和Ｆｅ原子含量,乙炔还原少在性,摩尔消光系数和α－螺旋度地匀显著降低,蛋白质肽链也许发生部分断一。本和纱中存在过氧化物酶。可避免Ｈ２Ｏ２对钼铁蛋白的损伤作用,表明Ｈ２Ｏ２对钼欠蛋白的金属原子簇和蛋白质结构均有明显的损伤作用,而过氧化物酶可保护固氮酶不受Ｈ２Ｏ２的破坏。     

铁氰化钾氧化固氮酶钼铁蛋白与铁、钼、硫化合物重组的研究

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白经铁氰化钾氧化后变为“漂白蛋白”,其活性损失约75％,同时释放出80％的钼和50％左右的铁。与铁、钼、硫重组溶液重组,金属组成和乙炔还原活性均得到明显恢复。穆斯鲍尔(M／issbauer)谱表明,重组溶液中的Fe、Mo、S已形成FeMc6原于簇的类似物,“重组蛋白”的M6ssbauer谱和天然MoFe蛋白相似。     

含铬重组液激活部分缺陷失金属原子族的钼铁蛋白的研究

棕色固氮菌固氮酶相铁蛋白经邻菲罗啉和Ｏ２处理,变为部分缺失ＦｅＭｏｃｏ和Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ的失活蛋白。与由Ｋ２ＣｒＯ４、高柠檬酸铁、Ｎａ２Ｓ和二硫苏糖醇组成的重组液保温后,处理蛋白对乙炔和质子还原的活性都得以显恢复,然而,它的吸收光谱和圆二色谱虽有明显恢复,但仍与还原钼铁蛋白有所不同。这表明,激活蛋白中也话存在功能与钼铁蛋白相似,而结构则有所差异的含铬蛋白。     

用酒石酸解离棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白获得的含钼铁组分

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白结晶,经处理先后出现一个与福林试剂呈颜色反应的洗脱峰Ⅰ和一个与茚三酮试剂呈颜色反应的洗脱峰Ⅱ。洗脱峰Ⅰ、Ⅱ均含有钼和铁。钼和铁的洗脱峰位基本上与蛋白或肽的洗脱峰位相符合。 两个洗脱峰中的成分都能激活棕色固氮菌突变株UW45无细胞抽出物的非活性组分Ⅰ,比活分别为17.8和6.8毫微克分子乙烯/分/毫微克原子钼,并能在硼氢化钾存在下自身催化还原乙炔,比活分别为16.9和50.9毫微克分子乙烯/分/毫微克原子钼。 峰Ⅰ与峰Ⅱ的组成不同,峰Ⅰ是一种组分,峰Ⅱ是两种组分的混合物。峰Ⅰ组分是不同于固氮酶钼铢蛋白的一种蛋白质。洗脱峰Ⅰ组分的分子量是5000道尔顿,洗脱峰Ⅱ两种组分的分子量分别是2100和1850道尔顿。经测定,峰Ⅰ组分和峰Ⅱ中分子量为2100道尔顿的组分含有钼、铁。因此,通过酒石酸处理可以从上清液中得到两种含钼铁的组分。这两种组分的红外吸收光谱也是明显不同的。 酒石酸处理后的沉淀再用N-甲基甲酰胺抽提获得的组分,具有恢复棕色固氮菌突变株UW45乙炔还原活性的能力。经纸层析鉴定,与Shah法制备的铁钼辅因子相类似。     

生物固氮

912334 肺炎克氏杆菌固氮酶水解ATP机制的动力学研究[会,英]/Thorneley,R.N.F.…∥8th Internatl.Cong. Nitrogen Fixation.-1991,5,Abs.-A-07 应用截流光谱,截流热量法,稳态H_2和Pi形成测定和质谱分析~(18)O-Pi中~(18)O的损失等研究了纯化的固氮酶组分蛋白在6℃、pH7.0和在23℃、pH7.4下需还原剂和不需还原剂ATP水解的机理.MgATP裂解产生的固氮酶结合的MgADP+Pi是可逆的,与释放一个质子偶联,吸热并在6℃下推动电子从Fe蛋白传递至     

蓝藻固氮酶钼铁蛋白的研究

改进了蓝藻固氮酶的分离、提纯方法。首次用小型厌氧聚丙烯酰胺凝胶制备电泳法,代替常用的层析法,获取了电泳纯的蓝藻固氮酶钼铁蛋白,简化了程序,缩短了实验周期。SDS凝胶电泳和分子筛凝胶过滤测定分子量结果表明,钼铁蛋白分子量为360,000,由4个分子量为90,000的同一类型亚单位构成。每个钼铁蛋白分子含1个钼,18个铁和3290个氨基酸残基。其中酸性氨基酸占优势。研究了柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)固氮酶粗提物和钼铁蛋白的某些特性,其结果是:米氏常数为3.33×10~(-3)大气压乙炔,等电点为5—5.5。紫外、可见光谱与其它固氮生物的类似。盐对蓝藻固氮酶较之对其它固氮生物的固氮酶有更大的抑制作用。     

含铬重组液激活部分缺失金属原子簇的钼铁蛋白的研究

棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）固氮酶钼铁蛋白经邻菲口罗啉和Ｏ２ 处理后,变为部分缺失ＦｅＭｏｃｏ 和Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ的失活蛋白。与由Ｋ２ＣｒＯ４、高柠檬酸铁、Ｎａ２Ｓ和二硫苏糖醇组成的重组液保温后,处理蛋白对乙炔和质子还原的活性都得以显著恢复;然而,它的吸收光谱和圆二色谱虽有明显恢复,但仍与还原钼铁蛋白有所不同。这表明,激活蛋白中也许存在功能与钼铁蛋白相似,而结构则有所差异的含铬（ＣｒＦｅ）蛋白     

棕色固氮菌固氮酶的金属原子簇III.邻菲啰啉处理的铁钼蛋白的催化活性、光谱特性与铁含量的关系

棕色固氮菌固氮酶铁铝蛋白与邻菲啰啉混合后,生成一种红色的亚铁一邻菲哕啉螯合物。处理蛋白的M。含量几乎不变,但Fe／Mo比降低;处理蛋白的乙炔还原活性、克分子消光系数870com。和圆二色性克分子消光系数△S45unm。随着失去的Fe原子数目的增加而几乎成比例降低;失去的活性可为轻度氧钝化的铁钼蛋白恢复。结果表明,邻菲哕啉可能通过专一螯合P—cluster中的Fe原子而使其结构受到破坏,从而使铁钼蛋白失去活性。 由此可推论出,P—clustcr在铁钼蛋白还原底物过程中起着重要的作用。     

利用扰动角关联研究固氮酶反应的机理

结合新颖而敏感的受扰角关联(PAC)技术,初步利用了~(99)Mo,~(111)In作为研究固氮酶及其模型系统反应机理的探针。~(99)Mo,~(111)In发射的γ射线的角关联,当它们与化合物或生物大分子配位形成络合物时,就被强烈地干扰。实验指出:当~(99)MoO_4~-与半胱氨酸形成络合物时,~(99)Mo的角关联受扰,衰减因子G_2值降低。加入ATP,G_2值进一步降低,说明ATP对Mo-SH催化剂的Mo活性中心发生作用。在pH≈9.0左右的溶液中,只有那些具催化活性的固氮酶模型系统,G_2值降低。In~(+++)能代替Mg~(++)参与固氮酶反应,因此,~(111)In的PAC技术有助于阐明固氮酶的反应机理,特别是有关ATP的作用问题。     

利用扰动角关联研究固氮酶反应的机理

结合新颖而敏感的受扰角关联(PAC)技术,初步利用了~(99)Mo,~(111)In 作为研究固氮酶及其模型系统反应机理的探针。~(99)Mo,~(111)In 发射的γ射线的角关联,当它们与化合物或生物大分子配位形成络合物时,就被强烈地干扰。实验指出:当~(99)MoO_4~-与半胱氢酲形成络合物时,~(99)Mo 的角关联受扰,衰减因子G_2值降低。加入ATP,G_2值进一步降低,说明ATP 对Mo-SH 催化剂的Mo 活性中心发生作用。在pH≌9.0左右的溶液中,只有那些具催化活性的固氮酶模型系统,G_2值降低。In~(+++)能代替Mg~(++)参与固氮酶反应,因此,~(111)In 的PAC 技术有助于阐明固氮酶的反应机理,特别是有关ATP 的作用问题。