细胞周期蛋白E siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建细胞周期蛋白E（CyclinE）小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并检测其抑制乳腺癌细胞株MCF-7中CyclinE表达的效果。方法根据基因文库中Cyclin E的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别转入到pGENESIL-1质粒中,并对重组质粒（命名为pGENESIL／CyclinE-1和pGENESIL／Cyclin E-2）进行测序鉴定。脂质体介导下转染MCF-7细胞株,RT-PCR检测转染后Cyclin E的表达。结果 CyclinEsiRNA真核表达载体构建成功,测序结果显示插入片段的方向和序列与预想一致。RT-PCR检测显示Cyclin E的表达显著降低。结论 Cyclin E siRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究以Cyclin E为靶位点对乳腺癌进行基因治疗奠定了重要的实验基础。     

番茄红素环化酶基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术,构建靶向番茄红素环化酶基因(CarR)的干扰质粒,为选择性抑制番茄红素环化酶活性以提高番茄红素产量,奠定基础。方法用DNA重组技术将针对三孢布拉氏霉菌CarR的不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒mU6 pro中,构建CarR shRNA表达质粒重组体mU6 CarR shRNA1、2、3,转化DH5а菌株扩增。提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。结果3个CarR shRNA表达载体mU6 CarR shRNA1、2、3经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。结论成功构建了CarR shRNA表达载体mU6 CarR shRNA,重组体的成功构建为研究CarR靶向RNA干扰番茄红素的环化打下基础。     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建特异性抑制甲胎蛋白（AFP）的小干扰RNA（siRNA）表达载体,为进一步研究AFP基因功能及AFP相关肿瘤的基因治疗奠定基础。方法：设计并合成AFP特异性的短链寡核苷酸,退火形成双链DNA片段,通过与RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector连接、转化大肠杆菌、扩增、纯化得到所需质粒,用琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。结果：琼脂糖凝胶电泳证实纯化后的质粒大小约为6740bp,测序证实插入序列与合成的寡核苷酸序列完全符合。结论：构建了AFP特异性的siRNA表达质粒pSIREN-DNR—DsRed-Express Donor Vector-AFP。     

靶向DENN-SV基因的shRNA真核表达载体的构建

该研究根据DENN-SV序列及shRNA设计原则,设计四个靶点序列,退火后用DNA重组技术与pRNAi-U6.1/Neo空载体连接,转化到感受态E.coli中。扩增菌株,抽提质粒,进行酶切、DNA测序鉴定。将重组的真核表达载体转染人乳腺癌MCF-7细胞并使用RT-PCR及Western blot检测其抑制DENN-SV mRNA表达的效率,以MTT法绘制生长曲线。测序结果与设计序列相同,并已成功转染进入人乳腺癌MCF-7细胞,可见GFP(绿色荧光蛋白)表达,且都具有抑制作用(P<0.01),DS-1组的抑制效果最好;MTT法绘制生长曲线结果表明,实验组经该载体转染后细胞增殖程度显著减少(P<0.05)。该研究应用RNAi技术成功构建了小干扰RNA重组体,为进一步研究乳腺癌基因治疗奠定了基础。     

neuronatin shRNA真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:获得能持续干扰neuronatin（nnat）基因表达的细胞,观察nnat基因沉默对神经细胞发育与分化的影响,为研究基因功能奠定基础。方法:构建含nnat基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,将质粒转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,RT-PCR方法筛选出最有效干扰质粒,稳定转染PC12细胞后观察细胞表型变化,免疫荧光检测nnat蛋白表达,NGF诱导观察nnat表达下调对细胞分化的影响。结果:成功构建并筛选出有效的靶向nnat基因的shRNA真核表达载体;载体稳定转染PC12细胞之后能特异性沉默nnat基因的表达,PC12细胞长出突起,向神经元方向分化,加入诱导因子NGF后能促进突起生长。结论:nnat可能是作为神经分化抑制因子在神经发育与成熟过程中发挥作用。     

靶向NBS1基因的 microRNA真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建靶向NBS1基因的 microRNA真核表达载体,鉴定其转染宫颈癌细胞株Hela后的生物活性?方法:根据NBS1mRNA序列设计合成四对pre- microRNA片段,定向克隆到pcDNA 6.2- GW/ EmGFP-miR真核表达载体上,并将其转染至Hela细胞株中?采用菌落PCR和测序分析鉴定插入序列的完整性;采用实时定量PCR分析鉴定重组体对NBS1mRNA表达的干扰效果以确定其生物活性? 结果:构建的四组重组体插入片段的碱基序列完全正确?重组体能干扰Hela细胞NBS1基因的表达,四组重组体NBS1 mRNA表达量分别为: 0.24±0.17 (NBS1mi-1组)?0.12±0.12 (NBS1mi-2组)?0.41±0.97 (NBS1mi-3组)?0.48±0.93 (NBS1mi-4组),其中NBS1mi-2组表达最低? 结论: 构建的四组NBS1 microRNA重组体在Hela细胞株中都具有生物活性, 且NBS1mi-2组的干扰作用最强? 载体构建成功,为应用microRNA靶向NBS1的肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。     

鸭梨α-法尼烯合成酶基因双链RNAi表达载体的构建

目的：为了在转基因鸭梨植株中有效抑制转录后α-法尼烯合成酶基因（PFS）的表达,研究了α-法尼烯合成酶基因双链RNAi载体的构建。方法：利用RT—PCR技术,从鸭梨的果皮中获得了来源于PFS编码区的2个基因片段,反向连接,构建成RNAi载体。结果：经PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,所构建的载体其序列与设计相一致。结论：克隆质粒pMD-L-S构建成功,为借助农杆菌介导法将PFS基因转化到鸭梨再生植株中奠定了基础。     

Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

P27特异性siRNA重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建针对P27的siRNA腺病毒载体及相应的对照病毒载体,并鉴定重组腺病毒在小鼠胰岛中对内源性皿7基因表达的影响。方法合成针对p27的siRNA的靶DNA序列及相应的阴性对照序列,连接至pShuttle-H1质粒中,然后用NotI和HindHI限制性内切酶将H1-siRNA片段从pShuttle—H1-siRNA质粒上双酶切下来,克隆至空载pAdTrack穿梭质粒上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染QBI-293A细胞,包装得到pAd—P27-siRNA和pAd—NC重组腺病毒。用病毒体外感染小鼠胰岛,Western印迹法检测P27蛋白表达水平。结果重组腺病毒载体经测序鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能有效抑制小鼠胰岛中P27的表达。结论成功构建了针对P27的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究P27在胰岛β细胞生长中的作用提供了基础。     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率。方法合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSileneer载体．构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体。将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT—PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平。结果酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT—PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43．6％、47．7％和81．6％,它们的干扰效果被Western印迹所证实。结论干扰率为81．6％的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,。岜可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究。     

人Tim-3 基因真核表达载体的构建及表达

目的:为了构建可在真核细胞中高效表达人Tim-3(hTim-3)的真核表达质粒,以便用于hTim-3肿瘤免疫治疗研究。方法:取健康人外周血的单个核细胞,用高保真聚合酶扩增hTim-3基因,先进行hTim-3基因的亚克隆,用BglⅡ和SalⅠ限制性内切酶切下带有酶切位点的hTim-3基因,最终构建hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3。用脂质体方法转染质粒至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。48h后荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光表达情况,初步判断转染效率。结果:酶切和测序鉴定证实目的基因hTim-3正确插入到真核表达载体pEGFP-N1中,转染肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:成功构建了可在真核细胞中高效表达hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3,为进一步研究hTim-3的肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

人Tim-3基因真核表达载体的构建及表达

目的：为了构建可在真核细胞中高效表达人Tim-3（hTim-3）的真核表达质粒,以便用于hTim-3肿瘤免疫治疗研究。方法：取健康人外周血的单个核细胞,用高保真聚合酶扩增hTim-3基因,先进行hTim-3基因的亚克隆,用Bgl II和SalI限制性内切酶切下带有酶切位点的hTim-3基因,最终构建hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3。用脂质体方法转染质粒至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。48h后荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光表达情况,初步判断转染效率。结果：酶切和测序鉴定证实目的基因hTim-3正确插入到真核表达载体pEGFP—N1中,转染肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了可在真核细胞中高效表达hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3,为进一步研究hTim-3的肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。     

中间锦鸡儿种子特异性fad2基因克隆及fad2-1A基因酵母表达载体的构建

△12脂肪酸脱氢酶(△ 12 fatty acid desaturase,△ 12 FAD,也称为fad2)催化油酸生成亚油酸,是植物体内生成多不饱和脂肪酸的关键酶,种子中特异表达的fad2基因负责种子贮脂中多不饱和脂肪酸亚油酸的生成,决定种子油脂的成分和营养价值.采用RT-PCR和RACE技术从中间锦鸡儿未成熟种子中克隆了种子特异表达的fad2-1A,fad2-1B基因,fad2-1A编码的前283个氨基酸与fad2-1B的同源性高达98.9%,前者比后者多编码97个氨基酸,全部氨基酸残基的同源性为70.71%.将fad2-1A克隆到真核表达载体pYES2中,构建了重组质粒pYES2-fad2-1A,经PCR检测、质粒酶切、测序等检测,目的基因确实插入重组质粒,且方向正确,为进一步研究fad2基因的功能和表达调控机理奠定了基础.     

小伞山羊草中新型avenin-like基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆小伞山羊草中新型avenin-like（类燕麦储藏蛋白）基因,揭示avenin-like基因的表达模式,并构建avenin-like基因真核胚乳特异性表达载体。方法：利用RT-PCR方法揭示avenin-like基因的表达模式,并用PCR方法从小伞山羊草中克隆新型avenin-like基因;将克隆的avenin-like基因插入表达载体pLRPT构建真核表达载体pLRPT-avel,并经酶切和测序鉴定。结果：avenin-like基因在胚乳中特异性表达;克隆得到新型avenin-like基因,并构建了其真核胚乳特异性表达载体。结论：新型avenin-like基因的克隆及其真核表达载体的构建,为小麦品质改良提供了研究基础。     

斑马鱼notch3基因真核表达载体的构建及其表达分析

为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能,构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达.其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence,CDS)从NCBI的在线数据库中获得,根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain,NICD),接着利用同源重组技...