巴西橡胶树液泡ATP酶F亚基基因克隆及表达

根据筛选文库时获得的EST序列信息,利用RACE技术分离了一个巴西橡胶树ATP酶 F亚基基因,命名为HbVHA-F.结果显示,该基因cDNA全长658 bp,含有完整的阅读框架,编码130个氨基酸.序列比对及结构预测分析表明,HbVHA-F编码的氨基酸序列与杨树、水稻、黄麻、小麦和香蕉中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到88.46%、86.15%、84.62%、83.85%和74.62%,与杨树一致性最高,并与其他高等植物聚为一类.半定量RT-PCR分析显示,割胶(机械伤害)和乙烯利能够诱导HbVHA-F基因的表达.HbVHA-F基因可能通过转录表达调节参与了乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控.     

甜菜ATP合酶β亚基基因atpB的克隆、序列分析及进化

atpB基因编码ATP合酶β亚基,是光合作用中的重要基因。ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应。利用植物叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据已知植物烟草、水稻和菠菜等的叶绿体基因组全序列,设计并合成了一对引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增得到包含atpB完整基因(GenBank登录号为DQ067451)在内的一段序列,测序与序列分析表明:该克隆片段全长2 293 bp,其中包括有1 497 bp的编码区序列,推测编码498个氨基酸。同源性比较,该克隆基因与烟草、菠菜、油菜、水稻atpB基因的核苷酸序列同源性分别为90.92%、95.79%、87.71%和86.37%,推测的氨基酸序列同源性分别为94.58%、97.19%、92.17%和91.97%。同时,建立了几种植物的氨基酸序列系统进化树。     

甜菜ATP合酶β亚基基因αtpB的克隆、序列分析及进化

αtpB基因编码ATP合酶β亚基,是光合作用中的重要基因。ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化和光舍磷酸化反应。利用植物叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据已知植物烟草、水稻和菠菜等的叶绿体基因组全序列,设计并合成了一对引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增得到包含αtpB完整基因（GenBank登录号为DQ067451）在内的一段序列,测序与序列分析表明：该克隆片段全长2293bp,其中包括有1497bp的编码区序列,推测编码498个氨基酸。同源性比较,该克隆基因与烟草、菠菜、油菜、水稻αtpB基因的核苷酸序列同源性分别为90.92％、95．79％、87．71％和86．37％,推测的氨基酸序列同源性分别为94．58％、97．19％、92．17％和91．97％。同时,建立了几种植物的氨基酸序列系统进化树。     

二化螟乙酰胆碱受体a亚基的基因克隆与序列分析

烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）在昆虫的兴奋性突触传递中起着重要的作用,同时也是杀虫剂作用的重要靶标。近年来,二化螟对作用于昆虫nAChR的沙蚕毒素类杀虫剂杀虫单产生了高抗性。为了研究可能存在的靶标不敏感机制,我们采用RT-PCR技术,对二化螟nAChRa亚基全长cDNA进行了分子克隆。序列分析表明,这是1个新的a亚基基因,定名为Cs a 1。基因全长为1997个核苷酸,包含了1个开放阅读框,编码1个509氨基酸的成熟蛋白和1个24氨基酸的信号肽。Cs a 1与其他昆虫nAChR a亚基之间有52%～94%的同源性,高于与脊椎动物nAChR a亚基之间的同源性。     

甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析

1- 氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶是植物乙烯合成的一个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计两个简并引物,以甘蔗总DNA为模板,通过PCR扩增到一个940bp的基因片段。将片段序列在MCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示的63个序列全部是ACC氧化酶基因,因而认为克隆到的片段就是甘蔗ACC氧化酶基因的一个成员。经对不同植物来源的ACC氧化酶基因家族进行比较分析,去除一个103bp的“内含子“后,推导的氨基酸序列为279个残基,占推测全长氨基酸残基总数的86％左右。经同源性分析,序列与毛竹和水稻ACC氧化酶的同源率达到86％。系统进化分析表明,该序列最先与水稻、其次和香蕉的ACC氧化酶聚类,然后再与双子叶植物的ACC氧化酶聚类,符合按形态特征分类的血缘关系。基因的获得对下一步了解乙烯的合成表达与甘蔗生长、成熟过程之间的关系奠定了基础。     

甜菜ATP合酶β亚基基因atpB的克隆、序列分析及进化

atpB基因编码ATP合酶β亚基,是光合作用中的重要基因。ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应。利用植物叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据已知植物烟草、水稻和菠菜等的叶绿体基因组全序列,设计并合成了一对引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增得到包含atpB 完整基因（GenBank登录号为 DQ067451）在内的一段序列,测序与序列分析表明：该克隆片段全长2 293 bp,其中包括有1 497 bp的编码区序列,推测编码498个氨基酸。同源性比较,该克隆基因与烟草、菠菜、油菜、水稻atpB基因的核苷酸序列同源性分别为90.92%、95.79%、87.71%和86.37%,推测的氨基酸序列同源性分别为94.58%、97.19%、92.17%和91.97%。同时,建立了几种植物的氨基酸序列系统进化树。     

甘蔗蔗汁品质性状的回归分析及模型

本文对47份不同甘蔗基因型的蔗汁品质性状进行简单回归和逐步回归分析.结果表明,蔗汁蔗糖分(Suc)与锤度(BX)、温度校正后锤度(BX′)、蔗汁旋光读数(0Z)以及转光度(pol)之间均呈线性回归,简单回归模型均达极显著水平(P＜0.01),决定系数(R2)分别为0.9393、0.9199、0.9861及0.9839.通过逐步回归分析和残差分析建立多重线性回归方程为Suc=0.05706 0.21488BX 0.181030Z,方差分析表明多重线性回归模型达极显著水平(P＜0.01),决定系数为0.9931.t测验表明,蔗汁蔗糖分的模型预测值与实测值间的差异不显著,相对误差平均为0.49%.     

可溶性CD14基因克隆及序列分析

针对人可溶性CD14(sCD14）的cDNA序列设计引物,通过反转录PCR技术,从U937细胞中,扩增出编码人可溶性CD14的基因序列,并将其克隆至质粒pGEM－T中,通过PCR、酶切及序列测定鉴定重组载体。结果表明获得了人可溶性CD14基因片段,为下一步进行CD14表达及生物学活性研究奠定了基础。     

烟草黄酮醇合成酶基因的克隆及其序列分析

根据已知的黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从烟草叶片中扩增获得黄酮醇合成酶cDNA片段,再用RACE方法得到其两端序列。根据获得的序列,设计引物分离得到完整的1188bp的黄酮醇合成酶基因,其开放阅读框编码346个氨基酸。序列分析显示,烟草黄酮醇合成酶与高杯花、矮牵牛和马铃薯的同源性分别为87％、86％和84％,与其它物种中的同源性也在80％左右,表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性。此外,在氨基酸水平上,该酶与其它依赖于2-酮戊二酸的双加氧酶及其相关酶也具有同源性。     

西伯利亚蓼硫堇基因的克隆和序列分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的硫堇(THI)基因的部分序列,应用RACE技术克隆了具有PolyA的全长cDNA序列。基因全长789bp,5'非翻译区90bp,3'非翻译区276bp,开放阅读框编码140个氨基酸。序列分析表明,该编码蛋白与大多数植物THI蛋白前体高度相似,N端具24个氨基酸的信号肽,中间46个氨基酸为成熟THI部分,C端的70个氨基酸为酸性多肽部分。西伯利亚蓼THI蛋白与丹参等双子叶植物THI蛋白有较高的同源性,具保守的植物THI标签序列C-C-X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C。此成熟THI蛋白带正电荷,偏碱性,推定可能具有抗病原微生物活性,为一种新的植物THI蛋白,GenBank登录号为DQ981482。     

绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析

根据已报道植物鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因cDNA序列的保守区域设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,对绞股蓝SE基因进行克隆及序列分析.结果表明,绞股蓝SE基因cDNA全长为1 818 bp,编码一个由525个氨基酸残基组成的多肽.绞股蓝SE基因编码的氨基酸序列中含有52.4%的非极性疏水性氨基酸,26.1%极性中性氨基酸,9.0%酸性氨基酸,12.6%碱性氨基酸.Blast结果显示,绞股蓝SE基因核苷酸序列与其他已报道的植物SE基因相似性为73%～82%,推导的氨基酸序列相似性为63.2%～79.4%.SE氨基酸序列进化分析发现,绞股蓝SE与绿珊瑚、拟南芥亲缘关系较近.     

三角帆蚌金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RACE技术,获得了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)金属硫蛋白基因的全长cDNA序列.该序列全长467 bp,由长92 bp的5'UTR(untranslated region),159 bp的3'UTR,和216 bp的开放阅读框(openreading frame,ORF)组成.共编码71个氨基酸,分子量大约为7.1 ku,理论等电点为7.24.该蛋白序列中半胱氨酸含量最丰富(29.6%),其次是甘氨酸(14.1%),存在软体动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXXCXCX,且C-末端的氨基酸序列也符合软体动物金属硫蛋白标签序列C-X-C-X(3)-C-T-G-X(3)-C-X-C-X(3)-C-X-C-K.蛋白序列特征分析表明,该序列与其他贝类的金属硫蛋白基因具有很高的相似性,具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员.     

毛木耳漆酶基因的克隆、序列分析及其鉴定

本文利用PCR和RACE技术首次从毛木耳AP4菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及其基因组全长序列,基因组大小为2514 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含14个外显子和13个内含子.cDNA序列的全长为1972 bp,其包含一个完整的ORE长度为1860 bp,编码619氨基酸,推测的分子量大小为68 kD,等电点pI为5.15.在氨基酸序列的氨基末端存在一个信号肽序列,同时该基因还包括含铜氧化酶的三个功能结构域KOG1263、SufI和pfam00394.氨基酸序列与GenBank中登录的真菌漆酶蛋白序列比对表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%,相似性为58%,并且含有真菌漆酶的四个保守的Cu-bind结构域.将获得的漆酶基因lacl与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导该基因在第10天产酶高达123 IU/L,并通过Native SDS-PAGE电泳获得预期大小的漆酶蛋白条带.结构分析和功能验证均表明:本研究获得的基因lacl为漆酶基因.     

金银花黄酮醇合成酶基因全长克隆及其序列分析

根据已知的其它物种黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成酶基因部分eDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列.序列拼接得到完整的1 248bp的黄酮醇合成酶基因,根据获得的序列,设计引物扩增获得1 001 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸.序列分析显示,金银花黄酮醇合成酶与烟草、马铃薯和桔梗的同源性分别为86％、83％和80％,与其它物种的同源性也在80％左右,表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性.     

普通烟草K^＋通道基因NKT4的克隆、序列和表达分析

通过比对拟南芥、胡萝卜、番茄和马铃薯的K+通道氨基酸序列得到了保守序列,设计1对简并引物,利用RT-PCR获得3条490bp的普通烟草K+通道基因中间片段.以其中一条中间片段设计特异性引物,应用RACE方法得到5′末端和3′末端cDNA序列.通过拼接并结合全长克隆及测序验证,获得一个未报道的普通烟草K+通道基因,并将其命名为NKT4(GenBank登录号为FJ233071).NKT4的cDNA全长为2937bp,其中5′非编码区45bp、编码区2679bp、3′非编码区213bp;编码区编码892个AA.构建了一个烟草、拟南芥及相关植物K+通道蛋白的系统进化树.基因表达分析表明,NKT4主要在烟草主根和侧根中表达,在烟草叶中也有少量表达.     

巴西橡胶树磷脂酰肌醇转移蛋白cDNA的克隆及其序列分析

本文从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)差减cDNA文库中筛选到一个与磷脂酰肌醇转移蛋白(phos-phatidylinositol transfer protein)同源性较高的基因片段,并根据该基因片段序列信息,设计特异性引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE(rapid amplification of cDNA ends)进行差异片段的5'和3'端的扩增,并获得长度为1081bp的全长cDNA克隆R291(GenBank登陆号:AY589690)。序列分析表明,该基因包含702bp的开放阅读框,编码234个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为26.8kD,等电点为6.51,有一个的跨膜螺旋区(氨基酸位点为83～103)。R291基因含有一个脂质结合保守区(Sec14p-like lipid-binding domain),具有CRAL-TRIO脂质结合结构域,推测该基因是一个磷脂酰肌醇转移蛋白基因。该基因的克隆将为橡胶树磷脂酰肌醇代谢的研究奠定了基础,将有助于进一步了解磷脂酰肌醇代谢与胶乳再生之间的关系。     

牡丹CTR1基因家族基因片段及其cDNA 3′-末端的克隆与序列分析

以牡丹品种‘洛阳红’(Paeonia suffruticosa‘Luo Yang Hong’)花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的CTR1(Constitutive Triple Response 1)蛋白的保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到3条牡丹CTR1基因同源片段。利用其已知中间序列,通过3′快速扩增cDNA末端技术(3′RACE)及序列拼接,最终得到了这3个基因片段除5′末端外的全部cDNA序列,分别命名为PsCTR1、PsCTR2和PsCTR3。分析结果表明,由PsCTR1、PsCTR2和PsCTR3基因翻译的氨基酸片段与拟南芥和番茄的CTR1蛋白氨基酸序列的同源性均较高,分别为88%和85%;61%和61%以及70%和69%。