大丽轮枝菌毒素的多糖组份对棉花致萎作用的研究

用β-葡萄糖苷酶水解大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)毒素中的多糖组份。发现经酶处理后的5个不同致病力类型的棉花黄萎病菌(大丽轮枝菌)菌株毒素都不能影响整个毒素复合物对棉花的致萎作用,表明毒素中的多糖组份在棉花的致萎作用中不占有重量地位。     

大丽轮枝菌毒素的脂肪组分对棉花致萎活性研究

用脂肪酶(37℃,6小时)水解不同致病力类型的5个大丽轮枝菌(Verticillium dahliaeKleb.)毒素中的脂肪组分。试验结果表明经过水解后的5个菌株的毒素都不影响对棉花的致萎活性,说明毒素中的脂肪组分在对棉花的致萎作用中不占重要地位。     

大丽轮枝菌毒素致萎活性成分的研究

测定大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)Kleb．)不同致病力类型的5个菌株毒素的成分,试验结果表明各菌株的毒素都含有蛋白质、多糖和脂类物质,并发现致病力强的菌株毒素所含的蛋白质和多糖的量高于致病力弱的菌株毒素,而脂类物质的量却低于弱菌株毒素。经过高温(100℃,10分钟)和蛋白酶(37℃,6小时)处理后的各菌株毒素则不能使棉花致萎,说明毒素中的蛋白质组分在毒素对棉花的致萎作用中占有重要的地位。     

大丽轮枝菌分泌糖蛋白的分离及其致萎性研究

利用伴刀豆球蛋白（ＣｏｎＡ） 亲和层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ＿１５０ 凝胶层析、双向电泳、ＳＤＳ梯度电泳等手段对大丽轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ．）分泌的糖蛋白复合物进行分离,对其中一约２６ ｋＤ 的组分进行了Ｎ 端氨基酸序列分析。以棉花（ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ Ｌ．）叶片为材料,进行了糖蛋白致萎性实验。结果表明,沸水浴或ＣｏｎＡ 处理的蛋白致萎性消失,Ｚｅａｔｉｎ 使糖蛋白致萎性减弱。该糖蛋白能够诱导海岛棉培养细胞中棉酚等倍半萜的合成,棉酚的积累随着糖蛋白浓度的增加而增加,但到一定程度后下降,此时较高浓度的大丽轮枝菌分泌糖蛋白引起植物细胞死亡     

大丽轮枝菌微菌核形成能力的遗传

带有硝酸盐利用缺陷型遗传标记的大丽轮枝菌Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ黑色菌核型和白色菌丝型菌株在２５℃下配对培养,形成野生型融合菌落带,对融合带的分生孢子后代进行遗传分析的结果表明,融合带中的异核体表现不稳定,分布不均匀。微菌核遗传因子可随亲本细胞质在异核体中的运动和交换而发生迁移。     

大丽轮枝菌毒素与拟南芥互作反应中SA、NO与H2O2信号的相关性

本文研究了大丽轮枝菌毒素(VD-toxin)与拟南芥互作反应中外源SA、NO供体、NO合酶抑制剂等对拟南芥幼苗H2O2含量的影响,并对H2O2的积累部位进行了DAB组化染色检测.大丽轮枝菌毒素、外源SA、NO供体处理拟南芥幼苗均能诱导H2O2的积累,NO供体的诱导作用最强;NO合酶抑制剂处理则未表现出H2O2含量的增强;H2O2的积累部位主要在叶片的表皮毛和维管束组织.结果表明,在大丽轮枝菌毒素与拟南芥互作反应中,H2O2可能作为信号分子参与了SA和NO调控的拟南芥防卫反应,NO信号与H2O2信号间的关系可能更密切.     

大丽轮枝菌毒素的分离、提纯及生物测定

试验用Czapek's培养液培养大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)不同致病力类型的5个菌株的培养滤液,经浓缩、离心和透析制成的粗毒素,再经DEAE-纤维素柱层析得到初提毒素,最后通过琼脂糖凝胶过滤层析获得纯毒素样品。生物活性测定表明初提毒素的最低生物活性浓度为5.0—5.5μg/ml。纯毒素的最低生物活性浓度为4.0—4.5μg/ml。配制相同浓度的不同致病力类型菌株的毒素液,它们的培养滤液、粗毒素或纯毒素对棉苗的致萎能力相同。     

大丽轮枝菌寡糖素诱导的棉花组培细胞的过氧化物酶表达分析

将已在察氏液体培养基中培养3d的强毒性（V44)或弱毒性（V64）大丽轮枝菌接种到新鲜的相同培养基中,加入棉花黄萎病感病品种（S）或抗病品种（R）的悬浮培养细胞（或其细胞匀浆）。培养4d后收获真菌孢子,用于致萎力测定,收获菌丝体细胞壁用于制备真菌寡糖素（H,来自V44或L,来自V64）,然后用该寡糖素诱导悬浮培养的棉花细胞（S或R）,棉花细胞的过氧化物酶（POD）同工酶结果表明;（1）所有寡糖素均诱导棉花细胞产生新的过氧化物酶;（2）感病品种豫棉6号的活组培细胞S（或其细胞匀浆）显著影响真菌,用生长过程中接触该活细胞（或其细胞匀浆）的真菌所制备的寡糖素再诱导该活细胞（即S→L（H）→S）时,棉花细胞在36h的POD同工酶谱与其对照,即L（H）→S比较,酶带增减变化显著,致萎力测定结果表明感病品种的活细胞提高了病原毒性和致病力;（3）耐病（豫棉8号）或抗病品种（中棉12号）的活组培细胞R（或其细胞匀浆）对真菌的影响不同于感病品种,R→L（H）→R在36h的POD同工酶谱与L（H）→R比。酶带没有增减变化。但是在H→R或H→S中于9h和24h出现的酶带在R→H→R或R→H→S中分别提前到6h和9h,致萎力测定结果表明抗病品种细胞对病原毒性影响很小。     

大丽轮枝菌微菌核形成能力的遗传

带有硝酸盐利用缺陷型遗传标记的大丽轮技菌Verticilliumdahliae黑色菌核型和白色菌丝型菌株在25℃下配对培养,形成野生型融合菌落带,对融合带的分生孢子后代进行遗传分析的结果表明,融合带中的异核体表现不稳定,分布不均匀。微菌核遗传因子可随亲本细胞质在异核体中的运动和交换而发生迁移。     

大丽轮枝菌VdSCH9基因的功能研究

大丽轮枝菌是一种土传性植物病原真菌,可侵染多种植物并引发黄萎病。目前,人们关于大丽轮枝菌的侵染和致病机制的了解还很不深入。本文通过敲除大丽轮枝菌编码丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶基因VdSCH9,阐明了其在大丽轮枝菌生长发育及致病过程中的作用。SCH9基因在酵母中的表达与cAMP-PKA途径和TOR信号通路相关,对酵母的生长、压力响应和寿命等有重要作用。大丽轮枝菌VdSCH9敲除突变体的生长速率显著下降,菌落边缘菌丝更为稀疏,菌丝分枝减少,对棉花植株为害的平均病情指数为56.6,显著低于野生型和互补突变体的平均病情指数90.5和82.8,对茄子植株为害的平均病情指数为65.9,也显著低于野生型和互补突变体的平均病情指数91.1和89.8。另外,敲除突变体对于高渗透压、氧化还原压力、细胞膜和细胞壁完整性等压力条件的敏感性增强。因此,VdSCH9对于大丽轮枝菌的生长、压力响应及致病力均有重要作用。     

大丽轮枝菌硝酸盐利用缺陷型和抗杀菌剂突变体的遗传研究

初步研究了大丽轮枝菌硝酸盐利用缺陷型和抗杀菌剂突变体的遗传特征。结果表明,大丽轮枝菌对三环唑的抗性不能稳定遗传,抗性菌株经低温或室温保顾一个月及转代培养后无丧失抗性,５株抗多菌灵的突变体,有一株在第二代单胞后代培养时丧失抗性,１株在单孢后代中发生分离;     

轮枝菌诱导棉花细胞的氧化迸发

大丽轮枝菌（Verticilium dahliae kleb.)是引起棉花黄萎病的病原真菌。使用从大丽轮枝菌V44（高毒）和V64（低毒）的菌丝体制备的各市县导物（I44和I64）作用悬浮培养的豫棉6号（感性）和豫棉8号（耐性）细胞系,用过氧化物酶法测定诱导后30min内的反应性氧变化,发现仅有不亲和性较高的体系,即弱毒力的大丽轮枝菌（V64）和耐性的豫棉8号所组成的体系（I64-Y8）表现最高的反应性氧迸发,3min-6min时增加61.8%。使用显著低于杀菌浓度的剂量的水杨酸（SA）和H2O2作用上述大丽轮枝菌,发现水杨酸和H2O2都能影响微生物,经1mmol/L水杨酸和0.2mmol/LH2O2作用后的微生物,其所产生的诱导物对植物细胞反应性氧的诱导作用要高于未被作用的微生物的诱导物,两种化学性质的影响的共同点是使反应性氧迸发的峰值时间提前,峰值增加,水杨酸提前12min,H2O2的影响还突出表现在使反应性氧迸发的曲线锐化,即峰使时间范围的平均每分钟增加率表现显著增加,9min-12min时达到109%。     

大丽轮枝菌微菌核的萌发条件及致死温度

微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和初侵染源,在土壤中可存活14年之久,其数量及存活状况直接影响着大丽轮枝菌型黄萎病的发生为害程度。以棉花黄萎病菌Verticillium dahliae XJ2008菌株为试材,研究了微菌核萌发的最佳条件、致死温度及土壤温度对微菌核存活的影响。结果表明,20℃、pH8.0是微菌核萌发的最佳条件。大丽轮枝菌微菌核具有很强的耐高温特性,随着处理时间的延长,微菌核的萌发率呈下降趋势,在55℃及以上处理时其萌发率下降迅速,而在50℃及以下处理时其萌发率下降相对较慢,在55℃处理360min可使微菌核完全致死,而在40℃、45℃和50℃处理1,440min,仍然有少量的微菌核存活,但其萌发率随着时间的推移呈下降趋势。土壤微菌核模拟试验结果表明,土壤温度对微菌核有很强的致死作用,40℃条件下处理4d后土壤中的微菌核已全部死亡。该研究结果为通过覆膜增温防治作物黄萎病提供了理论依据。     

大丽轮枝菌假定蛋白VDAG＿07165的功能

土传病原真菌大丽轮枝菌寄主范围广,引起的黄萎病危害程度重、防控难度大。对病菌重要致病蛋白的挖掘和功能研究有望为病害防治提供新思路。本研究通过前期蛋白质组测序鉴定到一个未知功能结构域DUF1620家族蛋白VDAG＿07165在大丽轮枝菌对马铃薯根部初侵染阶段高表达。缺失VDAG＿07165基因导致大丽轮枝菌产孢量、分生孢子萌发率和穿透力均显著降低,对马铃薯植株的致病力显著减弱。由此说明,假定蛋白VDAG＿07165可在侵染早期通过调控大丽轮枝菌分生孢子的产生、萌发和穿透能力参与该菌对寄主的致病过程。本研究首次探明了DUF1620家族蛋白在土传病原真菌大丽轮枝菌分生孢子产生和侵染中的作用,为挖掘未知功能的新基因及其在真菌发育和致病过程中的功能研究提供了借鉴和参考。     

大丽轮枝菌毒素与拟南芥互作反应中SA、NO与H2O2信号的相关性

本文研究了大丽轮枝菌毒素（VD-toxin)与拟南芥互作反应中外源SA、NO供体、NO合酶抑制剂等对拟南芥幼苗H2O2含量的影响,并对H2O2的积累部位进行了DAB组化染色检测。大丽轮枝菌毒素、外源SA、NO供体处理拟南芥幼苗均能诱导H2O2的积累,NO供体的诱导作用最强;NO合酶抑制剂处理则未表现出H2O2含量的增强;H2O2的积累部位主要在叶片的表皮毛和维管束组织。结果表明,在大丽轮枝菌毒素与拟南芥互作反应中,H2O2可能作为信号分子参与了SA和NO调控的拟南芥防卫反应,NO信号与H2O2信号间的关系可能更密切。     

大丽轮枝菌异核体及其后代的形态与致病力变异

以硝酸盐利用缺陷型突变（ｎｉｔ突变）和抗杀菌剂突变两种遗传标记,对大丽轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ）异核体后代的形态和致病力进行研究,结果表明,菌核型菌株与菌丝型菌株经菌丝融合形成异核体后,菌丝型菌株能恢复形成微菌核,其后代单孢菌落形成微菌核的数量明显低于菌核型亲本,且遗传性状不稳定;随着转代次数的增多,微菌核形成能力的丧失较菌核型亲本菌株快,异核体后代对棉苗的致病力变化较大,一