牛α—S1—酪蛋白—乙肝病毒表面抗原融合基因在转基因羊中的表达

利用ＤＮＡ重组技术,将牛α－Ｓ１酪蛋白调控区基因（１６ｋｂ的片段）与乙肝表面抗原基因拼接,构建了融合基因表达构件：λ１０６。构件经转基因技术转入山羊受精卵。待受精卵发育至成熟个体并分娩、泌乳,ＥＬＩＳＡ检测其乳汁中的ＨＢｓＡｇ,证明所构建的牛α－Ｓ１酪蛋白基因表达构件是可以在羊乳腺中表达乙肝表面抗原基因,并将其表达产物分泌到乳汁中。     

牛aS1-酪蛋白基因5’-调节区的分子克隆

用牛αsl－酪蛋白cDNA作探针,从牛基因组文库中筛选出一段αsl－酪蛋白基因序列。由限制内切酶图谱和souther印迹分析可以确定其中含有完整的αs1-酪蛋白基因的5’调节区。     

依据乳蛋白基因序列构建反刍动物种系发生树的研究

依据牛的４种乳蛋白（α－乳清蛋白、β－乳球蛋白、β－和К－酪蛋白）基因已知序列设计引物,用ＰＣＲ的方法扩培并生测定了牦牛α－乳清蛋白全序列（２９９９ｂｐ）,水牛的α－乳清蛋白基因全序列（２７８４ｂｐ）,东北马６鹿的α－乳清蛋白基因部分序列（１５８２ｂｐ）,β－酪蛋白基因的５’侧翼序列（９８７ｂｐ）和第４￣第９外显子区序列（１０９０ｂｐ）、β－乳球蛋白５’侧翼序列（２１６７ｂｐ）,３’端侧翼序列（１     

牛α—s1酪蛋白基因5’端及上游区的克隆鉴定和部分序列分析

本文以PcR法克隆得到牛α—s1酪蛋白基因5’端800bp片段,并以该片段为探针,筛选了以EMBL3为载体构建的牛基因组文库,得到一个阳性克隆。酶切该克隆,并以牛α—s1酪蛋白基因5’端800bp片段及该基因cDNA为探针杂交,鉴定了该插人片段的方向,亚克隆了各相应酶切片段,制作了较为详细的限制酶图谱,并分析了该基因转录起始点前后部分序列。与该基因现有的资料比较,酶切图谱存在部分位点的差异,序列存在少量突变和缺失,在5’上游区均发现有内含子及外显子部分,且缺失均发生于有重复序列的部位。     

β-酪蛋白启动子的活性调控机制

β-酪蛋白启动子是一种活性很强的乳蛋白启动子,它不但能在乳腺细胞中高效启动β-酪蛋白的表达,而且能在其它细胞中实现对外源基因的有效表达.β-酪蛋白启动子之所以能高效启动酪蛋白基因或其它蛋白质基因的表达是因为许多激素和细胞因子能调节β-酪蛋白启动子的活性.催乳激素、CCAAT增强子结合蛋白、八聚体结合转录因子等可直接作用于β-酪蛋白启动子以调控它的活性;糖皮质激素(G),ERBB4,肿瘤坏死因子,P300/CBP等则可以通过间接的途径调控β-酪蛋白启动子的活性.本文就近年来β-酪蛋白启动子活性的直接和间接调控这两个方面的研究进行综述.     

牛α-S1-酪蛋白-乙肝病毒表面抗原融合基因在转基因羊中的表达

利用DNA重组技术．将牛α-S1酪蛋白调控区基因(16kh的片段)与乙肝表面抗原基因拼接,构建了融合基因表达构件：λ106。构件经转基因技术转入山羊受精卵。待受精卵发育至成熟个体并分娩、泌乳,ELISA检测其乳汁中的HBsAg,证明所构建的牛α-S1酪蛋白基因表达构件是可以在羊乳腺中表达乙肝表面抗原基因,并将其表达产物分泌到乳汁中。     

牛α—s1酪蛋白基因3’端的克隆鉴定及序列分析

文用牛α—sl酪蛋白基因cDNA为探针,筛选了以EMBL3为载体构建的牛基因组文库2×10 5pfu,得到一个阳性克隆。分别以牛α—sl酪蛋白基因cDNA全长、终止符前后序列为探针鉴定了该克隆,制作了较为详细的限制酶谱,亚克隆了相应片段,并对含有终止符和poly A加成信号的有关亚克隆进行了序列分析,结果表明：该克隆含有牛α—sl酪蛋白基因终止符下游3．5kb及上游10．2kb片段,与现有的该基因的资料相比较,限制酶谱存在部分差异,DNA序列有多处点突变,并有少量缺失。点突变在内含子和外显子均有发生,这是限制酶图谱差异的原因。     

iNOS在不同种属血管细胞中诱导表达差异的比较研究

为了探讨不同种属血管细胞中ｉＮＯＳ基因诱导表达的差异及其分子机制,采用Ｎｏｒｔｈ－ｅｒｎ印迹、电泳迁移率改变分析（ＥＭＳＡ）和细胞转染实验对ｉＮＯＳ基因在人、牛、大鼠血管内皮细胞（ＥＣ）和兔、大鼠平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）中的诱导表达和转录调控机制进行了研究．结果显示,ＩＬ－１β可诱导人、大鼠的ＥＣ和大鼠的ＶＳＭＣ表达ｉＮＯＳ,但对兔ＶＳＭＣ和牛ＥＣ无诱导作用．在ＩＬ－１β＋ＴＮＦ－α＋ＬＰＳ作用下,人和大鼠血管细胞ｉＮＯＳ的表达活性显著高于牛和兔,同一种属动物的ＶＳＭＣ比ＥＣ更易被诱导活化．用含有大鼠ｉＮＯＳ基因上游－１０３７～－４３８片段的报告基因转染这些细胞,经细胞因子和ＬＰＳ处理后,被转染细胞的ＣＡＴ活性变化与细胞的ｉＮＯＳ表达活性相一致．上述结果表明,ｉＮＯＳ表达调节具有种属特异性和细胞特异性．ＥＭＳＡ证实在不同种属的ＥＣ和ＶＳＭＣ中,与ｉＮＯＳ基因表达调控区（－１０３７～－７８７）相互作用的蛋白因子是不均一的．提示不同种属血管细胞内特异转录因子的种类及浓度不同和（或）反式因子与顺式元件相互作用的方式不同可能是这种差异的分子基础．     

人皮肤成纤维细胞中α1(Ⅰ)前胶原基因转录调控研究

为寻找纤维化形成中调控人Ⅰ型前胶原基因高水平转录的启动序列及其DNA结合蛋白 ,以人皮肤成纤维细胞α1(Ⅰ )前胶原基因转录起始点上游 - 2 5kb至 + 4 2bp的片段为靶序列 ,采用PCR、基因重组、报告基因测活、细胞基因转染技术比较不同长短启动子活性 .凝胶滞留实验 (EM SA)研究高启动活性片段相应的DNA结合蛋白 .基因转染高活性转录因子识别序列至靶细胞 ,探讨前胶原基因激活阻断的新手段 .结果表明 ,- 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp序列具有强启动调控活性 ,而 - 10 5～ + 4 2bp片段启动活性最低 .EMSA对高启动活性小片段DNA结合蛋白的分析提示 ,- 2 6 8～ + 4 2bp序列中存在转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1的特异结合位点 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1至靶细胞可竞争性阻断胶原基因启动转录激活 .研究提示 ,人α1(Ⅰ )前胶原基因 - 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp片段有高启动活性 .转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1与 - 2 6 8～ + 4 2bp序列中相应识别序列的结合与其基础高转录活性有关 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1可从转录水平阻断胶原基因的激活     

山羊与牛乳腺差异表达基因的筛选及半定量RT-PCR分析

山羊和奶牛具有非常相似的泌乳过程,但在产乳量和乳成分(脂肪和蛋白含量)之间存在很大的差异,而且山羊奶还具有特殊的膻味。本研究根据山羊和牛在基因编码序列上具有非常高的保守性原理,利用抑制消减杂交技术对3只西农萨能奶山羊和3头荷斯坦奶牛泌乳末期的乳腺组织进行差异表达基因分析。分别提取山羊和牛乳腺组织总RNA,分离mRNA并合成cDNA,以山羊乳腺组织cDNA作为测试,牛的乳腺组织cDNA作为对照。cDNA经RsaⅠ酶切后将测试组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增。随机挑选克隆经PCR鉴定发现有150个克隆具有200bp-1000bp插入片段,挑选50个差异片段不等的克隆进行测序及同源性分析,结果得到5个已知乳蛋白(αs2酪蛋白、β酪蛋白、К酪蛋白、α乳清白蛋白和β乳球蛋白)基因的编码序列和6个新的EST序列,EST序列已登录GenBank,登录号分别为EG588067、EG588068、EG588069、EG588070、EG588071和EG588072。通过半定量RT-PCR分析,发现β酪蛋白基因mRNA表达量在山羊乳腺中显著高于其在牛乳腺中的表达量,К酪蛋白在乳腺中的mRNA含量与其所表达的蛋白质在乳中含量存在很大差异,表明К酪蛋白虽然和其他酪蛋白具有相同的调控机制,但其在分泌和运输机制上与其他酪蛋白不同。     

ERα的辅调节因子与乳腺癌关系的研究进展

雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）是配体依赖的转录因子,属于核受体超家族成员。ERα介导转录的经典途径是与雌激素结合后作用于靶基因启动子区的雌激素反应元件（estrogen response element,ERE）,进而诱导靶基因转录。ERα招募辅调节因子（共激活子和共抑制子）参与ERα介导的基因转录调控。辅调节因子主要通过乙酰化、磷酸化、甲基化等表观遗传机制参与转录调控,影响靶蛋白表达水平。ΕRα介导的基因转录调控在乳腺癌的增殖、分化、侵袭转移等过程中发挥重要作用。综述在ERα介导的基因转录调控中几类辅调节因子对乳腺癌发生发展的影响。     

连续3步基因抓捕构建牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座

目的:构建一个利用牛αS1酪蛋白基因座完整的上下游调控序列指导人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因组序列在乳腺特异性高效表达的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。方法:采用连续3步基因抓捕的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行3次基因抓捕的抓捕载体;然后,在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,第一步从含牛αS1酪蛋白基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆9 kb的牛αS1酪蛋白基因3'端侧翼序列到抓捕载体上,第二步从人tPA BAC上亚克隆17 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)的人tPA基因组序列,第三步从牛αS1酪蛋白BAC上亚克隆20 kb的牛αS1酪蛋白基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个长约46kb的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座中,原牛αS1酪蛋白基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被人tPA基因组序列精确置换。结论:连续三步基因抓捕构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了探索性研究。     

缺氧诱导因子1研究进展

缺氧诱导因子１（ＨＩＦ－１）在缺氧诱导的哺乳动物细胞中广泛表达,为缺氧应答的全局性调控因子。ＨＩＦ－１由ＨＩＦ－１α和ＨＩＦ－１β两亚基组成,为异源二聚体转录因子。ＨＩＦ－１α的ｂＨＬＨ和ＰＡＳ结构域与二聚化及ＤＮＡ结合活性有关,ＴＡＤ结构域则主要参与转录激 活。ＨＩＦ－１α的全长基因已克隆并在人和小鼠中定位。通过作用于靶基因的缺氧反应元件（ＨＲＥ０,ＨＩＦ－１参与缺氧诱导的一系列基因的表达调控。     

哺乳动物性别分化的调控

哺乳动物性别分化调控的分子机制的研究特别是性别分化的层次调控、剂量补偿和性染色体进化这三个领域,已取得快速进展。已经发现Ｙ染色体性别决定区基因（ＳＲＹ）、Ｘ染色体ＤＳＳ－ＡＨＣ决定区基因１（ＤＡＸ－１）、甾类生成因子１基因（ＳＦ１）和Ｗｉｌｍｓ瘤抑制基因（ＷＴ－１）等与哺乳动物性别决定有关。ＳＲＹ启动睾丸分化,但胚胎发育成雄性的其余步骤由事丸分泌的激素控制。ＤＡＸ－１且编码一种女性特异功能的蛋白质,它在男性中被ＳＲＹ所抑制。ＳＦ－１和ＷＴ－１在ＳＲＹ开启之前作用于性腺和肾上腺发育的启动。哺乳动物通过随机失活雌性两条Ｘ染色体中的一条来使Ｘ连锁的基因在两性间的表达水平达到平衡（剂量补偿）。Ｘ染色体失活由Ｘ染色体失活中心（ＸＩＣ）控制。失活的Ｘ染色体专一转录基因（ＸＩＳＴ）是ＸＩＣ的强烈候选者,它可能参与Ｘ失活的启动。对有袋目和单孔目动物性染色体的研究为我们提供了其进化的信息。有证据支持性染色体起源于一对同源常染色体,而ＳＲＹ的祖先基因可能是ＳＯＸ－３。     

参与植物次生代谢调控的转录因子及其在植物次生代谢遗传改良中的应用

转录因子与结构基因的结合,激活合成基因的表达是次生代谢物合成途径启动前的重要分子事件,对植物次生代谢起着十分重要的调节作用。转录因了可激活次牛代谢物合成途径中多个基因协同表达,从而有效启动次生代谢途径。因此,转录因子为揭示植物次生代谢调控机制提供重要工具,转录因子的基因工程可为植物次生代谢的遗传改良提供有效的手段。     

Gαq介导的信号通路增强RGS4蛋白表达

RGS(regulators of G protein signaling)是G蛋白偶联信号通路中一类重要的调节蛋白,通过加速Gα结合的GTP水解,即GAP(GTPase activating protein)活性,来中止G蛋白信号通路。RGS4是RGS蛋白家族中的重要成员之一,它能有效中止Gαq介导的信号通路。作者研究了Gαq蛋白对RGS4蛋白的表达调控。当在HEK293细胞中共转染这两个蛋白时,持续性激活的Gαq能特异性地显著增加RGS4蛋白的表达。蛋白降解实验结果证明这种增强作用与RGS4的降解被抑制无关,而与RGS4 mRNA表达增强有关。进一步克隆RGS4蛋白的启动子区域并研究其与RGS4表达相互关系的实验结果又表明,持续性激活的Gαq能够显著增强RGS4启动子区的转录活性,且具有时间和浓度效应。同时,转录因子结合区突变体实验证明,ICE(inverted CCAAT box element)转录因子结合区的突变显著影响RGS4基因的转录活性。以上结果表明Gαq可能通过RGS4的启动子区调控其基因的表达,促进RGS4蛋白表达。     

乙肝病毒表面抗原preS1与人肿瘤坏死因子α融合基因的表达

用ＰＣＲ法获得了ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（１－６５）肽段基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子（ｈＴＮＦα）之后,插入表达载体ＰＳＢ－９２中,使融合基因的５′端直接置于大肠肝菌ＰＬ启动子下游,采用３０℃培养,４２℃诱导,获得了ＴＮＦ与ｐｒｅＳ１（１－６５）融合蛋白的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为２５ｋＤ,约占细菌总蛋白的３５％。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证,能分别特异地与ｈＴＮＦα抗体与ｐｒｅＳ１抗体结合,稀释复性后,该融合蛋白还具有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ９２９细胞的细胞毒活性）。经ＤＮＡ序列测定,ｐｒｅＳ１（１－６５）肽基因正确地融合在ｈＴＮＦα基因之后。该结果提供了一种制备ｐｒｅＳ１的新方法,为进一步开展治疗肝癌和乙肝的导向药物打下基础。     

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子—目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子—Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果与结论利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。     

人分裂细胞核抗原基因片段的筛选、测序及对启动子的分析

经６．６×１０５个克隆筛选,从装在λ噬菌体载体Ｃｈａｒｏｎ３０中的人基因库中筛选到了一个含人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因的克隆。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析插入基因长约１４ｋｂ,有较长的５＇上游区,但３＇端缺少一部分。经亚克隆和测序已确定从５＇上游１２６３ｂｐ到３＇端与λ载体接点共４９６９ｂｐＰＣＮＡ基因片段的核苷酸序列。将ＰＣＮＡ基因启动子核苷酸序列与ＤＮＡ聚合酶α,拓扑异构酶Ⅱα,胸苷酸激酶基因的启动子进行比较有３０％以上同源性,具有“看家基因”特征。在转录起始点的５＇上游几百ｂｐ的范围内都有与ＣＡＴ,ＳＰ１,Ｅ２Ｆ,ＮＦＨＢ,Ｏｃｔ１和ＡＴＦ等转录因子的结合位点相似的核苷酸序列。