六妹羊肚菌多糖部分理化性质及抗氧化活性研究

分离纯化人工栽培的六妹羊肚菌子实体多糖,对其结构和抗氧化活性进行研究。采用水提醇沉法提取六妹羊肚菌子实体多糖(MSP),采用DE-52纤维素柱和Sephadex G-100进行多糖的分离纯化,借助HPGPC和HPLC测定多糖分子量及单糖组成。通过DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用,评估其体外抗氧化活性。构建H_2O_2介导的氧化压力损伤的PC12细胞模型,评估其基于抗氧化的神经保护作用。结果显示,六妹羊肚菌水溶性多糖平均分子量为287 588 Da,单糖组成为甘露糖,葡萄糖和半乳糖,占比约为9∶1∶6。六妹羊肚菌多糖具有优良的自由基清除活性,同时,能够通过重塑SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶系活性,缓解H_2O_2诱发的氧化压力的细胞损伤,抑制PC12细胞凋亡。涉及通路为Bax/Bcl及Caspase。六妹羊肚菌水溶性多糖具有优良的抗氧化活性,表现出一定的神经保护作用。     

梯棱羊肚菌≥0℃积温对其生长发育的影响

为研究≥0℃积温对梯棱羊肚菌Morchella importuna生长发育的影响,通过调查不同海拔种植的梯棱羊肚菌的生长发育,应用农业气象方法和统计法计算出其不同海拔≥0℃的气温积温和地温积温。结果显示,不同海拔种植的梯棱羊肚菌生育期存在差异,但其生育期≥0℃的气温积温和地温积温差异小。梯棱羊肚菌从播种到原基分化、子实体成熟、原基发育到子实体成熟≥0℃气温积温分别为(563±21)℃·d、(712±20)℃·d、(149±21)℃·d。离地表0cm、5cm、10cm不同深度≥0℃的地温积温有较大的差异,5cm深度≥0℃的地温积温可以作为其生长发育热量需求的参考,估计区间是：从播种到原基分化、子实体成熟、原基发育到子实体成熟分别为(741±36)℃·d、(915±46)℃·d、(174±23)℃·d。     

梯棱羊肚菌镉胁迫响应基因ATX1功能分析

梯棱羊肚菌Morchella importuna是一种可以大田覆土栽培的珍稀食用菌,而土壤重金属污染状况日益严重,对梯棱羊肚菌菌丝生长和子实体产品质量安全构成了潜在的威胁。本研究先采用镉离子胁迫处理梯棱羊肚菌菌丝体,RT-PCR检测发现候选基因ATX1的表达量显著下调。克隆梯棱羊肚菌ATX1基因,对ATX1p蛋白结构进行功能预测,发现ATX1p可能与铜离子转运及重金属胁迫相关。然后分别构建ATX1的超表达和RNAi基因沉默载体,采用农杆菌介导的转化方法,将其转入梯棱羊肚菌同核体菌株A50中,分别筛选到4个ATX1表达显著上调的超表达转化子和4个ATX1表达显著下调的RNAi基因沉默转化子,镉敏感性检测发现ATX1的RNAi基因沉默转化子表现为镉抗性增强,而ATX1超表达转化子则表现为镉抗性减弱。结果表明,梯棱羊肚菌ATX1基因表达与镉抗性呈负相关,ATX1p可能在梯棱羊肚菌镉胁迫响应过程中发挥着某种重要作用。     

川芎油对氯化钴损伤PC12细胞保护作用及其活性成分研究

综合运用硅胶、Sephadex LH-20柱色谱和半制备高效液相色谱等方法对川芎挥发油进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定化合物结构。利用氯化钴诱导PC12细胞建立神经损伤模型,通过MTT法、Hoechst染色法及乳酸脱氢酶试剂盒测定川芎及其单体成分对损伤神经细胞的保护作用。结果显示:从川芎挥发油中分离得到6个化合物,分别鉴定为riligustilide(1)、endo-Z,Z'-(3a.7a',7a.3a')-双藁本内酯(2)、匙叶桉油烯醇(3)、(E)-丁烯基苯酞(4)、7-羟基-丁烯基苯酞(5)和洋川芎内酯I(6)。发现川芎挥发油及化合物1显著提高氯化钴损伤的PC12细胞的存活率,降低细胞内乳酸脱氢酶水平,抑制PC12细胞凋亡。表明川芎挥发油及化合物1在一定浓度范围内具有保护神经细胞的作用,为进一步阐述川芎挥发油的药效物质基础提供科学依据。     

六妹羊肚菌的化学成分

以六妹羊肚菌Morchella sextelata为研究对象,对其子实体的化学成分进行研究。采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行子实体芳香物和亲脂性提取物的化学成分分析,同时对其亲脂性提取物的抗氧化和抗菌活性进行了初步评价;采用正反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱等多种色谱分离方法进行化学成分的分离纯化,并通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）等技术鉴定化合物结构。从六妹羊肚菌子实体的芳香物中共鉴定出26个化合物,辛-1-烯-3-醇（32.53%）、(E)-辛-2-烯醛（25.15%）和苯乙醛（12.31%）为主要成分;从六妹羊肚菌子实体的亲脂性提取物中共鉴定出14个化合物,亚油酸（77.80%）为主要成分;六妹羊肚菌亲脂性提取物仅显示出中等强度的抗氧化活性。从六妹羊肚菌子实体中共分离鉴定出14个化合物,包括7个甾体类化合物,其中化合物1、2、4、7、11、13和14为首次从羊肚菌属中分离得到。本研究首次对六妹羊肚菌的小分子化学成分进行了分析,对羊肚菌活性物质的阐明及进一步开发利用具有重要意义。     

苦荞多肽的纯化、结构与体外抗氧化活性研究CSCD

为了探究苦荞多肽粗提液抗氧化活性的主要来源,需要进一步对苦荞多肽进行分离纯化,通过结构鉴定来分析抗氧化活性与多肽结构之间的关系。该研究以苦荞功能提取物废渣为原料提取苦荞粗蛋白辅以植物乳杆菌发酵法制备苦荞多肽,采用大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶、液相色谱对苦荞多肽粗提液进行分离纯化,并以抗氧化活性为指标,筛选抗氧化活性较强的组分,利用液相色谱-质谱联用技术鉴定抗氧化多肽结构。结果表明,纯度不同的苦荞多肽抗氧化能力也不同,经过Sephadex G-15葡聚糖凝胶分离纯化得到的T-3组分ABTS和DPPH自由基清除能力最优,清除率分别为96%、94%。纯化后苦荞多肽的抗氧化活性显著高于粗提液(P<0.05),但是抗氧化活性并没有完全与苦荞多肽纯度呈正相关,通过液相色谱进一步分离纯化T-3组分后得到的组分T-3-1,苦荞多肽纯度虽然达到了98%,但是对DPPH和ABTS抑制率不再增强,反而稍有下降,抑制率分别为89%和90%。由质谱鉴定结果得到,主要抗氧化肽的氨基酸序列为苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸Phe-Pro-Tyr(FPY)和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸Tyr-Leu-Pro-Phe(YLPF)。研究结果以期为苦荞多肽的进一步开发利用提供一定的理论基础。     

猪脑类神经肽抑制因子的分离纯化和抗小鼠癫痫作用

本实验室以猪脑为原料,利用超滤,凝胶过滤层析和反相高效液相色谱等分离纯化方法,分离出一种小分子类神经肽抑制因子(Neuropeptide-like inhibitor,NPI),并进行生物活性和理化性质的初步研究。以MTT比色法检测NPI对噬铬细胞瘤(pheochromocytoma)PC12细胞生长的影响;建立戊四氮致小鼠急性癫痫模型,检测NPI体内活性;通过液相色谱法鉴定NPI相对分子量和氨基酸组成。结果表明NPI对PC12细胞生长具有抑制作用,并呈量效关系。动物模型实验显示小鼠初次惊厥时间明显延长(P<0.01),惊厥程度及死亡率明显下降(P<0.05),表明NPI具有体内抗惊厥活性。     

当归油化学成分及其神经保护作用研究

为研究当归油化学成分,及其对氯化钴诱导PC12神经细胞损伤的保护作用,采用硅胶柱层析、制备薄层层析和半制备高效液相色谱等方法对化学成分进行富集,并根据理化性质及波谱数据鉴定化合物结构。结合氯化钴损伤PC12神经细胞模型,利用MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)活力测定法,以及Hoechst染色法对当归油及单体成分进行活性评价。研究结果显示从当归油中共获得6个单体化合物,分别鉴定为匙叶桉油烯醇(1)、(-)-(S)-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-乙基甲基醚(2)、苯戊酮(3)、2,5-二羟基苯甲酸甲酯(4)、邻苯二甲酸单甲酯(5)、香草醛(6)。其中化合物2的构型为首次报道,化合物2、4、5均为首次从当归油中分离得到。活性评价结果为当归油和化合物2在一定浓度下均能显著提高细胞存活率,降低细胞内乳酸脱氢酶水平,抑制PC12细胞损伤性凋亡。本文通过对当归油化学成分及其神经保护作用研究,发现了活性先导芳香族化合物,为进一步阐明当归油神经保护作用奠定了物质基础,提供了科学依据。     

梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因的异源表达与生化鉴定

典型的漆酶通常属于辅助活性酶第一家族第一亚族（auxiliary activity family 1 subfamily 1,简称AA1_1家族）,而AA1_2家族的多铜氧化酶通常拥有将二价铁氧化成三价铁的活性,部分AA1_2家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因组只有一个AA1_2家族酶基因,该基因编码的酶蛋白是否拥有漆酶功能尚未清楚。本研究主要从酶生化特性的角度,结合酶基因的表达规律,对该基因的功能进行初探。对该AA1_2家族基因在梯棱羊肚菌生长发育不同阶段的表达水平进行实时定量PCR检测;将该基因编码序列克隆到表达载体中在大肠杆菌中异源表达,层析获得纯化的酶蛋白,对酶蛋白的生化特性进行了鉴定。发现该AA1_2多铜氧化酶基因在外源营养袋和土壤中的营养菌丝里低表达,在菇原基和子实体中表达较活跃。异源表达获得纯化的酶蛋白分子量约64kDa,表现出亚铁氧化酶（EC 1.16.3.1）与漆酶（EC 1.10.3.2）双重活性。其亚铁氧化酶活性在pH 4最高,漆酶活性在pH 6最高。亚铁氧化酶活性与漆酶活性的最适温度均为30℃左右,在30℃温育16h后仍保留70%以上活性。亚铁氧化酶和漆酶活性受Mn ²⁺、Hg ²⁺和Pb ²⁺抑制。对蛋白质变性剂SDS、尿素的耐受性较强。本研究通过酶学证据证实了梯棱羊肚菌AA1_2家族多铜氧化酶基因编码的酶蛋白具有亚铁氧化酶-漆酶双重活性,系在子囊菌大型真菌中首次发现,为进一步研究铁元素代谢与漆酶活性在羊肚菌子实体形成与发育过程中的作用提供了启示。     

纳豆中抗氧化肽的分离纯化与活性研究

从发酵的纳豆中提取具有抗氧化活性的多肽,通过分子筛层析和反相高效液相色谱对纳豆上清液进行分离纯化,并采用电喷雾串联质谱进行结构鉴定.结果表明:纳豆发酵后的蛋白(多肽)混合物经Sephadex G-50凝胶色谱进行分离纯化后得到3个组分(F1、F2和F3),其中组分F3的抗氧化活性最强,总还原力达到(8.4±0.6)mm...     

骨髓基质干细胞对MPP+制备的PC12细胞凋亡的影响

目的探讨BMSCs分泌物对MPP^＋诱导的PC12细胞凋亡的保护作用。方法在体外培养、纯化BMSCs并收集其培养上清,流式细胞术分析PC12细胞的凋亡率;通过免疫细胞化学法和RT-PCR法检测PC12细胞bcl-2和TH在蛋白和mRNA水平的表达。结果BMSCs可在体外分离扩增,其表面抗原CD44阳性而CD45阴性,流式细胞术检测显示BMSCs上清液组加MPP^＋处理组（联合组）细胞凋亡率低于MPP^＋损害组;免疫细胞化学法和RT-PCR法显示联合组的bcl-2和TH蛋白和mRNA水平与MPP^＋损害组相比明显增加。结论BMSCs能分泌多种对退变多巴胺能神经元有保护作用的神经营养因子,因此BMSCs对MPP^＋诱导的PC12细胞凋亡有保护作用,其保护作用的强弱与BMSCs上清液浓度有关,其作用机制可能是通过上调bcl-2来实现的。     

重组GIP蛋白的原核优化表达及其生物活性的研究

葡萄糖依赖性促胰岛素多肽或抑胃肽(glucose-dependentinsulinotropicpolypeptideorgastricinhibitorypeptide,GIP)是由42个氨基酸组成的胃肠调节肽,在高血糖背景下能够刺激胰岛素释放,能够抑制胃酸分泌、促进神经细胞增生,具有广泛的临床应用价值.化学提取或人工合成GIP,成本过高,不宜规模化生产,故应用基因工程技术研制重组人GIP(rhGIP)并探讨其生物活性有积极的现实意义.人工合成具有大肠杆菌偏爱密码子的编码GIP成熟肽的cDNA序列,利用pET32a( )系统进行原核表达;在小规模发酵条件下,进行优化诱导表达和目的蛋白的亲和纯化;通过检测SD大鼠胃酸分泌和血糖浓度,对纯化后的rhGIP进行生理活性研究;通过形态学观察和培养基中NO含量测定,检测rhGIP对PC12细胞NO自由基生成量的影响;应用Aβ25-35加入培养基造成PC12细胞神经损伤模型,分别以高、中、低剂量rhGIP作用于此模型,通过MTT(2-(4,5-dimethylthia-zol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)法测定PC12细胞的活性.结果显示,成功克隆了人GIP基因,诱导表达的rhGIP占细胞总蛋白质的35%,部分可溶,部分以包涵体形式存在.经过诱导表达的重组蛋白质分子质量约为26ku,与理论值相符.纯化后的rhGIP具有免疫活性.优化诱导表达条件为表达菌生长密度A600值0.50,IPTG浓度0.5mmol/L,温度37℃,诱导表达时间4h.裂解上清液经固定化金属亲和层析一步法层析后,表达的水溶性rhGIP融合蛋白的最后得率为1.2mg/L菌液,纯度为85%.纯化后的rhGIP能够使SD大鼠胃液pH值增高,其抑制胃酸分泌作用与生理盐水对照组比较差异有显著性(P<0.05),而rhGIP组和标准品GIP组比较差异无显著性.在高血糖背景下,注射rhGIP15min后,大鼠血浆血糖浓度较基础血糖显著降低(P<0.05),30min时与单独注射葡萄糖的模型对照组比较,差异无显著性,而rhGIP组和标准品GIP组其差异不显著.在rhGIP对神经细胞的营养和对PC12细胞免受神经损伤和缺氧损伤影响的研究中发现,用rhGIP培养PC12细胞32h后,rhGIP组NO含量极显著低于正常对照组(P<0.01),细胞存活较多,神经突起延伸较好,中、高剂量rhGIP组均较神经损伤和缺氧损伤组活性显著升高(P<0.05),且细胞活性呈剂量依赖关系,rhGIP组与标准品GIP组差异不显著,与正常对照组亦无显著差异.研究结果表明,已得到高效表达的rhGIP融合蛋白,该蛋白质具有免疫活性,具有抑制胃酸分泌和降低大鼠血浆血糖浓度的生理活性,并且对神经细胞有营养和保护作用.     

多肽的分离纯化技术研究进展

随着各种活性多肽的发现,多肽分离纯化技术的研究和开发日益受到专家的关注。介绍多肽的理化性质与活性,讨论分离多肽的色谱、层析、电泳、膜、萃取等技术的特点和方法,并展望多肽的分离纯化前景,旨在为多肽的分离纯化提供参考。     

草菇子实体多肽的分离纯化及其结构分析

采用碱性蛋白酶酶解提取草菇子实体多肽,透析法对其进行分离纯化得到3-10、1–3及1 kDa以下3种多肽组分,比较3种组分的体外抗氧化活性。用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)、紫外吸收光谱、傅里叶红外光谱和氨基酸的测定方法表征纯化后多肽结构。结果表明,1–3kDa组分的抗氧化活性最强,其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率达到99.81%,铁离子自由基还原能力为1.47, 2,2′-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS+]自由基和羟自由基的清除能力分别达到99.15%、99.34%。此分子量的草菇抗氧化肽的总蛋白含量为71.12%,灰分含量为12.75%,水分含量为8.44%,其他为7.69%。经鉴定表明草菇子实体多肽是一种优质蛋白质。     

BDNF RNA干扰在多巴胺能PC12细胞凋亡中的作用研究

目的：探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）在PC12细胞凋亡中的作用。方法：设计并合成针对BDNF mRNA序列的小片段干扰RNA（siRNA）,利用lipofectamine 2000将siRNA转染入PC12细胞中或给与6-OHDA损伤,给与/不给予BDNF蛋白保护,采用定量PCR和免疫荧光法检测BDNF mRNA和蛋白表达水平;采用上清液乳酸脱氢酶（LDH）释放量测定和流式细胞仪法检测siRNA对细胞凋亡的影响。结果：转染siRNA的细胞的BDNF mRNA的表达量比正常组细胞减少73%,而转染作为对照的scrambled siRNA的细胞的BDNF mRNA的表达没有明显变化。BDNF RNA干扰与6-OHDA神经毒性一样可诱导PC12细胞的LDH释放和细胞凋亡。给予BDNF蛋白保护后细胞毒性减轻。结论：BDNF基因下调可以导致PC12细胞的凋亡,BDNF蛋白对PC12细胞有保护作用,为进一步进行动物体内研究奠定了基础。     

重组EpoAB-NGF模拟肽的神经营养功能

目的:研究重组融合蛋白红细胞生成素AB肽-神经生长因子模拟肽(EpoAB-NGF9和EpoAB-NGF/12)的神经营养作用。方法:构建pET-42a-EpoAB-NGF9/12原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,显微镜观察PC12细胞诱导分化,流式细胞仪检测凋亡细胞。结果:大肠杆菌表达的重组融合蛋白GST-EpoAB-NGF9/12分子量约为30kDa,抗GST抗体免疫印迹反应呈阳性。融合蛋白可以诱导PC12细胞分化,促进轴突生长。R2L1细胞去血清培养,凋亡细胞占(31.7±0.60)%,去血清后加入融合蛋白GST-EpoAB-NGF9/12,细胞凋亡率分别为(25.2±3.52)%、(25.7±1.46)%,呈现一定程度的抑制细胞凋亡的活性。结论:重组EpoAB-NGF模拟肽融合蛋白具有与NGF类似的神经营养作用。     

基于等电聚焦-反相HPLC的虎纹捕鸟蛛毒素组学的初步研究

虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)是中国最毒的蜘蛛之一.已有研究表明,其粗毒中含有丰富的低分子量(<10 kD)多肽活性成分.为分析这些成分, 利用目标蛋白快速分离系统(ProteomeLab PF 2D)建立了一种新的二维液相色谱分离方法.该方法包括一维的基于蛋白质等电点(pI)的色谱聚焦分离和二维利用无孔硅胶反相柱的基于疏水性的高效液相色谱分离.得到的反相图谱通过仪器配套的ProteoVue软件转换成与凝胶电泳图像相似的pI/UV图,以更直观地显示多肽成分的数量、分布规律及相对丰度等.洗脱的多肽自动收集后用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱进行分析.从一维分离的11个馏分(pH 4.53-8.59)中共检测到大约600个多肽条带.通过质谱分析测得130个多肽的精确分子量,同时通过De novo测序得到26种多肽(其中包括12种已知多肽)的部分序列信息,并利用这些序列信息对未知多肽进行了生物信息学分析.     

广西眼镜蛇毒神经生长因子分离纯化方法

为了得到更高纯度和活性的广西眼镜蛇毒神经生长因子(never growth factor,NGF),我们对原有的分离纯化方法进行改进。采用DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱结合的方法进行分离。在分离纯化过程中,采用PC12细胞检验每一步所得结果中的NGF活性,并测定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度。经DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱分离纯化后,得到的第二峰具有NGF活性,并且已达到电泳纯。经PC12细胞验证后,确定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度为0.1μg/m L。     

菟丝子提取物对活性氧引起已分化的PC12细胞损伤的保护作用

以常用的神经嗜铬细胞瘤PC12细胞株为实验模型,通过比较活性氧(ROS)作用细胞后的细胞活力、凋亡相关蛋白(p53、Bax)水平以及细胞中SOD、GSH、MDA的差异,发现菟丝子提取物不仅能提高ROS损伤的已分化PC12细胞活力,调节细胞中凋亡相关基因的表达,而且还能提高细胞中SOD和GSH的含量,降低MDA水平。由此表明,菟丝子提取物对ROS造成的PC12细胞损伤有一定的保护作用。     

梓醇对氧糖剥夺诱导PC1 2 细胞凋亡的保护作用

目的：观察梓醇对氧糖剥夺（OGD）诱导PC12细胞凋亡的保护作用。方法：采用Hoechst 33258 DNA染色法,四甲基偶氮唑盐（MTT）检测细胞活性;化学比色法测定乳酸脱氢酶（LDH）的释放量,用流式细胞技术检测细胞凋亡比例以及P53和Bcl-2蛋白。结果：OGD可导致PC12细胞活力明显下降,LDH释放量增加、P53蛋白表达上升,Bcl-2蛋白表达下降。梓醇可明显改善细胞形态结构,显著降低LDH释放量、降低P53蛋白的表达,提高Bcl-2蛋白的表达,降低细胞凋亡率。结论：梓醇通过调节细胞凋亡相关基因的表达而抑制细胞凋亡。