氧化磷酸化作用和有关问题的研究 Ⅳ.内源还原烟酰胺核苷酸对琥珀酸氧化的抑制

鼠肝线粒体加入Amytal与异柠檬酸或柠檬酸后琥珀酸的氧化即受到抑制。琥珀酸氧化的抑制不能为DNP、双香豆素或砷酸盐所解除。其它与烟酰胺核苷酸有关的脱氢酶的底物如α-酮戊二酸、苹果酸、丙酮酸、谷氨酸、β-羟基丁酸等与Amytal同时加入时并不引起琥珀酸氧化的抑制。当琥珀酸氧化被Amytal加异柠檬酸抑制后加入维生素K_3或α-酮戊二酸与氯化铵抑制即被解除,说明琥珀酸氧化的抑制可能与异柠檬酸脱氢生成的NADPH有关。在不加ADP与无机磷酸盐的条件下,高浓度的Amytal激活琥珀酸的氧化。但被Amytal激活的琥珀酸的氧化也被异柠檬酸或柠檬酸所抑制。     

鱼藤酮对线粒体胆碱-细胞色素c还原酶的抑制

鱼藤酮对新鲜鼠肝线粒体胆碱-细胞色素c还原酶有抑制作用。这种抑制受鱼藤酮与线粒体预保温的影响,然而并不是继发于胆碱的氧化产物三甲铵乙醛的氧化受抑制的结果。另一方面,鱼藤酮与其他呼吸链抑制剂如5乙,5异戊巴比妥酸钠、氰化钾等不同,它有抑制线粒体膨胀的作用。鱼藤酮抑制线粒体胆碱-细胞色素c还原酶的作用很可能与它对线粒体膨胀的抑制有关。     

关于光合作用光系统Ⅱ(PS-Ⅱ)电子传递的研究

在菠菜叶绿体和光系统Ⅱ颗粒中,DCIP和铁氰化钾的光还原对DCMU或Tris洗涤的抑制作用反应不同,其影响取决于pH(Tris)和浓度(DCMU)。在Tris的pH为8.0时,叶绿体和光系统Ⅱ颗粒的DCIP光还原全部被Tris(0.8M)洗涤抑制,而仍保留有少量残留的铁氰化钾光还原活力。在正常的叶绿体中,DCMU在5×10~(-5)M和5×10~(-4)M的浓度下,DCIP的光还原活力全部丧失,而铁氰化钾的光还原活力分别保留11.5％和10.8％。用Tris洗过的叶绿体,当DCIP的光还原活力被5×10~(-6)M,5×10~(-5)M和5×10~(-4)M的DCMU全部抑制时,铁氰化钾的光还原活力分别保留有对照的14.l％,15.0％和13.5％。在正常的光系统Ⅱ颗粒中,DCIP的光还原全部被5×10~(-6)M和5×10~(-5)M的DCMU抑制,而分别保留有13.8％和11.7％残留的铁氰化钾的光还原活力。用Tris(pH 7.6,0.8M)洗涤过的光系统Ⅱ颗粒,在5×10~(-7)M和5×10~(-6)M DCMU浓度下,残留的铁氰化钾光还原活力是26.2％和19.2％,而DCIP的光还原全部被抑制。 Tris洗涤过的或DCMU处理过的叶绿体和光系统Ⅱ颗粒残留的铁氰化钾光还原活力在短波光(651毫微米)下比在长波光(714毫微米)下高。讨论了光系统Ⅱ中可能包含有两个短波光反应。     

胆碱脱氢酶的N端氨基酸序列测定

采用SDS-PAGE凝胶电泳及电转移方法,将增溶的鼠肝线粒体胆碱脱氢酶进一步纯化,且去掉增溶线粒体胆碱脱氢酶(CDH)中所包含的大部分磷脂、去垢剂、辅基FAD等. 对进一步纯化的CDH进行了N端氨基酸序列测定,得到CDH N端10个氨基酸残基序列为VAAAAGGGKD,这一部分序列与小鼠CO5蛋白(即补体C5的前体蛋白)、大鼠腺苷酰(基)环化酶(adenylyl cyclase)、人甾体结合蛋白(oxysterol-binding protein)有很高同源性,但与大肠杆菌CDH并无明显的同源性.     

大黄蒽醌衍生物对酪氨酸酶的抑制作用

大黄素对酪氨酸酶有显著的竞争性抑制作用,K_i值为1.51×10~(-4)mol,50％抑制的药物浓度为36.6μg/ml;大黄酸的抑制作用较弱,芦荟大黄素几乎无抑制作用。氯化铜(3.3×10~(-7)mol/L)、半胱氨酸(3.3×10~(-7)mol/L)和牛血清白蛋白(1.0mg/ml)对大黄素抑制酪氨酸酶有较强的拮抗作用,恢复率分别为60.0％、45.7％和61.1％。大黄素能与牛血清白蛋白非特异性结合形成复合物,引起吸收光谱红移55毫微米。大黄蒽醌衍生物对酪氨酸酶的抑制作用可能是大黄抗黑色素瘤的作用机制之一。     

肝线粒体琥珀酸氧化机制的研究

(1)DNP对于琥珀酸氧化的影响随浓度不同而异,低浓度时,呼吸受激活,其程度随浓度升高而增強,不出現抑制現象。高浓度(30μM以上)DNP只引起短时間氧化激活,随即引起抑制,随浓度升高,抑制出現愈早,氧化激活愈小,預先加入Amytal足以防止上述抑制現象,在抑制出現后加入Amytal亦能使琥珀酸氧化部分恢复。(2)砷酸盐激活的琥珀酸氧化仅在有Amytal的条件下,才出現抑制現象。(3)ATP对上述两种情况引起的琥珀酸氧化抑制都具有一定的解除作用。(4)就实驗結果所做分析支持琥珀酸氧化需要能量激活的看法。     

去垢剂对线粒体内膜胆碱脱氢酶的增溶

五种去垢剂都能够增溶鼠肝线粒体胆碱脱氢酶,但是其中TritonX-100、Lubrol WX和Brij58等非离子型去垢剂对脱氢酶活力有抑制作用,抑制呈混合型。另一方面增溶的胆碱脱氢酶在去氧胆酸钠和胆酸钠等阴离子去垢剂溶液中则容易失活。线粒体经过冻化或在增溶时提高离子强度可以提高去垢剂的增溶效果,因而降低所需去垢剂的浓度。     

酪氨酸对人离体滋养层细胞孕酮与hCG分泌的影响

本文观察三种剂量(2×10~(-5)mol/L,2×10~(-4)mol/L和2×10~(-3)mol/L)的酪氮酸对离体培养的滋养层细胞孕酮及hCG分泌的影响,并对其抑制效应的机理作了初步探讨。实验结果表明,三种剂量的酪氨酸均可抑制滋养层细胞孕酮分泌(P<0.01),但是,在孕酮分泌受酪氨酸抑制的同时,未见对hCG分泌发生影响(P>0.05),进一步观察了酪氨酸对滋养层细胞3β-羟甾脱氢酶活性的影响,结果表明,酪氨酸能显著抑制3β-羟甾脱氢酶活性,提示酪氨酸对滋养层细胞孕酮生成的抑制作用与抑制3β-羟甾脱氢酶活性有关。     

粘虫胆碱酯酶的研究

本文研究了用Asch-DTNB比色法测定粘虫胆碱酯酶活力的方法。其反应的最佳条件是:反应时间为10～20min,反应温度为30℃左右,pH为7.5左右。敌敌畏和灭多虫对粘虫胆碱酶的K_i值分别为2.4×10~(-5)mol~(-1)min~(-1)和6.53×10~(-4)mol~(-1)min~(-1)。     

麻黄碱对小鼠输精管平滑肌的作用

麻黄碱(2×10~(-4)-1.6×10~(-3)M)和去甲肾上腺素(6×10~(-7)-7.5×10~(-5)M)均能引起并增强离体小鼠输精管自发性收缩。酚妥拉明(10~(-6)M)可明显对抗麻黄碱的作用。小鼠经利血平处理后,输精管对去甲肾上腺素的反应有所增强,但不明显影响麻黄碱的作用。在半钙营养液(含CaCl_21.25mM)中,麻黄碱的作用明显减弱;在无钙溶液中作用完全消失。但去甲肾上腺素的作用在半钙营养液中不明显减弱;无钙溶液中仍有大部分标本对去甲肾上腺素产生微弱反应。钙道阻断剂戊脉安可明显减弱或取消麻黄碱兴奋小鼠输精管的作用,而对抗去甲肾上腺素的作用较弱。麻黃碱在较低浓度(5×10~(-7)-1.6×10~(-5)M)时,尚能抑制输精管对电场刺激所致收缩反应,这种抑制作用可被α_2受体对抗剂育亨宾(10~(-7)M)所对抗。降低营养液中钙离子浓度,可增强麻黄碱的抑制作用。高浓度麻黄碱完全抑制电场刺激所致收缩,而出现明显增强的自发收缩。以上表明,麻黄碱对小鼠输精管突触前膜α_2受体和突触后膜α_1受体都有激动作用。麻黄碱引起并增强输精管平滑肌收缩的作用,主要是其对突触后α_1真受体的直接作用,并需要有钙离子的参与。     

麻黄碱对兔主动脉和心房作用机制的研究

麻黄碱(E,×10~(-4)—3.3×10~(-3)M)和去甲肾上腺素(NA,6×10~(-8)—6×10~(-5)M)均能引起离体兔主动脉条浓度依赖性收缩。可卡因能明显地增强 NA 的作用,但明显地减弱麻黄碱的作用,用可卡因后麻黄碱的作用为用可卡因前的10—92.6%。利血平处理后,麻黄碱和 NA的作用都明显增强,但利血平对前者的增强作用比后者更甚。在利血平处理及未处理肌条上,麻黄碱的作用均可被酚妥拉明阻断。麻黄碱(3.3×10~(-6)—3.3×10~(-5)M)和异丙肾上腺素(ISP,10~(-9)—10~(-5)M)均能引起离体兔心房率的增加。可卡因明显地减弱麻黄碱的这一作用,即为对照组的8.8—29.1%,但不影响 ISP 的作用。利血平处理后,麻黄碱对兔心房的作用也明显减弱,为对照纽的15.4—28.4%;而 ISP 作用则略增加。3×10~(-4)麻黄碱可明显增加[3~H]NA 从兔主动脉条的流出量,此作用在给药后5min内即开始,可持续30 min 以上。上述结果提示,对于兔主动脉和心房,麻黄碱兼具直接作用于效应器细胞和通过释放末梢中 NA 的间接作用;直接作用在主动脉占优势,间接作用在心房占优势。     

运动神经末梢的突触前M-胆碱受体是兴奋性的还是抑制性的?

Gangul等曾发现,M-激动剂oxotremorine可使大鼠膈神经-膈制备(phrenic nerve-diaphragm preparation)的ACh释放增加,而M-阻断剂阿托品则使之减少。然而,Abbs等最近在类似的实验中却得到截然不同的结果。他们将成年Wistar大鼠的膈神经-膈制备与[~3H-甲基]-胆碱共同孵育后测定了阿托品和oxotremorine对该制备释放ACh的影响。发现阿托品(10~(-6)-10~(-5)M)不影响静息情况下ACh的释放,但阿托品(10~(-5)M)可增强电刺激引起的ACh释放;oxotremorine(10~(-5)M)对静息时及电刺激引起的ACh释放均无影响;阿托品(10~(-5)M)与oxotremorine(10~(-5)M)     

赤小豆抑制剂对胰蛋白酶不可逆抑制作用的动力学探讨

本文从中药赤小豆(Phaseolus Calcaratus,Roxb)中分离出一种胰蛋白酶抑制剂。通过一系列酶促反应动力学的研究表明,赤小豆抑制剂对胰蛋白酶有较强的不可逆竞争性抑制作用。其Km和ki值分别为1.43×10~(-3)mmol/L和2.4×10~(-6)mmol/L。     

固相二抗放射免疫法测定表皮生长因子

本实验制备的兔抗鼠表皮生长因子(EGF)抗血清放免效价为1:10~6,抗体的特异性强,亲和常数K为8.29×10~(-10)mol/L,最大结合容量B_(max)为2.61×10~(-10)mol/L。在固相二抗放射免疫法测定中,0.1～100ng的EGF可以竞争性抑制~(125)I-EGF的结合,Logit分析相关系数为-0.993,低限检出量为0.5ng/ml。本方法的回收率及变异系数分别为92％～102％和5.7％～7.0％。应用此方法测定小鼠颌下腺中EGF的含量约为0.66mg/g腺体。     

胆碱脱氢酶的动力学性质

本文对增溶胆碱脱氢酶的稳态初速度及产物抑制动力学做了。底物胆碱和ＰＭＳ的相互影响：变化一个底物的浓度,另一个底物的Ｋｍ及Ｖｍａｘ均变化。该酶的产物三甲胺 地 制表现为对底物胆碱非竞争性而地ＰＭＳ竞争性,在胆碱饱和的情况下,三甲胺乙醛对酶的抑制仍表现为对ＰＭＳ竞争性。这些结果表明增溶胆碱脱氢酶的催化机制搂双底物双产物乒乓机制。１－ＰＣ与９－ＡＣ对增溶胆碱脱氢酶均有抑制作用,且均为混和型抑制,Ｋ１分别     

迷迭香酸对羟自由基所致小鼠肝线粒体损伤的保护作用

探索迷迭香酸对羟自由基致小鼠肝脏线粒体氧化损伤的保护作用。采用羟自由基(.OH),诱导小鼠肝线粒体损伤后,通过测定线粒体肿胀度、膜流动性、丙二醛(MDA)含量及琥珀酸脱氢酶(SDH)活性等指标以确定迷迭香酸对小鼠肝线粒体羟自由基损伤的保护作用。结果迷迭香酸剂量依赖地抑制线粒体肿胀,提高膜流动性,降低MDA的生成,增强SDH活性,差异显著。本实验证明迷迭香酸可以抑制.OH所致的线粒体损伤。     

双氢青蒿素对人白血病细胞K562增殖及凋亡的影响

目的:研究双氢青蒿素对人白血病细胞增殖及凋亡的作用,探讨其对白血病的作用机制,为进一步研究提供依据。方法:体外培养K562细胞,用细胞计数法绘制生长曲线;流式细胞仪及荧光显微镜检测药物作用前后细胞凋亡作用;Western-blot测定药物作用前后线粒体、细胞浆细胞色素c的表达。结果:双氢青蒿素的浓度为1×10~(-4),1×10~(-5),1×10~(-6)l/L时,细胞生长受到显著抑制,并呈剂量依赖性;流式细胞仪检测出凋亡峰;Hoechst33342/PI双荧光染色可观察到明显的核浓缩、凝集等细胞凋亡表现;Western-blot检测1×10~(-5)mol/L药物处理细胞后线粒体细胞色素c表达水平下调1,细胞浆出现明显细胞色素c蛋白奈带。结论:双氢青蒿素能显著抑制人白血病细胞K562的生长,并诱导其凋亡,可能与线粒体途径有关。     

乙酸苯汞对棉花气孔开放、蒸騰作用和光合作用的影响

1.以1×10~(-4)、3.3×10~(-4)和10×10~(-4)M三种浓度的乙酸苯汞(PMA)分别喷洒在棉叶上,1小时后即可使气孔接近完全关闭,这种影响3、5日后消失。 2.用PMA处理的叶片,蒸腾作用显著降低。浓度越高,影响越大;而作用的时间也越长。10×10~(-4)MPMA处理的叶子,19天以后还比对照部位的蒸腾作用降低约10％。 3.3.3×10~(-4)M PMA对光合作用的影响不太明显。浓度为10×10~(-4)M时,初期的影响也不大;但3日后使光合作用降低1/3,叶缘素的含量也下降;甚至处理后的第10天,处理部位的光合作用强度仍然显著地比对照低。 4.对PMA作用的性质、使用的适宜浓度以及存在的问题提出了初步的讨论。     

中华眼镜蛇毒膜毒素对鼠肝线粒体膜的作用位点的研究

中华眼镜蛇毒膜毒素C(MT-C)对鼠肝完整线粒体的呼吸有明显抑制作用,但不影响完整线粒体的氧化磷酸化活力以及线粒体碎片上F_1-ATP酶的活力表现。根据膜毒素(MT-C)明显地抑制Ca~(++)诱导下的线粒体6态呼吸速度和质子释放,本文认为膜毒素(MT-C)在鼠肝线粒体上的真正作用位点可能位于内膜上Ca~(++)的结合位点附近,而不在呼吸酶系或磷酸化酶系本身。     

日本血吸虫苹果酸脱氢酶的研究

本文报告了日本血吸虫存在苹果酸脱氢酶与延胡索酸酶。在采用的实验条件下(苹果酸钠,0.02M;细胞色素c,1×10~(-5)M;磷酸盐缓冲液,0.01M,pH 7.4)测定了血吸虫匀浆的酶活力。合抱成虫的酶活力为:氧耗量Q_o(?)=4.5微升氧/毫克氮量/小时;草酰乙酸产生量(以丙酮酸测定值表示)Q_p=O.26微克分子丙酮酸/毫克氮量/小时;延胡索酸产生量Q_F=2.5微克分子延胡索酸/毫克氮量/小时。当雌雄虫分别测定时,在等氮量基础上,雌虫酶活力较雄虫者为高。当苹果酸钠用作底物时,合抱成虫的氧耗量可因加入谷氨酸钠及NAD而增高110%。于此同时,用纸层析法证明血吸虫之苹果酸脱氢酶可与谷-草转氨酶相互联系而产生天门冬氨酸。加入NAD可使合抱成虫的氧耗量增高30%,同时发现有相当量乳酸产生(Q_L=0.44微克分子乳酸/毫克氮量/小时)。以上结果表明在血吸虫匀浆存在苹果酸脱氢酶与乳酸脱氢酶的交互作用。此外,研究了虫苹果酸脱氢酶的可逆作用。借助于虫自身的乳酸脱氢酶使加入的NAD还原为NADH,然后此NADH又可将底物草酰乙酸还原。在以上情况下,用纸层析法鉴定其产物为苹果酸及延胡索酸。二巯基丁二酸锑钠(Sb-58)在最后浓度为10~(-3)M及10~(-4)M时,分别抑制血吸虫苹果酸脱氢酶活力约65%及30%。甲状腺素及中酒石酸对该酶均呈抑制作用。酒石酸锑钾在10~(-3)M时对酶活力无显著影响。