NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

一氧化氮和氧自由基诱导缺氧再给氧心肌细胞凋亡的bcl-2和p53信号通路研究

观察了心肌缺氧再给氧损伤的一氧化氮(nitric oxide, NO)和氧自由基机制. 新生Wistar大鼠心肌细胞置于95% N₂ /5% CO₂环境培养24 h, 然后置于95% O₂ /5% CO₂环境培养4 h造成缺氧再给氧心肌细胞损伤模型. 单纯缺氧组心肌细胞置于95% N₂/5% CO₂环境培养24 h, 但不再给氧. NO供体硝普钠(SNP, 5 mmol/L)、NO合酶抑制剂Nw-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME, 100 mmol/L)和其异构体Nw-硝基-D-精氨酸甲酯(D-NAME, 100 mmol/L)以及超氧化物歧化酶/过氧化氢酶(SOD/CAT, 各100 U/mL)分别于缺氧前加入培养基. 正常对照组心肌细胞置于95% 空气/5% CO₂环境下培养. 结果显示, 缺氧24 h能增加培养介质中NO, 硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和乳酸脱氢酶(LDH)水平, 再给氧降低培养介质中NO和 水平, 增加TBARS和LDH水平. 缺氧上调bcl-2和p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 而再给氧下调bcl-2蛋白表达水平, 上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平. 同时, 缺氧增加心肌细胞凋亡率, 而再给氧增加心肌细胞坏死率. NO供体硝普钠(SNP)增加培养介质中 和TBARS水平, 下调bcl-2蛋白表达而上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 增加DNA断裂、凋亡及坏死细胞率. L-NAME和 SOD/CAT分别降低培养介质中 和TBARS水平, 它们均能上调bcl-2蛋白表达而下调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 抑制DNA断裂、凋亡及坏死细胞率, 而D-NAME则无此作用. 以上结果表明, 在缺氧再给氧所致心肌细胞死亡过程中, NO和氧自由基参与下调bcl-2蛋白表达水平和上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 相应地激发细胞凋亡程序, 并提示一氧化氮及氧自由基诱导心肌细胞凋亡的机制与调节 bcl-2和p53和p21/waf1/cip1信号通路有关.     

amrG1基因在谷氨酸棒杆菌乙酸活化中的作用

谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum可以利用乙酸为碳源和能源进行生长. 乙酸代谢中涉及乙酸活化的两个酶为磷酸转乙酰酶PTA和乙酸激酶AK, 它们是由pta-ack操纵子经诱导表达产生的. 采用转座子挽救法, 我们从调控突变株C. glutamicum G25中获得了amrG1和amrG2两个目标基因. 经分析鉴定, amrG1基因(NCBI GenBank 接受号为AF532964)可能参与乙酸代谢调控, 编码作用于pta-ack操纵子的一个调控因子. 该调控因子基因序列全长732 bp, 开放阅读框含有243个氨基酸, 分子量约为27 kD. 通过基因定点缺失和过量表达技术, 在谷氨酸棒杆菌野生型菌株中分别构建了amrG1基因缺失菌株和表达菌株, 并研究了它们在含有葡萄糖和/或乙酸不同碳源的基本培养基上生长时产生的PTA和AK酶活性特征. 酶活性测定结果发现其中的amrG1基因缺失菌株和表达菌株存在着与野生型菌株不同的一系列酶学特征, 分析显示: 以野生型菌株为对照, amrG1基因缺失菌株在含有葡萄糖碳源的培养基上生长时表现出较高的PTA和AK酶活性, 并且在葡萄糖和乙酸两种碳源上生长时表现出与乙酸碳源上生长时几乎同样的PTA和AK酶活性; amrG1基因过量表达对葡萄糖碳源上生长产生的PTA和AK酶活性有一定程度的抑制, 即表现出与基因缺失情况相反的调控效应. 根据以上结果分析, amrG1可能编码了作用于pta-ack操纵子的一个阻遏因子或共阻遏因子.     

水稻寡分蘖突变体的遗传分析和基因定位

从籼粳交组合“圭630/02428”的花培后代中获得一份寡分蘖突变体G069,其主要特征是分蘖速度慢,最高分蘖数少,成熟叶片叶尖、叶缘黄化.用突变体作母本与02428杂交,并以02428作轮回亲本与杂交后代突变型单株回交构建BC₂F₂.对BC₂F₂进行调查和遗传分析,确认突变体G069寡分蘖特性和叶片黄化现象受同一隐性基因控制.以BC₂F₂分离群体为基础,应用SSR标记和RFLP标记进行连锁分析,将寡分蘖基因定位于第2染色体的RFLP标记C424和S13984之间,分别相距2.4和0.6cM.该基因暂定名为ft1.     

TFAR19基因对小鼠红白血病MEL细胞生长及其流变学特性的影响

通过脂质体介导基因转染的方法, 获得了稳定携带TFAR19基因的小鼠红白血病细胞系MEL-TF19. 经Western blot证实该细胞系有TFAR19蛋白表达. 生长曲线及流式细胞仪检测结果表明, 转染TFAR19基因后MEL细胞生长受到抑制, 并且在凋亡诱因的存在下使细胞凋亡率增高. 流变学研究结果显示, 转染TFAR19基因在加速MEL细胞凋亡的同时, 使细胞对低渗的抵抗力降低, 渗透脆性加大, 细胞表面电荷减少, 电泳率降低; 与细胞最大变形能力呈负相关的弹性模量K₁增加, K₂无明显变化, μ 明显减小. 以上结论从生物流变学角度为全面、深入地认识凋亡新相关基因TFAR19的功能提供了理论基础.     

水稻黄单胞细菌Harpin蛋白的遗传多样性及其诱导烟草过敏反应和抗病性功能

利用PCR方法从水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae)两个致病变种(pv. oryzae和pv. oryzicola)的12个菌株中, 扩增出了编码诱导植物过敏反应蛋白激发子Harpin的3类hrfA (hypersensitive response functioning factor A)同源基因hrf1, hrf2和hrf3. 同源性分析表明, 这些同源基因推测的编码产物均富含甘氨酸, 缺乏酪氨酸, 在序列的第45位附近的氨基酸都有一个半胱氨酸. Harpin_Xoo由来源于水稻白叶枯病菌的hrfA基因编码, 产物包括两类, 一类代表菌株为JxoⅢ, 其中GGG-GG基序的重复数为3个, 分子量为15.6 kD; 另一类代表菌株为Pxo112, 产物中GGG-GG基序的重复数为4个, 分子量为15.9 kD, 这两个基因分别命名为hrf1和hrf3. Harpin_Xooc由来源于水稻条斑病细菌的hrfA基因编码, 代表菌株为RS105, 其中GGG-GG重复数为2个, 分子量为15.3 kD, 水稻黄单胞菌Harpin分子中的一个半胱氨酸残基是其特有的. 将这3类基因与已报道的hpa1和xop1基因编码的氨基酸序列进行聚类分析, 结果可以将其分为4类, 来源于水稻黄单胞菌的Harpin_Xoo和Harpin_Xooc被分在相邻的两类中. 对3种产物进行比较研究结果, 在相同条件下3个代表菌株JxoⅢ, RS105和Pxo112的hrfA基因(hrf1, hrf2和hrf3)表达蛋白的相对浓度分别为: 0.389, 0.530, 0.083 mg/mL. hrf1, hrf2和hrf3在大肠杆菌(Bl21)中的表达产物(Harpins)在烟草上均能激发过敏反应和诱导抗病性, 其生物活性依次为Hrf2, Hrf1和Hrf3.     

二级结构模拟辅助MTB脱氧核酶潜在作用靶点预测

异柠檬酸裂解酶(ICL)是结核病病原体结核分枝杆菌(MTB)乙醛酸循环中的关键酶,可作为抗结核新型药物治疗的潜在靶点。脱氧核酶(DRz)是一类独特的、具备酶活性的单链小分子DNA。实验针对MTBICL基因mRNA片段,通过二级结构模拟预测理论上适合与不适合DRz10～23作用的位点,据此设计针对ICL基因mRNA片段两种不同位点的DRz,并在体外水平上观察两种DRz对MTBICL基因mRNA片段的切割作用,以此验证底物二级结构模拟辅助MTB脱氧核酶潜在作用靶点预测的可行性。结果显示,底物二级结构模拟能够辅助预测MTB脱氧核酶潜在作用靶点,为探讨其作为抗结核病基因药物的可能提供实验基础。     

IGF2基因对鸡生长及屠体性状的影响及印记状况的研究

以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F₂代鸡群为实验材料, IGF2基因作为控制鸡生长、屠体性状主基因的候选基因, 通过PCR-SSCP方法对IGF2基因多态性进行检测. 该基因外显子2中有一个单核苷酸多态性位点, 即71位碱基由C突变为G. 对F₂鸡群个体进行了基因型鉴定, 经方差分析表明：该基因对部分生长、屠体性状有显著性影响(如胸角宽、腺胃重、半净膛重等). 研究表明该基因可能调控鸡生长、屠体性状的表达, 或与控制生长、屠体性状的主基因连锁. 进一步分析发现, 正反交结果不一致, 即杂合子AB(父本等位基因在前)出生重、胸肌重较杂合子BA高, 而腹脂重后者较前者高. 另选丝毛乌骨鸡家系做IGF2印记状况检测, 杂合子与纯合子进行正反交, 然后检测后代基因型并选取杂合子, 利用RT-PCR-SSCP检测表达情况, 结果表明, 鸡的IGF2基因不受印记控制. 交互效应可能是由于其他遗传因素作用的结果.     

外源性双链RNA对小鼠卵母细胞basonuclin基因表达的影响

在植物及低等动物线虫中, 引入外源性双链RNA(dsRNA)会导致细胞中同源mRNA降解, 从而干扰其内源基因的表达, 这可能是有机体防范病毒或转座子诱导DNA突变的一种生理机制, 称为RNA干涉(RNA interference, RNAi). 利用RNAi研究basonuclin基因在卵母细胞发生过程中的功能. 将basonuclin特异的dsRNA导入小鼠生发泡期卵母细胞, 可有效降低其mRNA的丰度, 这种降解作用与dsRNA的浓度及作用时间成正比, 但不影响非同源基因的表达, 证明basonuclin dsRNA能特异识别、降解其内源基因的转录产物. 免疫组化实验显示, dsRNA能降低卵母细胞中basonuclin蛋白的水平, 但其效率不如RNAi对tPA及cMos基因活性的抑制, 这可能是由于basonuclin蛋白的半衰期较长, 而生发泡期卵母细胞在体外存活时间较短. 结果表明, dsRNA能阻抑卵母细胞中同源基因的表达, 其作用相当于基因敲除. 质粒表达的发夹环型dsRNA也可以有效降解basonuclin转录产物, 这为研究basonuclin在卵母细胞发育早期的功能提供了新的手段.     

Ribozyme抑制端粒酶活性的肿瘤基因治疗

针对端粒酶RNA组分模板区设计合成锤头状端粒酶核酶(teloRZ),构建了teloRZ基因体外转录质粒P^SPT19-teloRZ和真核表达质粒P^{XJ-neo-teloRZ}.用T₇/SP₆体外转录系统检测了teloRZ对端粒酶RNA组分的体外切割效率,达60%左右.用脂质体介导法, 将P^{XJ-neo-teloRZ}导入HeLa细胞和裸鼠移植瘤,结果使HeLa细胞端粒酶活性降至对照细胞的11%～12.5%, 细胞生长速度明显变慢,传至19～20代时出现95%凋亡.裸鼠移植瘤注射P^{XJ-neo-teloRZ} 14 d后,端粒酶活性下降69%,抑瘤率达62%.实验表明,该核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂,在肿瘤治疗中发挥作用.     

籼稻半矮秆基因sd-t(t)的遗传定位及定位区间物理距离的估计

矮秆和半矮秆基因的利用及作用机制一直是作物育种和分子遗传研究的重要内容. sd-t(t)是从籼稻矮秆材料矮泰引-2中发现的一个与sd-1不等位的新半矮秆基因.利用由矮泰引-2与无叶舌标志基因系B30杂交产生的包含474个单株的F₂群体, 将sd-t(t)基因定位在水稻第4染色体上RFLP标记R514和R1408B之间, 距R514和 R1408B的遗传距离分别为1.1和4.5 cM. 利用水稻品系IRBB56 的BAC文库构建了sd-t(t)位点的跨叠克隆群, 并确定 R514与R1408B之间的物理距离大约为147 kb, 为进一步克隆sd-t(t)基因奠定了基础.     

鸡Ⅱ型胶原基因疫苗pcDNA-CCOL2A1能有效治疗大鼠类风湿性关节炎

已证明Ⅱ型胶原(CII)是类风湿性关节炎(RA)最主要的自身免疫抗原, 采用口服鸡Ⅱ型胶原蛋白(CCII)诱导免疫耐受治疗RA标志着RA治疗策略的重大进展之一. 在国际上克隆成功鸡Ⅱ型胶原蛋白基因(CCOL2A1)的基础上, 探讨了采用pcDNA-CCOL2A1基因疫苗策略治疗RA的科学性和可行性. 将克隆的CCOL2A1基因连接于真核表达载体pcDNA3.1(＋)上, 即为基因疫苗pcDNA-CCOL2A1. 然后将该表达载体pcDNA-CCOL2A1 转染COS-7细胞, 经Western blot分析显示, pcDNA-CCOL2A1在COS-7细胞中是以分泌型来表达CCII多肽链的α亚单位. 随后, 以CCII诱导的 Wistar大鼠为RA模型即CIA, 系统观察一次性尾部静脉注射20, 200, 400 μg/kg 3个不同剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗对CIA关节炎的治疗作用. 结果表明, 在注射后第5天200 μg/kg组就可观察到大鼠关节肿胀程度明显减轻, 与空载体组比较有显著性差异(P <0.05), 而20, 400 μg/kg两剂量组与空载体组比较未观察到治疗效果(P>0.05). 注射后6周, CIA大鼠血清中抗CII抗体浓度水平、TNF-α浓度在200 μg/kg治疗组较空载体组明显降低(P<0.05), 而400 μg/kg组则显著的升高, 20 μg/kg组则无明显变化. 此外, 细胞因子TGF-β, IL-10浓度水平在200 μg/kg组较空载体组明显升高(P<0.05), 而20与400 μg/kg两组则无显著性差异. 脾细胞淋巴细胞增殖实验表明, 200 μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗治疗组大鼠脾细胞对CII的反应能力较空载体组明显下降(P<0.05). 此结果表明, 200 μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗能明显抑制CIA大鼠关节肿胀程度, 降低抗CII抗体、TNF-α水平, 提高细胞因子TGF-β, IL-10水平, 降低脾细胞增殖反应能力, 对CIA大鼠关节炎有显著的治疗作用.     

抑制c-sis/PDGF-B原癌基因表达的TFO设计、体外三链形成及功能的检测

血小板衍生生长因子(PDGF)在肿瘤发生、生长,动脉粥样硬化和炎症反应等病理状态中起着极其重要的作用,其B链基因为原癌基因c-sis的同源物.提供了用于抑制c-sis/PDGF-B原癌基因表达的3种TFO(三链形成寡聚脱氧核苷酸triplex-forming oligonucleotide).凝胶阻滞电泳、DNaseⅠ印迹、体外转录抑制及核蛋白结合抑制等实验证明了这些化合物可与靶位点(c-sis/PDGF-B基因5′上游启动子核心区)形成稳定的三链复合物,并可抑制其下游基因的转录和转录因子的结合.它们有望应用于配制治疗肿瘤发生、生长,动脉粥样硬化和炎症反应等有关疾病的药物.     

醌类光敏剂HA, HB与纳米半导体CdS间的光生电子传递——HA-CdS, HB-CdS复合体光敏还原动力学的EPR研究

根据非均相体系电子传递动力μ =E_s*/s+-E_CB(μ＜0)的原理,构建出相匹配的HA-CdS和HB-CdS复合体(以下简称Hys-CdS,Hys代表HA,HB).在该体系中,¹Hys*向CdS导带传递电子是热力学允许的.通过荧光淬灭实验,测出它们之间的表观结合常数(K_app )分别为940 (mol/L)^-1(HA-CdS),934(mol/L)^-1(HB-CdS),表明Hys与CdS间存在较强烈的吸附效应.荧光寿命测定得¹Hys*向CdS导带传递电子的速率常数K_et分别为5.16×10⁹s^-1(HA-CdS), 5.10×10⁹s^-1(HB-CdS).以一种稳定的氮氧自由基TEMPO(2,2,6,6-tetramethyl-1-piperdinyloxy)作为电子受体,当它接受一个电子和一个质子,其EPR(electron paramagnetic resonance)信号便会消失,据此,应用消自旋的EPR技术,定量研究了苝醌类光敏剂Hys与纳米半导体CdS间光生电子传递动力学,确定了受Hys光敏化作用的CdS纳米半导体表面光还原速率方程和反应动力学速率常数,结果发现,本体系中TEMPO接受电子的反应级数均为0,而不同于均相体系中的反应级数,特别是在相同可见光照射条件下,通过比较单独的CdS与Hys–CdS复合体的光还原速率常数还发现,后者的光还原效率比前者均大,约为350倍,表明Hys对CdS纳米半导体具有显著的光敏化作用.这提示在太阳能应用中,Hys是一种很有效的光敏化剂.     

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因,约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。     

新的红细胞分化相关基因EDRF1功能的初步研究

曾报道过通过功能筛选得到一个新的红细胞分化相关基因, 并命名为EDRF1(erythroid differentiation related factor 1, GenBank登录号为AF040247). 鉴于功能线索明确, 选择K562细胞作为模型细胞, 通过基因转染技术观察了EDRF1反义RNA表达和EDRF1过表达对细胞增殖和分化的影响, [³H]TdR掺入和半固体集落培养实验的结果显示EDRF1过表达时, 细胞增殖代谢能力有所下降. Northern印迹和RT-PCR的结果表明, 反义EDRF1表达载体转染后的K562细胞α-globin, γ-globin mRNA表达水平下降, STAT3, c-myc, GATA-1表达下调, 红细胞生成素受体(EpoR)在反义表达载体转染后表达有一定程度的上调. 说明EpoR和珠蛋白的表达调节没有内在的正协同关系, EDRF1对K562细胞增殖和分化的调节有可能是通过影响GATA-1等诸多红系特异的转录因子与顺式序列相互作用的转录活性实现的.     

青霉素G酰化酶调节基因的定位

为了定位青霉素G酰化酶的调节基因,从质粒Ppa6克隆了一系列青霉索G酰化酶基因(pac)的片段,将这些重组质粒转化E.coli D816,测定克隆片段对pac表达的影响。如果克隆片段含有完整的调节基因(pacR)。诱导剂不能使由高拷贝pacR表达的阻抑物失活,部分阻抑物结合pac操纵基困,阻碍RNA聚合酶对加pac的转录,因此pac的表达量降低。发酵结果表明,阻抑物可能是由pac结构基因内部的ORFⅡ编码的蛋白因子。     

棉花微管蛋白基因GhTub1在纤维细胞中的特异表达

以陆地棉(Gossypium hirsutum )纤维发育前期和中期的胚珠及纤维细胞为材料构建cDNA文库, 通过ESTs分析获得了一个β-微管蛋白家族成员(GhTub1). 以该cDNA的3′-UTR为探针, 利用Northern杂交方法, 对GhTub1基因在棉花不同器官及棉纤维不同发育阶段的表达进行了分析, 发现该基因的表达具有棉纤维细胞特异性. 在纤维发育过程中, GhTub1转录产物的累积主要发生在纤维细胞延伸阶段, 在纤维延伸速度最快时达到高峰. 利用裂殖酵母系统, 对GhTub1的细胞内功能进行了初步分析, 发现该基因在酵母中过量表达能使其细胞显著伸长或分支. 这些实验结果暗示GhTub1基因可能在纤维细胞的极性延伸中具有功能.     

哺乳动物Bax基因在长春花细胞中的诱导表达及其对长春花生物碱合成的促进作用

Bax是哺乳动物细胞凋亡基因Bcl-2家族中的一员. 以往的研究报道表明, Bax基因可以诱发拟南芥等模式植物的超敏反应 (hypersensitive reactions, HR). 为了考查Bax基因对药用植物细胞次生代谢产物合成的影响, 我们构建了长春花雌二醇诱导型Bax基因工程细胞系. 实验结果表明, 转基因长春花细胞中Bax基因的表达水平对β-雌二醇浓度呈现明显的依赖性, 说明雌二醇诱导型启动子可以有效控制转基因长春花细胞中Bax基因的表达. 在30 μmol/L β-雌二醇处理下, 转基因长春花细胞中的长春花碱和总生物碱含量分别比野生型细胞高5. 0和5. 5倍, 表明哺乳动物Bax基因对长春花细胞中生物碱的合成具有促进作用. Northern blotting和Western blotting检测结果表明, Bax基因可以提高转基因长春花细胞中萜类吲哚碱生物合成途径关键酶基因Tdc和Str的转录水平, 并且促进细胞中防御相关蛋白PR1的积累, 说明Bax基因可以诱发长春花细胞的防御反应, 激活细胞中萜类吲哚碱生物合成途径, 从而提高长春花生物碱的合成代谢流量. 研究结果表明, 哺乳动物Bax基因可以从细胞水平上促进植物次生产物的合成, 为植物细胞次生代谢产物合成的分子调控提供了一种新的策略.     

水稻bZIP蛋白REB结合Wx基因启动子中的GCN4基序

在水稻Wx基因启动子中找到了一个由胚乳基序(EM)和GCN4基序组成的双元胚乳盒. 许多文献报道,种子贮存蛋白基因启动子中的胚乳盒与基因的种子专一性表达有关,一类bZIP家族的转录因子通过结合胚乳盒中的GCN4基序而调控相应基因在种子中专一性表达.本文证明了水稻Wx基因启动子的胚乳盒中的GCN4基序能被水稻未成熟种子中的核蛋白识别并结合.进一步采用PCR的方法克隆了水稻bZIP家族的转录因子——REB的部分cDNA,并在E.coli中表达了REB融合蛋白.凝胶滞后试验结果表明,除文献报道,REB能结合α-globulin启动子上的靶位点外,REB也能识别并结合水稻Wx基因启动子的GCN4基序.