α-半乳糖苷酶酶解B型长臂猿细胞回输A型长臂猿的研究

使用基因重组咖啡豆α 半乳糖苷酶体外处理B型长臂猿红细胞 ,使其转变为O型 ,再回输给A型长臂猿 .α 半乳糖苷酶可以清除B型长臂猿红细胞表面B抗原 ,而不影响红细胞结构、功能及其在受体体内存活 .α 半乳糖苷酶酶解的B型红细胞输给A型血的长臂猿 ,未发生输血反应 ,受血猿的血液及尿液常规指标与输血前相比 ,无明显变化 .     

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α 半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上 ,尝试了基因工程α 半乳糖苷酶在 5L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α 半乳糖苷酶的研究。在 4L无机盐培养基中接种 0 .4LpPIC9K Gal GS115培养物 ,最终得到 3 .5L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为 2 .1g L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点 ,设计了如下的纯化流程 :离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带 ,总回收率 41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后 ,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明 ,从发酵液中纯化的α 半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α 半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。     

α-半乳糖苷酶酶解对猕猴红细胞结构功能的影响

目的　观察α 半乳糖苷酶对猕猴类人B抗原的酶解效果 ,探讨α 半乳糖苷酶酶解对猕猴红细胞结构、功能的影响。方法　采用热吸收放散试验从 30只华南猕猴中选取类人ABO血型抗原较强的 2只A型、3只B型猕猴做为实验对象 ,以基因重组的α 半乳糖苷酶体外酶解猕猴类人B型血抗原 ,并回输到A型猕猴体内 ,测定红细胞脆性、自身溶血率、胆固醇、高铁血红蛋白、乙酰胆碱脂酶、ATP等红细胞的结构功能指标。结果　经α 半乳糖苷酶酶解后 ,猕猴红细胞胞膜完整、携氧能力正常 ,酶解后的“通用”型血回输给受体猕猴无任何输血反应发生。结论　α 半乳糖苷酶酶解对于猕猴红细胞的形态、结构、功能无不良影响 ,且在实验动物体内是安全的。     

制备抗α-半乳糖苷酶单克隆抗体用于检测B→O血型改造后的微量残留酶

目的:建立一种检测B→O血型改造后残留α-半乳糖苷酶的有效方法。方法:利用重组咖啡豆α-半乳糖苷酶为免疫原制备单克隆抗体,再采用间接ELISA法检测B→O血型改造后残留的工具酶α-半乳糖苷酶的量。结果:最低可检测出的残留酶量约为2.4ng/mL。结论:为B→O血型改造后残留的工具酶的检测提供了有效的方法。     

B→O血型转变工具酶α-半乳糖苷酶cDNA克隆及表达

 α-半乳糖苷酶是实现 B→O血型转变、制备通用型血的关键工具酶 .利用反转录 PCR方法从中国海南 Catimor咖啡豆中克隆α-半乳糖苷酶 c DNA,插入嗜甲基酵母 P.pastoris分泌表达载体 p PIC9K中 ,转化 P.pastoris GS1 1 5,筛选高表达重组菌株 .经甲醇诱导表达 7d后 ,发酵液总蛋白分泌量约 1 .2 mg/ml,SDS- PAGE呈现约 41 k D特异表达带 ,与专一性底物对 -硝基 -苯基 -α- D-吡喃半乳糖苷反应证明 ,表达产物具有 α-半乳糖苷酶活性 ,最高达到 1 8U/ml.初步实验表明 ,表达的 α-半乳糖苷酶可酶解 B型红细胞 ,成功实现 B→O血型转变 .     

重组α-半乳糖苷酶的制备工艺研究

α-半乳糖苷酶是B→O血型改造研究中的关键工具酶。在获得了可分泌表达α-半乳糖苷酶的基因工程毕赤酵母菌株的基础上,进行了工程菌株在5L发酵罐中的发酵。发酵液上清中α-半乳糖苷酶活性为80～150U／mL,蛋白浓度为3～4.5mg／mL,比活性约为20-30U／mg。发酵液采用超滤、阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析等纯化方法,建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的工艺。制备的重组酶纯度经鉴定达98％以上,符合新生物制品的纯度要求。制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,从而解决了应用此酶开展B→O血型改造研究的关键问题。     

一种来源于脆弱类杆菌的α-半乳糖苷酶的理化性质及其酶解B型红细胞的工艺研究

利用α-半乳糖苷酶去除红细胞表面的B抗原是制备通用O型红细胞的有效方法.本文在克隆表达纯化脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶的基础上对其理化性质进行了研究,该酶的分子量为64908Da,等电点在7.12～7.30之间,最适温度为41℃,最适pH为5.6～6.0,其理化性质适合用于B型红细胞的血型改造;为了确定高效、快速、温和的酶解条件,本文对酶解B型红细胞的工艺进行了优化.通过研究缓冲液对酶与红细胞结合的影响,确定了最佳酶解缓冲液为250mmol/L甘氨酸和3mmol/LNaCl,pH6.8;酶解的最适红细胞压积为40%,酶解温度为26℃,酶解时间为1h.利用优化的酶解工艺获得的B-ECORBCs形态及结构功能指标均正常,流式细胞结果证明其B抗原和H抗原标记率与O型红细胞相当,说明制备B-ECORBCs的工艺已成熟.这种工艺具有酶用量少、酶解条件温和、制备过程简单和时间短等优势,具有很好的临床应用前景.     

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α-半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上,尝试了基因工程α-半乳糖苷酶在5 L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α-半乳糖苷酶的研究。在4 L无机盐培养基中接种0.4 L pPIC9K-Gal/GS115培养物,最终得到3.5 L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为2.1 g/L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点,设计了如下的纯化流程：离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带,总回收率41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明,从发酵液中纯化的α-半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α-半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。     

表达重组咖啡豆α-半乳糖苷酶的酵母工程菌的高密度发酵

用5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α-半乳糖苷酶酵母工程菌pPIC9K-Gal/GS115(本室构建)的高密度发酵工艺.通过对发酵条件的优化,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达.利用所确定的最适条件进行发酵,菌体密度最终达到368 g/L以上,每批发酵液离心后可获得3.5 L的发酵上清,上清中的蛋白含量达到3 g/L以上,目的蛋白占上清总蛋白的50%以上,含量约为1.5 g/L,上清中α-半乳糖苷酶的活性维持在80 U/ml左右.确立工艺后又进行了3次发酵试验,证明了工艺的可行性和稳定性.为重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础.     

甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰遮蔽人ABO血型抗原

输血是一种非常有效的临床治疗手段 ,但血型不符会造成输血死亡事故 .为了解决输血中存在的血型匹配困难等问题 ,使用甲氧基聚乙二醇 (mPEG)化学修饰法 ,对红细胞表面的血型抗原进行化学修饰 ,从而达到遮蔽红细胞血型抗原的目的 .通过对mPEG BTC、mPEG ALD和mPEG 2 NHS三种mPEG衍生物对红细胞A抗原和B抗原修饰效果的比较 ,结果表明mPEG BTC修饰效果最好 ,可以完全遮蔽红细胞的A抗原和B抗原 ,使修饰后的A型、B型和AB型红细胞呈现出与O型红细胞相同的血型血清学特征 ;进一步研究证明 ,mPEG BTC与红细胞结合牢固 ,对红细胞结构、功能、变形能力、常规指标和沉降率等基本没有影响 .初步实现了A→O ,B→O和AB→O的血型改造 ,从而为临床输血治疗遇到的偏型、稀有血型、配型困难等问题的解决 ,提供了新的技术方法与思路 .     

人α-半乳糖苷酶转导克服异种移植HAR的小鼠实验研究

α 半乳糖苷酶可以特异地清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 (Galα1,3Galantigen) ,此抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (HyperacuteRejection ,HAR)的主要异种抗原 .将构建好的α半乳糖苷酶转基因载体通过显微注射的方式注入小鼠受精卵 ,培育出了转基因小鼠 .结果表明 ,转基因小鼠的心、肝、肾、脾、肺组织中均有人α 半乳糖苷酶基因的表达 ,其表达可以有效减少小鼠器官表面Galα1,3Gal抗原的表达水平 ,可以降低转基因小鼠脾细胞对补体介导的杀伤作用的敏感性 .研究表明人源α半乳糖苷酶基因可用于研制不表达Galα1,3Gal抗原的转基因动物 ,从而可以降低异种器官移植HAR的反应强度 ,提高移植物的存活期     

人α-半乳糖苷酶、α-1,2-岩藻糖转移酶cDNA序列转染克服异种移植超急性排斥反应

半乳糖α 1,3 半乳糖抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (hyperacuterejection ,HAR)的主要抗原 .α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以以不同的方式降低半乳糖α 1,3 半乳糖抗原在内皮细胞表面的表达量 .将人α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因单独或连接在一起导入猪血管内皮细胞PEDSV .15中 ,检测细胞表面的抗原及异种天然抗体对细胞杀伤作用 .结果表明α 半乳糖苷酶基因可以将猪血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原清除 74 13%,而α 1,2 岩藻糖转移酶基因也可以清除 4 7 75 %的细胞表面异种抗原 ,但二者都不能达到完全清除的目的 .当α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶双基因在内皮细胞内共表达时 ,则可以基本清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 .抗原的减少也可以相应地减弱内皮细胞对异种天然抗体介导的杀伤作用的敏感性 ,尤其是双基因共表达时细胞基本不被杀伤 .结果表明 ,α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以有效地清除血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 ,克服HAR的发生 ,为下一步进行动物实验 ,探讨克服异种移植HAR提供了技术途径     

血型的分子基础

本文仅就ABO、MN和HLA等血型的结构和功能进行扼要介绍。 (一)ABO血型系统 ABO血型系统又可分为A、B、AB和O型等四种血型。红细胞含A抗原和H抗原的叫做A型,A型的人血清中含有抗B抗体;红细胞含B抗原和H抗原的叫做B型,B型的人血清中含有抗A抗体;红细胞含A抗原、B抗原和H抗原,叫做AB型,这种血型的人血清中没有抗A抗体和抗B抗体;红细胞只有H抗原,叫做O型,O型的人血清中含有抗A抗体和抗B抗体。     

体外化学修饰红细胞--通用型血?

目前国内外对通用型血的研究主要是改造修饰红细胞表面抗原。研制的方法有两种：体外酶解修饰人A、B抗原制备O型血和使用化学材料甲氧基聚乙二醇(mPEG)共价结合到红细胞表面,遮蔽血型抗原。两种修饰的结果均表明对红细胞的结构、功能无影响。这两种修饰方法为制备通用型血供临床输血开拓了崭新的途径,具有重要意义。     

反义RNA对猪α-1,3-半乳糖苷转移酶活性的影响

 α 1,3 半乳糖表位是猪 人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,由α 1,3 半乳糖苷转移酶催化合成 .用RT PCR方法扩增中国实验用小型猪α 1,3 半乳糖苷转移酶cDNA的前 582bp ,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN ,将其转染入猪主动脉内皮细胞 .NorthernBlotting表明α 1,3 半乳糖苷转移酶mRNA减少 .检测α 1,3 半乳糖苷转移酶活性表明 ,反义RNA可使其活性下降32 2 % .研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪 人异种移植超急性排斥反应     

α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面的α-Gal抗原

目的:探讨脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面α-Gal抗原的作用。方法:用不同浓度的α-半乳糖苷酶酶解猪红细胞、猪胚肾细胞PK15、猪睾丸细胞ST和原代培养的猪成纤维细胞上的α-Gal抗原,酶解温度为26℃,作用时间为2 h;用25μg/m L的FITC-IB4凝集素标记酶解前后的细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面α-Gal抗原的清除率。结果:流式细胞检测结果表明,不同组织来源的猪细胞表面的α-Gal抗原的表达量明显不同,所需酶的剂量也不同,但其表面的α-Gal抗原均能被α-半乳糖苷酶清除。结论:脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶可以清除猪细胞表面的α-Gal抗原,提示该酶对降低异种移植引起的超急性排斥反应有重要意义。     

免疫磁珠技术分离唾液A/B血型抗原并用于吸附血清A/B抗体

目的:应用免疫磁珠分离技术获得具有良好抗原性的A/B血型抗原,并探究其作为ABO血型抗体吸附剂去除A/B抗体的可行性。方法:将含有血型物质的唾液进行预处理,再与包被了抗体的磁珠混合,分离出纯度较高的A/B抗原,运用酶联免疫及凝集抑制试验验证所得抗原的抗原性及是否存在交叉反应。用未纯化A/B抗原和纯化A/B抗原包被磁珠,对含有抗A/B IgM、IgG的血清进行抗体吸附,用纯化A/B抗原对100份来自O型血孕妇的临床血清样本进行抗体吸附,分别评价其吸附效果。结果:纯化抗原与对应抗体反应后,其吸光度显著高于对照组(A抗原与A抗体0.85±0.12 vs.0.27±0.03,P0.01;B抗原与B抗体0.86±0.09 vs.0.24±0.06,P0.01),与其它类型抗体反应后的吸光度值与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。进行红细胞凝集抑制试验时,纯化抗原可显著抑制相应抗体与红细胞的凝集反应,对其它类型抗体与红细胞的凝集没有抑制作用。血清抗体吸附实验表明纯化抗原的吸附效率比未纯化抗原的高(97.00%vs.88.00%,P0.001)。临床样本抗体吸附实验显示,纯化A抗原对抗A IgM/IgG的吸附效率分别为96.88%、98.44%;纯化B抗原对抗B IgM/IgG的吸附效率分别为96.88%、98.44%。结论:磁珠纯化抗原能特异性地与对应抗体结合,有效吸附血清中的血型抗体,有望作为合成A/B抗原的替代品。     

利用杆状病毒载体在棉铃虫血细胞中表达大肠杆菌β－半乳糖苷酶

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体pAc36O－B－gal与野生型的苜蓿丫纹夜蛾(AcNPV)DNA同时转染草地夜蛾细胞,经x—gal筛选和空斑纯化得到重组型杆状病毒AcNPV－β－gal。该重组病毒能有效地感染棉铃虫血细胞系,并高效表达出受AcNPV多角体蛋白启动子控制的、具有生物活性的外源基因产物－－β－半裂糖苷酶。80％以上的酶蛋白能分泌到细胞外,培养液中酶活可达每毫升50000单位以上,约相当于170μg酶蛋白。用要SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离表达产物和β－半乳糖苷酶在凝胶上的特异性显色反应分析,重组病毒在棉铃虫血细胞中表达的AcNPV多角体蛋白－－大肠杆菌β－半乳糖苷酶融合蛋白是以5种活性的多聚体或复合物形式存在的。     

耐热重组β-半乳糖苷酶的制备及酶稳定性研究

编码嗜热脂肪芽孢杆菌β—半乳糖苷酶基因的重组枯草芽孢杆菌WB600／pMA5—bgαB,经5L发酵罐发酵收集菌体超声波破壁,冷冻离心后再经过热处理和盐析纯化,比活力达80．3U／mgpr,回收率73．6％,纯化倍数12．4倍。β—半乳糖苷酶在细胞内及破壁后都具有较好的稳定性,60℃热处理对酶构象的影响不大。     

蛹虫草胞外多糖的研究 Ⅰ.半乳甘露聚糖(CM-I)的纯化和结构研究

从蛹虫草菌体培养液中提取水溶性粗多糖经分离纯化,得一种含有少量蛋白的半乳甘露聚糖CM-Ⅰ,分子量2.7×10~4,[α]_D~(19)=+54.7°。糖组成摩尔比,半乳糖:甘露糖=6∶5。经高碘酸氧化,Smith降解,部分酸水解,半乳糖苷酶解,~1H-NMR分析,完全甲基化与GC及GC-MS分析,证明:多糖CM-Ⅰ具有高度分枝结构,其以β-(1→2)连接的甘露糖为主干,枝链由较大量的β-(1→6)半乳糖和较大量的β-(1→2)呋喃半乳糖构成,分别连接在主干的0—4和0—6上。