改进竞争性RT-PCR法测定缺碘大鼠颅骨中BMP-2基因表达变化

为更加精确地测定碘缺乏状态下大鼠颅骨组织中骨形态发生蛋白 2 (BMP 2 )mRNA表达水平 ,改进竞争性RT PCR方法 ,探讨碘缺乏对骨骼发育影响的分子机制 .将构建的DNA竞争模板克隆入pSportⅠ质粒中 ,利用pSportⅠ质粒中所含有的SP6RNA聚合酶启动子序列 ,将DNA竞争模板在体外转录成为RNA .以此RNA作为竞争性RT PCR中的竞争模板 ,与所提取的总RNA一同进行RT PCR ,消除逆转录效率对定量结果的影响 .定量检测碘缺乏和正常大鼠颅骨总RNA中BMP 2mRNA的水平 .碘缺乏大鼠 (1d～ 84d)颅骨中BMP 2表达含量明显降低 .1d时降低 6 4 3倍 ,以后差距逐渐缩小 ,至 84d相差 1 5 5倍 .结果提示 ,碘缺乏所致的骨骼发育不良与BMP 2表达不足有关 ,结果首次揭示微量元素碘和甲状腺激素与BMP 2基因表达的调控有关     

从矿化的骨组织中提取骨细胞的总RNA

描述了两个从以含大量羟基磷灰石（钙）和细胞密度、数量甚低为特点的矿化的成年骨组织（成年大鼠颅骨）提取总RNA的改进方法.紫外分光光度法（A260、A280和A230）和1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳予以鉴定.进而以其逆转录的cDNA为模板扩增出β-actin和BMP-2基因,均表明所得总RNA完整和模板活性俱佳.总RNA产量平均为560μg/g骨组织.     

从矿化的骨组织中提取骨细胞的总RNA

描述了两个从以含大量羟基磷灰石（钙）和细胞密度、数量甚低为特点的矿化的成年骨组织（成年大鼠颅骨）提取总RNA的改进方法.紫外分光光度法（A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₃₀）和1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳予以鉴定.进而以其逆转录的cDNA为模板扩增出β-actin和BMP-2基因,均表明所得总RNA完整和模板活性俱佳.每克骨组织中总RNA产量为560 μg.     

胰岛素样生长因子1(IGF-1)mRNA同源模板竞争性PCR定量方法的建立

胰岛素样生长因子 1(IGF 1)是一种多功能的细胞增殖调控因子 ,其表达水平受多种因素的影响 ,为了研究IGF 1基因在转录水平上的调控机制 ,建立了定量测定IGF 1mRNA的竞争性PCR方法 .同时 ,也建立了一种简便的制备同源性竞争模板的方法 .以构建好的重组pUC IGF 1质粒为基础 ,利用IGF 1mRNA序列上唯一存在 ,但是在pUC18质粒上多拷贝的MspⅠ酶切位点 ,以该限制性内切酶处理重组pUC IGF 1质粒 .在T4DNA连接酶作用下对酶切产物进行随机连接 ,以连接产物作为模板 ,用可扩增IGF 1cDNA的引物进行PCR ,由此得到因含有随机插入序列而与原IGF 1cDNA产生明显长度差别的重组IGF 1.以不同浓度的该DNA片段作为同源竞争模板与大鼠肝组织cDNA在同一反应体系中进行PCR ,对PCR产物进行分析 ,计算出样本中IGF 1cDNA的初始浓度 .成功地建立了IGF 1mRNA的竞争性PCR定量检测方法 ,为研究IGF 1基因的表达调控奠定了基础 ,同时也为对已克隆的基因进行mRNA定量测定提供了一种简便和灵敏的手段     

大鼠促甲状腺激素释放激素受体1基因的克隆及其在COS-7细胞系中的表达

目的:克隆大鼠促甲状腺激素释放激素受体1(TRH-R1)基因,构建其真核表达载体,并检测该基因在非洲绿猴肾细胞系COS-7中的表达。方法:应用RT-PCR方法,以大鼠脑源RNA为模板,扩增获得TRH-R1基因,定向克隆到pDsRed2-N1中,以LipofectAMINE 2000试剂转染pDsRed2-N1-TRH-R1表达载体至COS-7细胞系中进行瞬时表达。结果:测序结果表明,从大鼠脑源总RNA中克隆到正确的TRH-R1基因全长编码序列;显微照相观察到所构建的TRH-R1表达载体质粒在COS-7细胞系中获得有效表达。结论:大鼠TRH-R1基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7细胞系中表达获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础。     

外源性β-NGF调节骨改建过程中的可能作用机制

目的探讨外源性的β-NGF在骨缺损愈合过程中对骨改建可能作用机制。方法利用外科手术方法切取SD大鼠颅骨顶部左右两侧的骨质,建立配对大鼠颅骨标准骨缺损局部持续灌注β-NGF给药模型。通过免疫组织化学技术检测骨缺损区组织中BMP-2的表达水平以及特殊染色技术(TRAP染色)检测骨缺损区组织中抗酒石酸碱性磷酸酶的表达水平,通过图像处理软件IPP6.0分别测定两者积分光密度值(IOD),以探讨BMP-2与破骨细胞活性在β-NGF调节新骨形成和改建过程中的可能作用机制。结果实验组BMP-2免疫组化染色阳性表达水平在14 d时IOD值明显高于对照组,且差异有显著性(P0.05);TRAP染色结果显示:实验组骨吸收的活性在第7,21,28天三个时间点上明显低于对照组,且差异有显著性(P0.05)。结论外源性的β-NGF在骨缺损修复过程中具有重要的调节作用,其可能是通过促进BMP-2表达和抑制破骨细胞的活性以抑制骨吸收。     

用磁性分离RNA直接进行逆转录PCR

逆转录PCR(RT-PCR)技术是将提取的IRNA先逆转录为cDNA,然后再对该cDNA进行PCR扩增。该技术不仅可用于各种内源及外源性正常及异常RNA的分析或检测,而且还常用于cDNA文库的构建及特定基因的制备。RT-PCR所用RNA模板一般是未经纯化的总RNA,若RNA模板含量较低便难以     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测水稻RAc1基因mRNA方法的建立

构建包含RAc1基因cDNA片段的质粒,作为水稻肌动蛋白基因RAc1之mRNA定量检测的标准品,建立检测方法,为水稻其他基因的定量建立内参.从水稻叶总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增RAc1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体进行连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析.纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验.建立了RAc1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～107拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r=1.000),扩增效率高(E=98.2%).建立了基因RAc1实时定量PCR的质粒标准品.     

小鼠破骨细胞诱导及成纤维生长因子受体表达检测

目的:检测成纤维生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)在小鼠破骨细胞中的表达情况,为探讨FGFRs时破骨细胞的直接调控作用奠定基础.方法:采用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和破骨细胞分化因子(receptor activator of nuclear factor-B ligand,RANKL)诱导小鼠骨髓单核细胞分化为破骨细胞.提取细胞总RNA后经逆转录获得小鼠破骨细胞cDNA,根据FGFRs基因编码区序列设计的引物进行PCR扩增并对PCR扩增产物进行测序.为进一步验证转录水平的结果,提取细胞总蛋白电泳后进行免疫印迹实验.结果:诱导5d后可见TRAP( )多核细胞出现,小鼠破骨细胞在转录水平和翻译水平均只可检测到FGFR1和FGFR3基因的表达产物.结论:M=CSF和RANKL可成功诱导出小鼠破骨细胞,FGFR1和FGFR3基因在小鼠破骨细胞中均有表达.     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测水稻RAcl基因mRNA方法的建立

构建包含RAcl基因cDNA片段的质粒,作为水稻肌动蛋白基因RAcl之mRNA定量检测的标准品,建立检测方法,为水稻其他基因的定量建立内参。从水稻叶总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增RAcl基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体进行连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验。建立了RAcl基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102—1护拷贝,阈值循环数（Ct）与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=1．000）,扩增效率高（E=98．2％）。建立了基因RAcl实时定量PCR的质粒标准品。     

登革病毒NS3全基因的扩增与克隆

登革热(ＤＦ)、登革出血热及登革休克综合征(ＤＨＦ/ＤＳＳ)是由登革病毒所致的两种不同临床类型的急性传染病,广泛流行于全球热带及亚热带地区。ＤＨＦ/ＤＳＳ以高热、出血、休克、高病死率为主要特征,近年来其发病率有迅速增加的趋势,已成为严重影响人类健康的公共卫生问题。迄今,ＤＨＦ/ＤＳＳ的发病机制仍不清楚,亦无有效的特异性预防方法[1]。登革病毒属于黄病毒科的黄病毒属,有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个血清型,基因组为单股正链ＲＮＡ,全长约11ｋｂ,编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白。基因组顺序为5′ＣＰｒＭＥＮＳ1ＮＳ2ａＮＳ2ｂＮＳ3Ｎ…     

CNDAC等药物抗性肿瘤细胞中脱氧胞苷激酶基因表达的研究

抗肿瘤化学药剂 ara- C和 CNDAC细胞毒性的活化都需要通过脱氧胞苷激酶催化的磷酸化反应 .为了研究 CNDAC抗性细胞系产生抗性的原因 ,对人类纤维肉瘤 HT- 1 0 80细胞及抗性细胞CN- 2 0中脱氧胞苷激酶 ( deoxycytidine kinase,简称 d CK) m RNA的表达进行了分析 .亲本细胞株HT- 1 0 80的总 RNA通过 RT- PCR扩增的 dck编码区产物为 799bp,而同样方式扩增的抗性细胞的产物为 799bp和 683bp两个片段 .核酸序列分析的结果表明异常的 683bp片段与正常的 799bp片段相比 ,缺失了 1 1 6bp,这 1 1 6bp正好是 dck基因第 5个外显子 ,且 799bp的片段中发现两个点突变 .因此认为基因突变引起的 d CK活性缺陷是诱发这类肿瘤细胞 CNDAC抗性表型的一个可能原因 .     

骨形成蛋白4条件性RNA干扰小鼠的建立

为研究骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4, BMP4)在骨骼发育中的作用, 我们以含有LoxPneo的pBSK/U6载体为骨架, 构建小鼠BMP4条件性RNAi(conditional RNA interference), CRNA; 载体(BMP4CRNAi), 经KpnⅠ和AflⅢ双酶切获取针对bmp4并含neo基因的目的干扰片段, 纯化后的目的片段显微注射入0.5 d的FVB/NJ小鼠受精卵, 并植入同期发情的假孕母鼠中, 获取G0代转基因小鼠; 利用PCR对G0代转基因小鼠基因型进行鉴定, PCR阳性的小鼠与FVB/NJ小鼠交配, 最终获取稳定传代的BMP4CRNAi小鼠。稳定传代的BMP4^CRNAi小鼠与成骨和软骨前体细胞表达Cre的转基因小鼠(Col2a1-Cre)交配, 获取BMP4^Col2a1-CRNAi小鼠。分离BMP4Col2a1-CRNAi小鼠原代软骨细胞, 提取总RNA, 利用半定量RT-PCR检测RNA干扰效率。小鼠基因型鉴定结果表明：成功获得条件性RNAi转基因小鼠; BMP4干扰效率检测结果表明：在软骨细胞中BMP4的干扰效率为81％。以上结果表明, 我们成功制备了BMP4^CRNAi小鼠和BMP4^Col2a1-CRNAi小鼠, BMP4^CRNAi小鼠与不同Cre转基因小鼠交配, 可以研究BMP4在不同细胞、组织和器官的功能, BMP4^Col2a1-CRNAi小鼠的获得为研究BMP4在软骨发育中的作用提供了合适的动物模型。     

Rapid competitive PCR using melting curve analysis for DNA quantification.

A rapid competitive PCR method was developed to quantify DNA on the LightCycler. It rests on the quantitative information contained in the melting curves obtained after amplification in the presence of SYBR Green I. Specific hybridization probes are not required. Heterologous internal standards sharing the same primer binding sites and having different melting temperatures to the natural PCR products were used as competitors. After a co-amplification of known amounts of the competitor with a DNA-containing sample, the target DNA can be quantified from the ratio of the melting peak areas of competitor and target products. The method was developed using 16S rDNA fragments from Streptococcus mutans and E. coli and tested against existing PCR-based DNA quantification procedures. While kinetic analysis of real-time PCR is well established for the quantification of pure nucleic acids, competitive PCR on the LightCycler based on an internal standardization was found to represent a rapid and sensitive alternative DNA quantification method for analysis of complex biological samples that may contain PCR inhibitors.