枯草芽孢杆菌聚谷氨酸合成途径相关基因功能研究

聚谷氨酸(polyglutamic acid,PGA)作为一种天然多功能的聚合物,近年来成为研究的热点。由于很难通过化学方法合成,微生物发酵是目前生产聚谷氨酸的有效途径。【目的】从基因水平探究枯草芽孢杆菌聚谷氨酸合成途径中degS、degQ、degU、swrA、rocA、putM基因的功能,通过分子改造实现对代谢途径的调控。【方法】以枯草芽孢杆菌为出发菌株,通过对代谢途径中相关基因进行敲除或过表达,分别构建degS、degQ和degU基因缺失的重组菌,swrA、rocA和putM基因过表达的重组菌,借助菌株胞外聚谷氨酸积累的变化分析影响途径的关键节点。【结果】在摇瓶发酵条件下,重组菌Bacillus subtilis 168-swrA、Bacillus subtilis 168-rocA、Bacillus subtilis 168-putM的胞外聚谷氨酸含量分别是原始菌株的1.28倍、1.47倍和1.37倍。重组菌Bacillus subtilis 168-ΔdegS、Bacillus subtilis 168-ΔdegQ、Bacillus subtilis 168-ΔdegU的胞外聚谷氨酸含量分别是原始菌株的1.01倍、0.98倍和0.94倍。在静态培养时,BS168-ΔdegU不能形成完整的生物膜,Bacillus subtilis 168-ΔdegS、Bacillus subtilis 168-ΔdegQ、Bacillus subtilis 168-swrA、Bacillus subtilis 168-rocA和Bacillus subtilis 168-putM菌株的生物膜形成量分别是原始菌株的1.48倍、1.31倍、1.77倍、2.59倍和2.16倍,且胞外蛋白含量与生物膜的形成量呈正相关。【结论】degS、degQ和degU基因的缺失不会明显影响聚谷氨酸的合成,swrA、rocA和putM基因的过表达均能显著提升细胞合成聚谷氨酸的能力,rocA和putM基因的表达量增强能提高胞内谷氨酸的积累,从而增加聚谷氨酸的合成。     

外界高渗环境对枯草芽孢杆菌胞内自由脯氨酸含量的影响

枯草芽孢杆菌(93151)在基本培养基中培养,可耐受高达8%NaCl浓度,而在10%NaCl条件下96h内未见生长。随胞外NaCl浓度的增加,其胞内自由脯氨酸的含量相应明显增加,在8%NaCl浓度下胞内脯氨酸含量可达2.944mg·g-1干细胞重,与无NaCl条件下相比,增加了1572%,而对照菌大肠杆菌仅可耐受4%NaCl浓度,并且在不同NaCl浓度下,胞内脯氨酸含量变化不明显。     

枯草芽孢杆菌基因修饰生产核黄素

【目的】研究枯草芽孢杆菌核黄素合成途径、木糖代谢相关基因修饰对核黄素合成的影响。【方法】单独过表达或共同过表达核黄素操纵子中的基因、过表达木糖代谢相关基因构建相应的重组菌株。通过测定和比较重组菌株摇瓶发酵的核黄素产量和生物量,表征各个基因修饰的效应。采用摇瓶和5 L罐发酵,考察木糖作为主要碳源以及木糖与蔗糖共代谢对核黄素发酵的影响。【结果】ribA基因单独过表达,使核黄素产量提高99%,但生物量降低30%,出现细胞自溶现象。ribA-ribH基因共表达,使核黄素产量提高280%,并且无细胞自溶和生物量下降现象。1.5%蔗糖与6.5%木糖作为碳源,5 L发酵罐发酵70 h,核黄素产量达到3.6 g/L,与8%蔗糖为碳源的发酵相比,核黄素产量提高80%。木糖代谢相关基因过表达,均明显降低核黄素产量。【结论】与ribA基因单独过表达相比,ribA-ribH基因共表达可有效避免细胞自溶现象,并能进一步提高核黄素产量。蔗糖与木糖共代谢,能够改善前体物供给,有利于提高核黄素产量。     

枯草芽孢杆菌bgIS基因在酵母染色体上整合

将枯草杆菌β－１,３－１,４－葡聚糖酶基因（ｂｇＩＳ）２．７ｋｂＥｃｏＲＩ片段和酵母染色体ｒＤＮＡ片段克隆到整合型不含酵母自主复制序列（Ａｕｔｏｎｏｍｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）的大肠杆菌／酵母菌穿梭质粒ＹＩＰ５上,构建成ＹＩＰ５－ｂｇＩＳ－ｒＤＮＡ的杂种质粒ＰＣＺＨ,转化Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ并得到表达。稳定性测定表明,Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０１）和Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０４）     

地衣芽孢杆菌α—淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

采用PCR技术扩增了sacB基因的启动子-信号序列,并将扩增的序列重组进含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒载体上构建了含α-淀粉酶基因的分泌型表达载体pSA60。将pSA60转化枯草芽孢杆菌QB1098后,α-淀粉酶基因在sacB基因启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,表达产物分泌至胞外。     

基于枯草芽孢杆菌产物应用的基因组精简研究进展

枯草芽孢杆菌代谢产物众多,具有很强的应用开发前景,在工业上广泛应用。本文总结了聚谷氨酸、纳豆激酶和维生素K2三种热点代谢产物及其在医药、食品、农业上的应用。枯草芽孢杆菌是常用的基因工程菌,对其进行遗传改造的方法较多。本文综述了同源重组、位点特异性重组和CRISPR/Cas9三种基因组精简手段,总结了困扰枯草芽孢杆菌代谢产物开发应用与基因组精简的问题,推断未来发展的方向,期望推动枯草芽孢杆菌的开发与应用。     

杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建

分别以枯草芽孢杆菌大肠杆菌穿梭质粒pHB201和pRP22为载体,通过感受态转化方法,将Bt-HD-1杀虫蛋白基因cry1Ac导入了水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916。工程菌株质粒酶切电泳分析、Southern印迹分析和杀虫生物活性测定结果证实了cry1Ac基因的导入及其在B916中的有效表达。抑菌测定证明工程菌株保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。质粒稳定性分析表明以载体pRP22构建的工程菌株Bs2249具有良好的稳定性,而以载体pBH201构建的工程菌株Bs2014则不稳定。此外,实验还证实Bt基因的导入与表达对B916的生长没有不良影响。     

枯草芽孢杆菌抗脯氨酸结构类似物突变株的筛选及突变株proBA基因的克隆和序列分析

利用亚硝基胍对枯草芽孢杆菌93151进行诱变处理,获得了耐NaCl浓度达14％的突变株,同时发现该突变株也是一个抗脯氨酸反馈抑制突变菌株,其胞内自由脯氨酸的含量随着盐浓度的提高显著增加,说明其对渗透压的耐受能力与胞内自由脯氨酸的含量紧密相关。利用PCR方法克隆突变株的proBA基因,得到一个约2.3kb的DNA片段,序列分析表明该片段含有一完整的proB基因和部分proA基因,与野生菌株的proB基因相比,突变株proB基因中有3个碱基发生了改变,其中一个碱基的变化（从起始密码子开始第781位由T→A）导致了一个氨基酸发生改变（Ser→Thr),另外两个碱基变化为沉默位点突变。将该proB基因转入大肠杆菌脯氨酸营养缺陷型菌株,能够与其功能互补。同时对部分proA基因序列分析发现,其与proB基因头尾重叠。在proA基因起始密码子上游第14个碱基处有一个类似于SD的序列,其所编码的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌168的同源性为77％。     

枯草芽胞杆菌降解毒死蜱特性研究

研究生物量、pH、毒死蜱浓度和温度对枯草芽胞杆菌3374菌株(编号为GU086422)在水溶液中降解毒死蜱特性,考察该菌株对白菜上毒死蜱残留的降解特性。结果表明,在毒死蜱质量浓度为240 mg/L、pH7.0、温度30℃的适宜条件下,枯草芽胞杆菌3374菌株对毒死蜱的降解率达到92.48%。该菌株能够有效提高白菜叶面上毒死蜱残留的降解速度,表明其在白菜上具有有效降解毒死蜱的能力,在无公害农产品生产中具有广阔的应用潜力。     

Cloning and expression of the gene for neutral protease of Bacillus amyloliquefaciens in Bacillus subtilis

A Bacillus amyloliquefaciens neutral protease gene was cloned and expressed in Bacillus subtilis.The chromosomal DNA of B. amyloliquefaciens strain F was partially digested with restriction endonuclease Sau3AI, and 2 to 9 kb fragments isolated were ligated into the BamHI site of plasmid pUB110. Then, B. subtilis strain 1A289 was transformed with the hybrid plasmids by the method of protoplast transformation and kanamycin-resistant transformants were screened for the formation of large halo on a casein plate. A transformant that produced a large amount of an extracellular neutral protease harbored a plasmid, designated as pNP150, which contained a 1.7 kb insert.The secreted neutral protease of the transformant was found to be indistinguishable from that of DNA donor strain B. amyloliquefaciens by double immunodiffusion test and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.The amount of the neutral protease activity excreted into culture medium by the B. subtilis transformed with pNP150 was about 50-fold higher than that secreted by B. amyloliquefaciens. The production of the neutral protease in the transformant was partially repressed by addition of glucose to the medium.     

一株抑制产气荚膜梭菌的枯草芽孢杆菌BS-2特性

【背景】感染产气荚膜梭菌会引起动物坏死性肠炎,通常使用抗生素进行预防和治疗。随着我国饲料禁抗、养殖减抗的实施,寻找绿色微生态制剂及其代谢产物成为当前研究的热点。【目的】旨在研究前期筛选的一株抑制产气荚膜梭菌的枯草芽孢杆菌BS-2特性。【方法】检测了菌株生长曲线、代谢物质的抑菌特性及细菌素基因簇mRNA表达。【结果】枯草芽孢杆菌BS-2代谢物质对革兰氏阴性菌无抑制作用,而对革兰氏阳性菌具有较强的抑菌性能,并且对产气荚膜梭菌的抑菌性能在2-12 h内迅速增长,在12-24 h内抑菌性能较稳定;该抑菌性能不受胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K的影响,具有良好的热稳定性;进一步分析抑菌物质基因簇mRNA表达,发现枯草芽孢杆菌BS-2抑制产气荚膜梭菌的活性可能与表面活性素(surfactin)和美杀菌素(mersacidin)表达有关。【结论】枯草芽孢杆菌BS-2对产气荚膜梭菌具有较强的抑制作用,可能通过抑菌物质surfactin和mersacidin表达发挥作用。     

碱性蛋白酶SubC在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达

【背景】碱性蛋白酶是工业用酶中占比最大的酶类,广泛应用于清洁、食品、医疗等行业。近期研究发现碱性蛋白酶在生产生物活性肽方面有巨大潜力,这将进一步拓宽其在保健食品领域中的应用。【目的】利用枯草芽孢杆菌异源表达地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶SubC。【方法】通过筛选3种枯草芽孢杆菌宿主菌株(Bacillus subtilis 1A751、MA07、MA08)和6种信号肽(AmyE、AprE、NprE、Pel、YddT、YoqM),同时优化诱导剂浓度、发酵培养基和发酵时长,最终得到最优重组菌株MA08-AmyE-subCopt。【结果】重组菌株MA08-AmyE-subCopt的胞外酶活力为3.33×103 AU/mL,胞外蛋白分泌量为胞内可溶蛋白表达量的4倍,与携带野生型信号肽的对照组菌株WT相比,酶活提高了73.4%。【结论】异源碱性蛋白酶SubC在枯草芽孢杆菌中成功表达,为碱性蛋白酶SubC的表达和在保健食品领域的工业化应用提供了理论基础。     

芽胞杆菌产生的环脂肽类物质的研究进展

环脂肽类物质具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性,其潜在的应用价值已逐渐引起了人们的注意。主要针对芽胞杆菌产生的环脂肽,综述了环脂肽类物质的结构及分类、生理活性、生物合成机制。由于环脂肽结构的不同,分离纯化及鉴定方法也会有所差异,因此对环脂肽的分离纯化及鉴定方法方面也做了简单的综述。最后展望了我国对于环脂肽研究的不足及未来的发展前景。     

一株枯草芽孢杆菌原噬菌体Bsu-yong1的基因组分析

【目的】枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是在自然界中广泛存在的革兰氏阳性菌,其抗逆性极强,能抑制大多数有害菌的繁殖,是常用的产酶菌,用其生产的蛋白酶、淀粉酶占全球工业酶产量的50%。原噬菌体（prophage）整合在宿主基因组中,可为宿主提供基因和生物学功能,非常具有研究价值。以往,有关B. subtilis原噬菌体的报道主要集中于缺陷型原噬菌体（defective prophage）,本研究对一株非缺陷型活性原噬菌体（active prophage）的基因组进行解析,以扩充对非缺陷型原噬菌体的认知。【方法】使用丝裂霉素C从枯草芽孢杆菌中诱导一株噬菌体,命名为Bacillus phage Bsu-yong1（简称Bsu-yong1）。对Bsu-yong1进行负染、透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）观察,用Illumina MiSeq测定其基因组序列、综合运用生物信息学工具对其进行基因功能注释和系统进化分析。【结果】Bsu-yong1与PBSX类缺陷型原噬菌体在形态上相似,但Bsu-yong1具有完整的噬菌体基因组,这与缺陷型原噬菌体不同,后者在包装过程中不能正确包裹自身的基因组,而是随机包裹一段宿主染色体。Bsu-yong1基因组全长为43 590 bp,G+C含量为41%,含有62个开放阅读框（open reading frame,ORF）,呈模块化分布。Bsu-yong1拥有基因编码T7SS效应器LXG多态性毒素（T7SS effector LXG polymorphic toxin）、ImmA/IrrE蛋白和SMI1/KNR4蛋白。前二者为细菌毒素（toxin）,后者为抗毒素（antitoxin）,toxin-antitoxin是细菌免疫系统重要成员,参与菌间竞争与环境适应。此前,尚未有编码LXG polymorphic toxin的基因在噬菌体中被发现和报道。在基于全基因组比对构建的蛋白谱进化树（proteomic tree）中,Bsu-yong1与噬菌体sv105、rho14、vB_BteM-A9Y聚集形成一个独立的进化支（clade）,基因组比对显示它们基因组的复制与调控模块具有高度保守性,它们共享29个核心基因（core gene）,均具有PBSX样形态特征。Bsu-yong1与其他噬菌体的进化距离较远。将Bsu-yong1与所有噬菌体进行比对,得到的成对序列比较（pairwise sequence comparison,PASC）最大值为46.72%,小于属边界值（70%）。【结论】vB_Bsu-yong1在有尾纲中代表一个新的未知的属;建议构建一个新的科（family）,该科由Bsu-yong1与噬菌体sv105、rho14、vB_BteM-A9Y组成。vB_Bsu-yong携带免疫相关基因,它可能有利于宿主在菌间竞争中获胜和适应环境。本研究丰富了噬菌体基因数据库,拓展了对芽孢杆菌活性原噬菌体的认知。     

菌株YN145对稻瘟病菌黑色素合成的影响及全基因组分析

【背景】枯草芽孢杆菌YN145是一株从湖南省桃江县的健康稻株中分离的细菌,前期研究中该菌对稻瘟病菌拮抗效果显著,在生物防治方面有很大的应用潜力。【目的】深入研究该菌株的生防机制并挖掘次级代谢产物基因资源。【方法】在4株稻瘟病菌生防菌中,选择其胞外抗菌物质抑制稻瘟病菌黑色素合成效果最佳的菌株YN145,采用紫外-可见分光光度计在波长400 nm处测定胞外和菌丝体内黑色素液的吸光度值,采用菌丝生长抑制平板法和分生孢子萌发抑制法测定抑菌活性。采用PacBio第三代测序和IlluminaHiSeq第二代测序相结合的技术对菌株YN145进行全基因组测序,并对测序数据进行组装,注释预测基因的功能,分析次级代谢产物合成基因簇。【结果】菌株YN145的胞外抗菌物质能较好地抑制稻瘟病菌黑色素合成、分生孢子萌发和菌丝生长。菌株YN145全基因组大小为4 167 871 bp,GC含量为43.86%,编码序列(coding sequence, CDS)数量为4 294个;共找到85个tRNA、30个rRNA和92个sRNA。同时预测到5个已知的次级代谢产物合成基因簇,分别编码合成bacillaene、bac...     

枯草芽孢杆菌中高效响应N-乙酰神经氨酸生物传感器的构建

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是公认的食品安全菌株,目前已被用于多种高附加值产品的生物合成,包括被广泛用作营养化学品和药物中间体的N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, NeuAc)。响应目标产物的生物传感器被广泛用于代谢工程中的动态调控和高通量筛选等方面,以提高生物合成效率。但是,枯草芽孢杆菌中缺乏可高效响应NeuAc的生物传感器。因此,本文首先测试和优化了能将胞外NeuAc转运进胞内的转运蛋白,获得了一系列具有不同转运能力的菌株,以用于后续响应NeuAc的生物传感器的验证;随后将响应NeuAc的转录因子Bbr_NanR的结合位点插入枯草芽孢杆菌组成型启动子的不同位置,筛选具有活性的杂合启动子;接下来,通过在具有NeuAc转运能力的枯草芽孢杆菌中表达Bbr_NanR,选择能响应NeuAc的杂合启动子,并进一步通过优化Bbr_NanR表达量获得了一系列动态范围广、激活倍数高的生物传感器,其中生物传感器P535-N2能灵敏地响应胞内NeuAc浓度的变化,具有最大的动态范围,为(180–20 245) AU/OD;P566-N2则具有最高的激活倍数,为122倍,是已报道的枯草芽孢杆菌中响应N-乙酰神经氨酸的生物传感器的2倍。本文构建的响应NeuAc的生物传感器可用于高产NeuAc的酶突变体和枯草芽孢杆菌菌株的筛选,为枯草芽孢杆菌生物合成NeuAc提供了高效、灵敏的分析和调控工具。