8份广西产绞股蓝种质的RAPD引物筛选及其遗传多样性分析

本研究的目的在于筛选合适的RAPD随机引物,应用RAPD技术对药用植物绞股蓝进行遗传多样性分析,并构建DNA指纹图谱。研究结果表明,我们利用生物信息学方法挑选出的20条引物中有19条引物的扩增条带清晰且多态性好;在清晰稳定出现的354条带中,294条具有多态性;其中有3条引物的扩增条带可清楚区分绞股蓝与混淆品种乌蔹莓,可建立其DNA指纹图谱。按UPGMA法进行聚类分析,计算其遗传相似系数,结果显示,8份绞股蓝供试材料聚为两类,聚类结果与其地理区域远近和生长环境一致。本研究中筛选出的19条引物适用于绞股蓝遗传多样性分析,且获得的DNA指纹图谱可用于鉴别绞股蓝。     

RAPD 技术在药用植物绞股蓝鉴别中的初步研究

运用RAPD技术对绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)及其伪品进行DNA指纹图谱的鉴别研究.采用改进的CTAB法提取七叶绞股蓝、五叶绞股蓝、乌蔹莓(Cayratia japonica)3种植物的总DNA,主要以七叶绞股蓝DNA为模板,采用随机引物WGS001进行PCR扩增,对反应体系包括模板、Mg2 、Taq酶、牛血清白蛋白(BSA)、退火温度进行优化.优化的反应体系总体积25 μL ,含MgCl2 2 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、引物 0.4 μmol/L、模板60 ng、Taq 酶1 U、BSA 2 μg/μL,退火温度58℃.用10条含20个碱基的随机引物对以上3种植物总DNA作PCR扩增,进行引物筛选.筛选得到的两条随机引物(WGS001、WGS004)可扩增得到识别这些物种基因组DNA的多态性片段.这些片段可以有效地鉴别绞股蓝和乌蔹莓.     

耐盐绒毛白蜡特异性SCAR分子标记的鉴定

该研究以耐盐型和盐敏感型绒毛白蜡及其F1代为材料,采用混合品系分析法进行RAPD分析。结果显示:在随机选取的150个10碱基随机引物中,仅有引物S20在耐盐基因池和盐敏感基因池间扩增出特异而可重复的592bp的多态性片段,命名为S20-592。获得的RAPD标记S20-592经克隆、测序、重新设计一对特异性引物转化成更稳定的SCAR标记。通过F1代个体验证,耐盐型个体均能扩增出此差异条带而盐敏感型个体中不能扩增出此差异条带,证明该SCAR标记的特异引物可用于耐盐绒毛白蜡物种的快速分子鉴定。     

卡瓦胡椒SCAR标记的研究

目的：采用6份卡瓦胡椒材料、21份栽培胡椒和野生胡椒材料、1份不同属的草胡椒材料共计28份试验材料,开发1对特异SCAR引物。方法：在对它们进行了RAPD研究的基础上,通过克隆、测序和引物设计进行了SCAR分子标记研究。结果：本研究开发了1对特异SCAR引物P10．1和P10．2,用这对特异引物对本次试验的28份材料进行PCR扩增,结果显示,6份卡瓦胡椒材料扩增出了三条带,三条带离的较近,中间一条为预期494bp特异片段。其它胡椒属材料均扩增出一条494bp的特异带,而不同属的草胡椒无任何扩增。结论：这说明引物P10．1和P10．2适用于卡瓦胡椒的分子鉴定(三条带),也可用于胡椒属植物的分子鉴定(一条带),这对卡瓦胡椒种质资源的真伪鉴定及胡椒属植物的分子分类有一定帮助。     

补肾益气大麦茶

乌蔹莓（Cayratiajaponica）是一种在华东、中南至西南等地广泛分布的葡萄科草质藤本植物,常生长在旷野、山谷和林中。该植物具有掌状复叶,小叶５枚成鸟爪状;聚伞花序;浆果倒卵圆形,熟时黑色,不难识别。近年,在一些报刊上屡见有人撰文指出乌蔹莓易与绞股蓝混淆,应注意区分。其实乌蔹莓本身也是一种很有价值的草约,应合理地开发利用。乌蔹莓全草含阿拉伯聚糖、沾液质、硝酸钾、甾醇、氨基酸、酚性成分、黄酮类。根含生物碱、鞣质、淀粉、树胶。果皮中含乌蔹甙（cayratinin）。乌蔹莓性味苦、酸、寒,无毒。对人体可清热、利湿、解…     

穿山甲标本和甲片的DNA提取及PCR扩增

为验证经处理后的穿山甲(Manis spp.)标本和甲片是否可以用于种间分子鉴定标记的开发及个体识别工作,本文在样品的预处理、消化、提取后纯化等方面对传统提取方法进行了改进,分别从穿山甲剥制标本、干皮标本及甲片中提取总DNA;然后用Cyt b基因扩增通用引物、12S rRNA基因全序列扩增引物、RAPD引物及微卫星引物进行了PCR扩增,并对部分扩增结果进行了序列测定.结果表明,除剥制标本的脚底皮张组织外,其他样品基本都可以提取出DNA.以此为模板的PCR扩增中,2种线粒体基因引物扩增出明显目的条带,RAPD引物扩增出种间特异条带,测序结果可用于种间特异性引物及SCAR引物的开发;微卫星引物在甲片样品中扩增稳定,可用于个体识别工作.     

微卫星(TATG)n基序在香菇菌种中的验证

以（TATG）4重复序列为引物对香菇属的3个种13个菌株的微卫星区DNA进行PCR扩增,15%的琼脂糖凝胶电泳,获得了25个条带,并且在供试菌株上表现出多态性,可以实现遗传分类研究。为了验证微卫星分子标记实验准确性,又用RAPD技术对13个供试菌株进行了实验。7个引物在13个菌株上共获得了102条多态性条带。通过聚类分析,RAPD获得的分类结果与微卫星分子标记获得的结果一致。此外,为了证明微卫星分子标记获得的条带不是假阳性,在实验中回收了No.10菌株的PCR扩增产物,进行克隆测序。测序结果显示有（TATG）n基序存在,并且达到了微卫星基序重复数量的最低限度。通过本实验可知,香菇中是存在微卫星（TATG）n基序的, 且基序的多态性可以用于香菇的遗传分类研究。     

卡瓦胡椒SCAR分子标记的研究

目的:采用6份卡瓦胡椒材料、21份栽培胡椒和野生胡椒材料1、份不同属的草胡椒材料共计28份试验材料,开发1对特异SCAR引物。方法:在对它们进行了RAPD研究的基础上,通过克隆、测序和引物设计进行了SCAR分子标记研究。结果:研究开发了1对卡瓦胡椒特异SCAR引物P4.1和P4.2,用这对特异引物对试验的28份材料进行PCR扩增,结果只有6份卡瓦胡椒材料扩增出了预期大小562bp的特异带,其它材料均无任何扩增。结论:这说明引物P4.1和P4.2为卡瓦胡椒特异SCAR引物,可用于卡瓦胡椒的分子鉴定,这对卡瓦胡椒种质资源的真伪鉴定有一定帮助。     

马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫SCAR标记的建立及应用

为了探索快速鉴定马铃薯瓢虫Henosepilachna vigintioctomaculata(Motschulsky)和茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata(Fabricius)的分子生物学方法,本研究在随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)的基础上,分别设计了可以鉴别两个物种的序列特征扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)标记。从随机合成的60条引物中筛选出来2条特异性引物(分别为OPI-6和OPJ-15),引物OPI-6在马铃薯瓢虫中扩增出约750 bp的特异性条带,引物OPJ-15在茄二十八星中扩增出约750 bp的特异性条带,根据测序结果设计了两对SCAR引物对筛选结果进行验证,发现根据OPI-6的测序结果所设计的SCAR引物(OPI-6 test)仅能在马铃薯瓢虫中扩增出645 bp的条带,而根据OPJ-15的测序结果所设计的SCAR引物(OPJ-15 test)仅能在茄二十八星瓢虫中扩增出436 bp的条带。这两对SCAR引物能够准确、稳定且快速地区分马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫,对这两种害虫的精准防控具有重要意义。     

截形叶螨分子鉴定技术的建立及其应用

叶螨体型微小,田间种群变异较大,传统的形态鉴定方法耗时长,技术难以掌握。为了寻找截形叶螨Tetranychus truncatus Ehara的快速分子鉴定技术,本研究筛选RAPD扩增条带中截形叶螨的特异性引物,并由此转化为稳定的SCAR标记。结果表明,由引物OPB-04扩增截形叶螨出现了一条717 bp的特异性条带(GenBank登录号为JF816665),基于此片段设计了一对特异性的SCAR引物(Tt-303F和Tt-303R),优化PCR扩增条件和程序,从截形叶螨的不同发育阶段中均可成功扩增出一条特异性的303 bp的DNA条带,而在其它近似叶螨种类中未扩增到该条带,且该SCAR引物对在北京地区茄子和菜豆寄主上采集的截形叶螨田间种群上也成功得到了验证。     

绞股蓝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析

目的:克隆并分析绞股蓝法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因的全长序列。方法:参照罗汉果法呢基焦磷酸合酶基因,设计扩增绞股蓝FPS基因的3′RACE引物,采用3'RACE和5'RACE法克隆绞股蓝FPS基因全长cDNA。结果:获得绞股蓝FPS基因全长cDNA序列共1288个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放读框,编码342个氨基酸残基,推断该蛋白的相对分子质量为3.94×104。NCBI Blast结果显示绞股蓝FPS基因编码蛋白的氨基酸序列与已知的植物FPS氨基酸序列的同源性为91%~74%,核酸序列的同源性为88%~78%。结论:克隆了绞股蓝FPS基因全长cDNA序列,为进一步研究绞股蓝FPS基因的表达及三萜皂苷合成通路关键酶分子的进化奠定了基础。     

温度对绞股蓝和五柱绞股蓝生长及总皂苷积累的影响

温度是影响绞股蓝生长发育和总皂苷积累的重要环境因子之一。将绞股蓝和五柱绞股蓝幼苗置于10、15、20、25℃和30℃的光照培养箱中处理40d,检测其形态指标和总皂苷含量。结果表明:在25℃条件下,绞股蓝的叶面积、叶柄长、茎长、新萌叶片数、生物量和总叶绿素含量均为最高,五柱绞股蓝的生长发育也具有类似的规律,因此推断25℃是绞股蓝和五柱绞股蓝生长发育的适温条件。绞股蓝和五柱绞股蓝的总皂苷含量则以30℃下最高。绞股蓝的生物量和总皂苷含量决定了总皂苷产量,25～30℃最有利于提高绞股蓝的总皂苷产量,30℃则是提高五柱绞股蓝总皂苷产量的最适温度。     

八大公山自然保护区绞股蓝伴生群落特征研究

对八大公山国家级自然保护区的绞股蓝伴生群落特征进行了研究.结果表明,异叶榕、尾叶山茶和水马桑等是常见的对绞股蓝具有遮荫作用的乔灌层植物.绞股蓝伴生群落计有47科86属102种维管植物,以蓼科、伞形科、菊科和百合科种类较多,绵毛金腰是伴生群落的优势种,它与冷水花、吉祥草、楼梯草和箬竹等是绞股蓝的重要伴生种.伴生群落的物种多样性指数表明整个环境适于绞股蓝的生长.     

The direct release of nitric oxide by gypenosides derived from the herb Gynostemma pentaphyllum.

Herbal medicines are increasingly being utilized to treat a wide variety of disease processes. Gypenosides are triterpenoid saponins contained in an extract from Gynostemma pentaphyllum and are reported to be effective in the treatment of cardiovascular diseases; however, the mechanism underlying the therapeutic effect is not known. We tested the hypothesis that gypenosides extracted from G. pentaphyllum elicit vasorelaxation through the direct release of endothelium-derived nitric oxide. Nitric oxide production in bovine aortic endothelial cells grown under standard tissue culture conditions was quantitated using a chemiluminescence method. Arterial vasomotion was assayed using isolated porcine coronary artery rings under standard isometric recording conditions. The extract of G. pentaphyllum at 0.1-100 microg/ml elicited concentration-dependent vasorelaxation of porcine coronary rings that was antagonized by the nitric oxide synthase inhibitor N(G)-nitro-l-arginine methyl ester. Indomethacin had no significant effect on G. pentaphyllum-induced relaxation. The G. pentaphyllum extract elicited a concentration-dependent increase in nitric oxide production from cultured bovine aortic endothelial cells. At the concentrations utilized, there was no morphological evidence for cellular toxicity. These results demonstrate that extracts of G. pentaphyllum directly stimulate nitric oxide release, but not prostanoid production. Nitric oxide production in response to gypenosides may be one mechanism whereby this herbal medicine elicits its therapeutic effects.     

绞股蓝β-香树脂醇合酶基因的克隆和序列分析

为克隆绞股蓝的β-香树脂醇合酶基因(β-amyrin synthase,bAS),探讨绞股蓝bAS的性质特征及其与绞股蓝三萜生物合成及调控的可能关系。本研究根据绞股蓝转录组测序的结果设计合成bAS全长扩增引物,采用RT-PCR技术扩增绞股蓝bAS的开放阅读框架(open reading frame,ORF)全长序列并连接克隆载体进行测序,利用ExPASy等在线工具及MEGA-X软件对测序结果做相应的生物信息分析。测序结果显示绞股蓝bAS的cDNA的ORF全长共2 283 bp,编码760个氨基酸。该序列信息已提交GenBank,登录号为GM251742。对绞股蓝bAS的氨基酸序列进行了性质与结构预测和系统发育分析。bAS的全长cDNA序列的成功克隆,为绞股蓝bAS基因结构与功能研究提供了基础,并可为研究绞股蓝三萜合成通路的调节方式提供新的认识。     

洋葱细胞质雄性不育系70及其保持系71基因组DNA的RAPD分析

采用RAPD技术,对洋葱细胞质雄性不育系70及其保持系71的基因组DNA的多态性进行分析。结果表明,在被检测的100条随机引物中,46条引物具有扩增产物,5条引物扩增出多态性条带。对这5条引物进行重复筛选和单株验证,只有G02扩增出的多态性片段,且表现稳定。推测该标记与育性有关。     

Heat-processed Gynostemma pentaphyllum extract improves obesity in ob/ob mice by activating AMP-activated protein kinase

Gynostemma pentaphyllum is widely used in Asian countries as a herbal medicine to treat dyslipidemia, type 2 diabetes and inflammation. An ethanol extract of G. pentaphyllum lessened obesity by activating AMP-activated protein kinase (AMPK). The levels of damulins A and B, components responsible for AMPK activation in the extract, were increased by autoclaving in a time-dependent manner. Heat-processed G. pentaphyllum extract, actiponin containing damulins A (0.93?%, w/w) and B (0.68?%, w/w), significantly stimulated fat oxidation and glucose uptake via AMPK activation in L6 myotube cells. Oral administration of actiponin to ob/ob mice for 8?weeks decreased body weight gain, liver weight, and blood cholesterol levels with AMPK activation in the soleus muscle. Our results demonstrate the beneficial effect of G. pentaphyllum on improving obesity and have elucidated the underlying molecular mechanisms.     

云南西双版纳野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌根真菌的分子多样性

采用巢式-PCR、DNA克隆测序技术,对西双版纳地区野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌根真菌(AMF)进行群落结构多样性研究.试验共获得551个含有丛枝菌根真菌18S rDNA 片段的克隆子,经限制性片段长度多态性分析,得到100个RFLP类型,将其划分为20个序列类型,分属于7个科.将20个序列类型的相关序列与GeneBank数据库进行比对,有5个可以鉴定到种,分别为Glomus viscosum、Claroideoglomus etunicatum、Racocetra tropicana、Acaulospora spinosa、Acaulospora mellea.与 MaarjAM数据库中序列进行比对,12个可鉴定为虚拟分类分子种,其中7个未在孢子形态学鉴定方法中获得.西双版纳地区野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌根真菌群落组成差异极显著.野生绞股蓝根内Glo₂、Amb₁、Para₁为优势类群,而栽培绞股蓝根内Glo₃、Glo₈、Glo₁₀、Div₁为优势类群.Claroideoglomeraceae和Ambisporaceae仅在野生样本中出现,而Diversisporaceae仅在栽培样品中出现.     

绞股蓝属三种植物的POD、EST和SOD同工酶研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对绞股蓝属的五柱绞股蓝、广西绞股蓝和绞股蓝3种植物的POD、EST和SOD同工酶进行了比较研究。结果表明,3种绞股蓝的3种同工酶谱带不同。3种同工酶在广西绞股蓝上表现最强。3种同工酶在同一物种不同器官中的表达具有一定差异,以叶中的表达最强,茎次之,根最弱。由同工酶推断的3种绞股蓝的亲缘关系为绞股蓝与广西绞股蓝亲缘关系较近,与五柱绞股蓝亲缘关系较远。     

甘草亲缘关系的RAPD鉴定

以不同地区的3种15组甘草(Glycyrrhiza uralensis、G．infleta、G．glebra)种子为材料,探讨RAPD分子标记在研究、鉴定甘草亲缘关系中的可行性。从50个随机引物中筛选出9个有效引物,9个引物共扩增出961条DNA带,其中多态性条带811条,占总扩增条带的84．4％。对扩增出来的961条DNA带进行分析,结果表明：15组甘草植物的平均遗传距离为0．41,其中采自甘肃民勤野生甘草与采自新疆布尔津乌拉尔野生甘草遗传距离最小,为0．26;而采自内蒙古杭锦旗上海升袖的野生甘草与采自青海贵德的乌拉尔野生甘草遗传距离最大,为0．63。由RAPD聚类分析结果得出15组甘草植物之间的亲缘关系与形态学分类结果存在差异。