水稻抗s－氨乙基半胱氨酸细胞突变体的筛选

应用水稻花药培养技术,通过对抗s－氨乙基半胱氨酸(AEC)突变体的选择,研究了细胞水平筛选高含量赖氨酸水稻种质的效果。结果表明,AEC可抑制水稻花药(粉)愈伤组织的形成与生长,用O．5mmol,L AEC进行诱导或继代筛选,可获得抗性愈伤组织并再生绿苗,但仅有少数个体自然加倍正常结实,并保持对AEC的抗性。经多代选择与鉴定,获得了丰产优质突变体A一87306,其糙米游离赖氨酸含量0．43％,较对照增加34．38％。初步认为以AEC为外源胁迫因子,离体筛选水稻高赖氨酸含量的细胞突变体是有效可行的。     

水稻抗氨基酸类似物突变体的筛选——Ⅰ.抗S-(2-氨乙基)L-半胱氨酸(AEC)突变体的筛选

以赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)L-半胱氨酸(AEC)为选择剂,从水稻花药培养中筛选出一个抗性突变体(R_(AEC))。突变体愈伤组织经过6个月继代培养后仍保持抗性稳定。R_(AEC)再生植株根尖诱导的愈伤组织经过3个月继代培养也保持稳定的抗性。R_(AEC)细胞内赖氨酸含量提高了近2倍,苏氨酸提高5倍多。其他氨基酸,如蛋氨酸、酪氨酸、丝氨酸等都有较大量的提高。 R_(AEC)愈伤组织对赖氨酸加苏氨酸混合物也具有抗性。突变体植株较原始类型稍矮小,巳正常结实。     

通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc

利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ldc进行随机突变,在大肠杆菌Escherichia coli JM109中构建赖氨酸脱羧酶突变体库。从E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基因cad A和ldc。查询NCBI数据库得知,二者的同源性为75%。分别构建重组质粒p Trc99a-cad A和p Trc99a-ldc,以此2种质粒为模板,经PCR扩增,获得目的基因片段,分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点,用多种限制性内切酶碎片化2种基因,切割成不同大小的片段。这些小片段进行不同组合,突变体经过LBXL平板初筛和高效液相色谱(HPLC)复筛,获得1株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体,编号为LDC2-16,其比酶活为4 869.86 U/mg(以1 mg总蛋白计),与2种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶Cad A(1 652.63 U/mg)、Ldc(2 365.93 U/mg)相比,在最适温度37℃、p H 6.0时,突变体的比酶活分别是上述野生型酶的2.95和2.06倍。摇瓶发酵5 h后,目标产物1,5-戊二胺产量从46.9提高至63.9 g/L,提高了36%。     

定点突变提高青霉素G酰化酶的稳定性

以大肠杆菌青霉素G酰化酶的晶体结构为模板 ,用软件PMODELING同源模建巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的三维结构。在此基础上 ,将 β亚基 4 2 7位 (突变A)和 4 3 0位 (突变B)赖氨酸残基突变为丙氨酸 ,降低了该酶的等电点 ,增加了疏水性 ,从而提高其在酸性和有机溶剂环境中的稳定性。两个突变体与亲本相比 ,比活力和Km相近 ,最适pH减少了 0 .5个单位 ,突变B在 pH 5 .2的溶液中的稳定性明显提高。突变A和B在 15 %DMF中的半衰期分别比亲本酶提高了 60 %和 166%     

谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶G359D突变解除赖氨酸与苏氨酸协同抑制的研究

天冬氨酸激酶(Aspartate Kinase,AK)是赖氨酸合成途径中关键酶,其受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制,旨在发现其解除协同抑制的新突变体并解析其机理。通过对赖氨酸高产菌Corynebacterium glutamicum ZL5与野生型C.glutamicumATCC 13032的天冬氨酸激酶氨基酸序列比对,发现在高产菌的天冬氨酸激酶中存在G359D突变。通过体外天冬氨酸激酶野生型和G359D突变体酶活检测,发现该G359D突变体在10 mmol/L赖氨酸和苏氨酸同时存在时仍保留了76.94%±1.61%的酶活,而野生酶的酶活仅残留4.38%±1.28%。这一结果在赖氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌的回复突变中也可得到验证,其回复突变后使赖氨酸产量下降15.57%。通过同源建模和结构分析发现,与野生酶相比,G359D突变体结合赖氨酸后,其位于活性中心附近的Arg151与Glu74之间无法形成离子键,允许底物分子的结合而具有较高活性。发现天冬氨酸激酶G359D突变体可阻断赖氨酸引起的别构效应,从而有效解除赖氨酸与苏氨酸的协同抑制。     

小麦黄化突变体光合作用及叶绿素荧光特性研究

对小麦自然黄化突变体及其突变亲本(西农1718)的叶绿素含量、光合速率及叶绿素荧光动力学参数进行比较分析.结果显示:(1)突变体金黄株、绿黄株、黄绿株的叶绿素含量均显著低于突变亲本,总叶绿素含量分别为突变亲本的17%、24%和58%,表明该突变体为叶绿素缺乏突变体;3个突变体叶绿素a与叶绿素b的比值(Chl a/Chl b)均小于突变亲本,而且突变体叶绿素含量越低,Chl a/Chl b比值越小,说明该突变体Chl a下降幅度大于Chl b.(2)金黄株净光合速率在孕穗期、开花期仅为突变亲本的5.7%、2.4%;绿黄株净光合速率显著低于突变亲本,为突变亲本的57.7%、43.3%;而叶绿素含量仅为突变亲本一半的黄绿株,其净光合速率接近突变亲本,表明该黄化突变体叶绿素含量在一定范围内单位叶绿素含量的光合效率较高.(3)突变体Fo均显著低于突变亲本;金黄株、绿黄株的Fm,Fv,qP,qN显著低于突变亲本;金黄株Fv/Fm比值(0.671)显著低于突变亲本.研究表明,叶绿素含量在一定范围内减少,未引起突变体叶绿素荧光动力学参数(Fo除外)显著改变,而当叶绿素含量较大程度减少时,这些荧光参数会急剧降低.     

禾谷镰孢霉nit突变体的诱导及其生物学特性

将3个抗多菌灵和2个野生敏感型禾谷镰孢霉(Fusarium graminearum)菌株分别在含氯酸盐的MMC培养基上培养,共得到22个不能利用硝酸盐的营养缺陷突变体(Nitrate nonutilizing mutant, 简称nit突变体)。比较了各nit突变体与其亲本菌株之间在菌落生长速率、培养性状、产分生孢子能力、产子囊壳能力以及对多菌灵的敏感性等生物学特性方面的变化。结果表明,nit突变体均抗氯酸盐,在PSA平板上的生长速率没有改变,有性生殖能力没有下降,在Joffs 培养液和5%绿豆汤培养液中仍能产孢,但产孢量与亲本菌株有差异。此外,禾谷镰孢霉对氯酸盐和多菌灵之间没有交互抗药性。因此,可用nit作为遗传标记,研究禾谷镰孢霉有关性状的遗传学。     

Tn5介导的致病性副溶血弧菌溶血能力差异突变株表型分析

【目的】构建致病性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)突变体库,分析溶血能力差异突变株表型特征,为深入挖掘和认识tdh的调控机制提供研究基础。【方法】利用双亲本接合法,将Mini-Tn5-Km2片段随机插入致病性Vp (ATCC 33846)基因组,并以含有卡那霉素(Km)和氨苄青霉素(Amp)的TCBS选择性培养基进行突变株(KmRAmpS)筛选;结合PCR方法对突变菌株进行Km基因筛查,构建在不同基因位点随机插入突变的Vp突变体库。以我妻氏血平板筛选溶血表型变化菌株,并对其生长曲线、菌膜形成能力和运动能力进行测定。【结果】采用双亲本接合法,成功建立包含490株Vp突变株的突变体库,并获得5株溶血表型变化稳定的菌株(2株为溶血能力上调,3株为下调)。5株突变株在生长速率、菌膜形成能力及运动能力方面与亲本株有显著性差异。其中,2株溶血能力上调菌株及1株溶血能力下调菌株在运动能力、生长速率和菌膜形成能力方面较亲本株显著降低(P<0.05);另2株溶血能力下调菌株菌膜形成能力较亲本株显著提高(P<0.05)。【结论】Tn5转座子可用于建立Vp突变体库;Vp溶血能力与其表型特征具有相关性;研究所获得的5株溶血表型突变株为进一步探讨Vp tdh的调控机制奠定基础。     

蒲公英耐盐突变体‘滨蒲1号'的耐盐性研究

土壤盐渍化是当今农业生产上的重要危害之一,它严重影响当地农作物的生长、发育及产量的提高。为了提高盐碱地的利用效率,该文以蒲公英耐盐突变体‘滨蒲1号’及其亲本叶片为材料进行丙二醛(MDA)含量等8种生理指标的测定,同时利用cDNA-RAPD技术对蒲公英耐盐突变体及其亲本根胁迫0、12、24 h的差异表达基因进行分析。结果表明:(1)突变体‘滨蒲1号’叶片中脯氨酸含量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量、CAT活性、POD活性、SOD活性在不同胁迫时间点均大体高于亲本; MDA含量、相对电导率低于亲本。(2)以筛选出的10条RAPD引物进行cDNA-RAPD分析,共扩增出22条清晰的条带,差异条带10条,多态性为45.4%。(3)扩增产物片段大小在150～1 000 bp之间,主要为盐抑制基因片段,推测蒲公英耐盐突变体‘滨蒲1号’的耐盐性既与渗透调节物质脯氨酸及多种抗氧化酶上升引起的保护作用有关,也与根中一些与耐盐相关的基因表达变化有关。该研究为进一步克隆蒲公英耐盐基因并利用基因工程手段培育耐盐优质的蒲公英新品系奠定一定的理论基础。     

小麦黄化突变体叶绿体超微结构研究

利用透射电镜对小麦自然黄化突变体及其突变亲本(西农1718)叶片细胞叶绿体的数目、形态及超微结构进行比较分析。结果发现:(1)3种不同黄化程度突变体的叶绿体分布、数目、形状及大小与突变亲本无明显差异;(2)突变体叶绿素含量为野生型58%的黄绿植株与其突变亲本叶绿体超微结构无明显差异,基质类囊体与基粒类囊体高度分化,基粒数目以及基粒片层数目较多;(3)突变体金黄和绿黄植株的叶绿素含量分别为野生型的17%、24%,其叶绿体超微结构与突变亲本明显不同,突变体的叶绿体发育存在明显缺陷,其中突变体金黄植株的叶绿体内无基粒、基质片层清晰可见,有淀粉粒,嗜锇颗粒较多,而突变体绿黄植株的叶绿体内有基粒,但明显少于突变亲本,且基粒片层较少,基质类囊体较发达。结果表明该黄化突变体叶绿体超微结构的改变,是由于叶绿素含量降低造成,推测,该黄化突变是由于叶绿素合成受阻导致的。     

研究枯草杆菌孢子形成的新途径

采用简单的选择技术,从枯草杆菌(Bacillus subtils)中选择到一类在代谢物阻遏的条件下,仍能形成孢子的突变体。用来进行研究的突变体在以硫铵为氮源、葡萄糖为碳源的最低培养基上能够正常生长。用这些突变体进行的研究表明:一种诱导酶——3-羟基丁酮脱氢酶的代谢物阻遏和孢子形成的代谢物阻遏之间,并无紧密的相关。其中有些突变体在加各种测试碳源的条件下,都能形成孢子;另外一些突变体却只对用来分离突变体的碳源有抗性。这就表明对于孢子形成的代谢物阻遏,是受几个代谢步骤的影响的。     

异三聚体G蛋白在NAA诱导的拟南芥根生长发育中的作用

以拟南芥的野生型(ws)、异三聚体G蛋白α亚基基因GPA1缺失突变体(gpa1-1,gpa1-2)和超表达突变体(wGα,cGα)为材料,通过施加不同浓度(0~0.2 mg/L)的NAA处理,对拟南芥根生长发育的一些形态指标进行了观测比较.结果表明:(1)随着培养基中NAA浓度的不断升高,5种基因型主根的伸长生长均受到抑制,且抑制作用随浓度升高而增强;4种突变体和野生型主根的生长在相同浓度NAA处理下,无明显差异;(2)NAA在一定浓度范围内,对拟南芥侧根的生长发育起促进作用;在NAA诱导的侧根生长中,G蛋白超表达突变体比野生型更敏感,缺失突变体则不敏感.初步证明G蛋白不参与主根生长发育的调节,而在侧根生长发育中可能起正调节作用.     

禾谷镰孢霉nit突变体的诱导及其生物学特性*

将3个抗多菌灵和2个野生敏感型禾谷镰孢霉(Fusarium graminearum)菌株分别在含氯酸盐的MMC培养基上培养,共得到22个不能利用硝酸盐的营养缺陷突变体(Nitrate nonutilizing mutant, 简称nit突变体)。比较了各nit突变体与其亲本菌株之间在菌落生长速率、培养性状、产分生孢子能力、产子囊壳能力以及对多菌灵的敏感性等生物学特性方面的变化。结果表明,nit突变体均抗氯酸盐,在PSA平板上的生长速率没有改变,有性生殖能力没有下降,在Joffs 培养液和5%绿豆汤培养液中仍能产孢,但产孢量与亲本菌株有差异。此外,禾谷镰孢霉对氯酸盐和多菌灵之间没有交互抗药性。因此,可用nit作为遗传标记,研究禾谷镰孢霉有关性状的遗传学。     

一个新的小麦黄化突变体的遗传研究

摘要: 通过对冬小麦“西农1718” 自然黄化突变体多年连续自交、与突变亲本回交以及与其他基因型进行正反交, 研究突变性状的遗传规律。观察统计发现, 突变体中金黄株发育至抽穗－开花期前后死亡, 黄-绿株自交后代表现为1金黄株︰2黄-绿株︰1绿株, 绿株自交后代不再分离; 黄-绿株与突变亲本回交及与其他基因型正反交, 后代均表现为1黄-绿株︰1绿株。遗传分析表明, 该小麦黄化突变体是由一对核基因控制的不完全显性遗传, 其中, 金黄株是纯合体(au/au), 表现为致死, 黄-绿株为杂合体(Au/au), 绿株为纯合体(Au/Au)。     

抗4-氧赖氨酸的烟草愈伤组织突变体质体超微结构的初步观察(简报)

用连续光照培养反复选择,从Wo分离出绿色(gy)与白色(W22)两系表现型。对OL的抗性和过氧化物酶同工酶酶谱两系未见显著差异。W22的赖氨酸含量较yg的低。yg的叶绿体含淀粉粒,同一细胞内未见含突变质体。在W22则未见叶绿体,而见造粉质体和突变的质体。     

芦笋抗S—（2—氨乙基）—L—半胱氨酸（AEC）变异体的筛选

S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)可抑制芦笋愈伤组织的生长,此抑制作用可被赖氨酸或甲硫氨酸部分解除。用0.5mmol/L的AEC进行筛选,得到抗性愈伤组织AR10并再生植株。AR10愈伤组织经一年多的继代培养,在离开选择剂组培继代两代后仍保持对AEC的抗性。抗性系愈伤组织还表现出对2mmol/L的半胱氨酸具交叉抗性,对1mmol/L的赖氨酸加苏氨酸表现部分交叉抗性。AR10再生植株一部分保持对AEC的抗性,而一部分则无抗性。对抗性愈伤组织及其再生植株的氨基酸分析表明,愈伤组织内游离赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸都有增加,而在再生植株内却发现半胱氨酸和赖氨酸的特异性增加,分别是对照植株的5.4和4.6倍。     

棘孢小单孢菌和灰色链霉菌原生质体融合的研究

用庆大霉素产生菌——棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora 814(Gm~r,Km~r)和链霉素产生菌Streptomyces griseus No. 45(Sm~r,Lm~r)进行了原生质体融合。以抗性为选择标记,选出了融合体。其融合频率在10~(-3)—10~(-4)之间。在电镜条件下,观察了原生质体融合的详细过程,测定了融合体的产抗生素能力,其中一株融合体F106的抗生素产量比亲本菌株814高58％。用羧甲基纤维素薄层对发酵液层析表明,有一个融合体的发酵液比亲本菌株814多一个组份,但没有测出其生物活性。     

兰属春剑叶艺突变体叶片结构的研究

以兰属春剑(Cymbidium tortisepalum Fukuy.var.longibracteatum)叶色突变体‘隆昌素’及其亲本为材料,采用石蜡切片、扫描电镜及透射电镜对叶片的组织结构、扫描结构和超微结构进行了观察。结果显示,春剑叶色突变体叶片的表皮厚度和叶肉细胞面积均大于亲本,但导管数量少于亲本;叶片上、下表皮纹饰与亲本具有明显差异;气孔密度和面积均小于亲本,且气孔闭合度较大,占总气孔数的56%;突变体的叶绿体呈高密度的囊泡状结构,内部严重解体,体积较小的嗜锇滴聚集分布,无基粒片层,无淀粉粒。本研究表明经组培诱变的春剑叶色突变体的叶片结构与亲本存在明显差异。     

逆境下拟南芥野生型和突变体sex1游离态水杨酸含量及根形态差异

以拟南芥野生型(WT)和突变体sex1为材料,采用HPLC、显微观察等方法,研究了WT在10个不同生长期时游离态水杨酸(SA)含量的变化,比较了在丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst.DC3000)、H2O2、甲基紫精(MV)和SA处理环境下WT和sex1中游离态SA含量及幼苗根形态的差异.结果表明:在花序继续开放期(6.30、6.50)以及长角果出现期(8.0),WT中游离态SA含量处在更低水平;2 mmol·L-1 SA处理能够极显著提高WT和突变体sex1中游离态SA的积累,且突变体sex1中游离态SA水平增加更明显,是其他处理游离态SA水平的10倍左右;在MV和H2O2处理下,WT和sex1主根生长受抑制的程度没有明显差异,而突变体sex1幼苗的根毛在低浓度MV环境中比WT更长但密度差异不明显,且WT和sex1根毛在低浓度H2O2环境中差异情况与对照组相似,但外源SA处理使WT和突变体sex1的主根生长均受到明显的抑制,两者的根毛密度随SA增加逐渐降低甚至消失,且突变体sex1比WT受到的抑制作用更明显.研究发现:拟南芥的开花和结果过程与SA依赖途径有一定关系;外源添加SA比Pst.DC3000、H2O2和MV处理更能直接促使拟南芥突变体sex1产生更多的游离态SA;突变体sex1根的生长发育比WT更易受到生长环境条件的影响,且sex1根形态的生长存在一定的SA浓度依赖模式.     

禾谷镰孢霉nit突变体的诱导及其生物学特性

将3个抗多菌灵和2个野生敏感型禾谷镰孢霉（Fusarium graminearum)菌株分别在含氯酸盐的MMC培养基上培养,共得到22个不能利用硝酸盐的营养缺陷突变体（Nitrate nonutilizing mutant,简称nit突变体）。比较了各nit突变体与其亲本菌株之间在菌落生长速率,培养性状,产分生孢子能力,产生囊壳能力以及对多菌灵的敏感性等生物学特性方面的变化。结果表明,nit突变体均抗氯酸盐,在PSA平板上的生长速率没有改变,有性生殖能力没有下降,在Joff's培养液和5%绿豆汤培养液中仍能产孢,但产孢量与亲本菌株有差异。此外,禾谷镰孢霉对氯酸盐和多菌灵之间没有交互抗药性,因此,可用nit作为遗传标记,研究禾谷镰孢霉有关性状的遗传学。