提高光滑球拟酵母乙酰辅酶A水平促进a-酮戊二酸合成

【目的】为了了解光滑球拟酵母中乙酰辅酶A含量对其碳代谢及其通量的影响。【方法】将来源于酿酒酵母中编码乙酰辅酶A合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的生产菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株乙酰辅酶A合成酶活性提高9.2倍(1.20 U/mg protein)的重组菌T. glabrata ACS2-1。【结果】与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T. glabrata ACS2-1：(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94 mmol/(L·g DCW)的乙酰辅酶A;(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅酶A浓度、a-酮戊二酸产量和Ca-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303 的3.22、2.05和2.52倍;(3)在葡萄糖培养基中添加4 g/L乙酸,使乙酰辅酶A浓度、a-酮戊二酸产量和Ca-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,a-酮戊二酸浓度达到17.8 g/L。【结论】这一结果表明,改变细胞内关键辅因子的浓度能使碳代谢流的流向与通量发生改变,从积累丙酮酸转向过量积累a-酮戊二酸。     

强化乙酰辅酶A供应对裂殖壶菌合成二十二碳六烯酸的影响

细胞液中乙酰辅酶A的持续供应是脂肪酸高效积累的必要条件。考虑到甲羟戊酸和脂肪酸合成途径共用相同的前体乙酰辅酶A,抑制甲羟戊酸途径可能促使更多的乙酰辅酶A流向脂肪酸合成。通过添加前体物质或/和甲羟戊酸途径酶的抑制剂以强化乙酰辅酶A的供应,即在裂殖壶菌发酵起始或/和后期添加乙酸、发酵起始添加甲羟戊酸途径酶的抑制剂辛伐他汀或柠檬酸、发酵起始同时添加乙酸和辛伐他汀或柠檬酸并考察其对裂殖壶菌合成二十二碳六烯酸 (DHA)的影响,结果发现发酵起始同时添加6mmol/L的乙酸和1μmol/L的辛伐他汀时,DHA产量最高,达到13.21g/L,比对照提高了46.61%。     

乙酰辅酶A羧化酶在治疗肥胖中的潜在作用

肥胖作为一种疾病引起了世界各国越来越多的重视。目前,对乙酰辅酶A羧化酶的研究表明,该酶和肥胖的发生有着重大关系．脂肪的代谢异常是导致肥胖的重要原因之一。乙酰辅酶A羧化酶是脂肪代谢过程中的一种重要的调节酶．它的产物丙二酰辅酶A的含量在一定程度上控制着脂肪酸的代谢。因此对乙酰辅酶A羧化酶的深入研究很可能为肥胖的治疗提供新的医疗手段。该文介绍乙酰辅酶A羧化酶在脂肪代谢中的作用、分类与调控．以及当前国际上对其研究的最新进展。     

乙酰辅酶A与内质网乙酰化

乙酰辅酶A是细胞内物质和能量代谢的重要中间物,同时也是蛋白质乙酰化的乙酰基供体。蛋白质乙酰化包括Nα-乙酰化和Nε-乙酰化,由不同的酶进行催化。蛋白质乙酰化发生在多个亚细胞部位,如细胞基质、细胞核、线粒体和内质网腔等。不同细胞器和区室内乙酰辅酶A的波动可调控内质网蛋白质的乙酰化水平。本文从柠檬酸转运蛋白SLC25A1和SLC13A5、乙酰辅酶A转运蛋白AT-1以及乙酰转移酶ATase1和ATase2的功能出发,以相关人类疾病、内质网乙酰化失调小鼠模型和柠檬酸/乙酰辅酶A通量失调小鼠模型为背景进行分析,阐述了乙酰辅酶A和内质网乙酰化以及内质网乙酰化功能失调与退行性疾病之间的关系,旨在为靶向治疗相关疾病提供一定的策略。     

臭味假单胞菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶的提纯及性质研究

从臭味假单胞菌中提纯97倍的AcAcCoA硫解酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳上是均一的一带。该酶分子量为170,000,每分子含有4个亚基,亚基分子量为42,000。该酶的等电点为pI6.7。它的N-末端为丙氨酸,N-末端是单一的。该酶催化反应的Km值为10.2μmol/L,最大反应速度为16.7μmol/min·mg。 臭味假单胞菌细胞粗提液透析后,经DEAE-纤维素(DE-52)柱色谱,从洗脱液中可同时得到四个酶的活力峰:乙酰乙酸琥珀酰辅酶A转移酶,AcAcCoA硫解酶,β-酮已二酸琥珀酰辅酶A转移酶和β-酮己二酸单酰辅酶A硫解酶。一般认为在细菌的芳径代谢中存在β-酮己二酸代谢途径,上述四个酶的活力峰同时存在说明除β-酮已二酸代谢途径外,还同时存在乙酰乙酸代谢途径。     

乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）北大核心CSCD

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。     

植物乙酰辅酶A羧化酶的分子生物学与基因工程

植物中的乙酰辅酶A羧化酶(acetylCoAcarboxylase,ACCase)分两种类型:原核类型的ACCase位于质体中,是脂肪酸合成途径中的关键酶;真核类型的ACCase位于胞质溶胶中,催化形成的产物主要用于长链脂肪酸的合成以及类黄酮等次生代谢产物的合成。但禾本科植物的质体和胞质溶胶中的ACCase都属于真核类型,其中质体中的是环己烯酮类和芳氧苯氧丙酸类等除草剂作用的靶蛋白。文中主要综述了植物中ACCase的生理功能、分子生物学特征及其对两类除草剂的敏感性,并对其基因工程作了展望。     

酿酒酵母转化木糖生产化学品的研究进展

木糖的有效利用是木质纤维素生产生物燃料或化学品经济性转化的基础.30年来,通过理性代谢改造和适应性进化等工程策略,显著提高了传统乙醇发酵微生物——酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的木糖代谢能力.因此,近年来在酿酒酵母中利用木糖生产化学品的研究逐步展开.研究发现,酿酒酵母分别以木糖和葡萄糖为碳源时...     

过表达乙酰辅酶A乙酰基转移酶2基因(RKAcat2)对红冬孢酵母产类胡萝卜素的影响

[背景] 乙酰辅酶A乙酰基转移酶（Acetyl Coenzyme A Acyltransferase,Acat）是硫解酶家族的一员,分为I型和II型,而II型作为甲羟戊酸（Mevalonate,MVA）途径的第一个限速酶,其表达水平和催化活性会影响萜类及其衍生物的合成量。[目的] 分析Acat II型基因的过表达对红冬孢酵母产类胡萝卜素的影响。[方法] 从红冬孢酵母YM25235菌株中克隆编码Acat II型的基因RKAcat2,将其回转到红冬孢酵母YM25235菌株中,构建一株RKAcat2基因过表达菌株进行分析。[结果] 与对照菌株相比,RKAcat2基因过表达使YM25235菌株中类胡萝卜素含量提高了50.53%,而菌株中油脂含量降低了22.80%,脂肪酸组成中油酸含量显著下降了17.78%,而且菌株中乙酰辅酶A （Coenzyme A,CoA）的含量也下降了13.64%。[结论] 过表达RKAcat2基因促进更多乙酰CoA进入MVA途径中,从而提高了类胡萝卜素的合成水平,这与部分MVA途径和类胡萝卜素合成途径中基因的转录分析结果一致。研究结果可为进一步通过代谢工程手段提高产油红酵母中类胡萝卜素及其特定组分含量的研究提供参考。     

鱼腥藻PCC 7120乙酰辅酶A合成酶All0769的缺失降低异形胞频率

研究鉴定了All0769为鱼腥藻PCC 7120中乙酰辅酶A合成酶,通过CRISPR/Cpf1系统敲除鱼腥藻PCC7120中的乙酰辅酶A合成酶(由all0769编码),探究了乙酰辅酶A合成酶在异形胞分化中的调控机制。结果所示:All0769能在体外反应中催化乙酰辅酶A的生成。在供氮环境下,敲除all0769会影响藻细胞生长速率。而无论环境中是否存在化合氮,Δall0769突变株的乙酰辅酶A和α-酮戊二酸含量均显著减少。在供氮环境下,Δall0769突变株中检测到(26.17±1.55) nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(43.04±1.09) nmol/mg的乙酰辅酶A。Δall0769突变株的α-酮戊二酸[(1.41±0.24) nmol/mg protein]低于野生型的α-酮戊二酸[(2.13±0.05) nmol/mg protein]。在缺氮环境下,Δall0769突变株中检测到(10.00±2.81) nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(29.82±4.04) nmol/mg protein的乙酰辅酶A。Δall07...     

过表达NADH激酶基因对酿酒酵母乙醇发酵的影响

甘油是酿酒酵母乙醇代谢途径中的主要副产物,降低甘油生成,可以提高乙醇的产率和原料的利用率。以工业酒精酵母单倍体S1(MATa)为研究对象,构建了一个4.5 kb左右的基因敲除突变盒gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR,利用醋酸锂转化法转入S1,得到重组菌S3(gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR),使得工业酒精酵母在敲除GPD2的同时整合过表达了NADH激酶基因POS5。结果表明,在150 g/L的葡萄糖摇瓶发酵实验中,重组菌S3在不影响菌株生理特性的条件下,乙醇得率(g ethanol/g glucose)比原始菌株S1提高了8%,甘油得率(g glycerol/g glucose)降低了33.64%。本研究证明过表达NADH激酶基因可降低乙醇发酵中副产物甘油的生成并提高乙醇得率。     

不同启动子控制下木酮糖激酶的差异表达及其对酿酒酵母木糖代谢的影响

[目的]以不同强度的启动子控制表达木酮糖激酶基因,并研究其引起的不同木酮糖激酶活性水平对木糖利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)代谢流向的影响.[方法]以酿酒酵母CEN.PK 113-5D为出发菌株,选择酿酒酵母内源启动子TEF1p,PGK1p和HXK2p,利用Cre-loxP无标记同源重组系统,置换染色体上木酮糖激酶基因XKS1的启动子(XKS1p)序列;并通过附加体质粒引入木糖代谢上游途径,构建不同水平表达木酮糖激酶的木糖利用工程菌株;从木酮糖激酶的转录水平、酶活水平、胞内的ATP浓度及木糖代谢等性状,对各菌株进行评价.[结果]转录及酶活测定结果显示,与天然状态相比,所选择的启动子对木酮糖激酶均表现出更强的启动效率.菌株体内表达木酮糖激酶活性水平由高至低的顺序为其基因XKS1在启动子PGK1p、TEF1p、HXK2p和XKS1p控制下.随着木酮糖激酶的活性的提高,胞内的ATP水平下降,而转化木糖生成乙醇的能力上升.最高乙醇产率为0.35g/g消耗的总糖,此时副产物木糖醇产率最低,为0.18g/g消耗的木糖.[结论]通过在染色体上置换启动子,提高了木酮糖激酶的表达水平.在一定范围内,木酮糖激酶的高活性有利于木糖向乙醇的转化.     

酿酒酵母合成异源单萜类化合物的研究进展

单萜类化合物在食品、医药和工业等领域有重要的应用,具有可观的经济价值.随着合成生物学的日益发展,利用微生物作为细胞工厂合成单萜类化合物成为时下的研究热点.酿酒酵母是真核生物表达的模式菌株,其甲羟戊酸途径为单萜类化合物的合成提供直接前体,因此在酿酒酵母中构建异源单萜类化合物合成途径有较大优势.本文介绍了酿酒酵母细胞中异源单萜类化合物合成途径的构建.从甲羟戊酸途径代谢通量调控机制和融合酶调控酶催化反应效率两方面概述了酿酒酵母异源合成单萜类化合物的研究进展.     

乙醇耐受性酿酒酵母菌株选育的研究进展

酿酒酵母是工业发酵生产乙醇的重要菌种,但是其发酵产物乙醇对酿酒酵母有明显的抑制作用.选育乙醇耐受性酿酒酵母是克服高浓度乙醇的抑制作用,提高乙醇产量的一条重要途径.本文对近年来国内外选育乙醇耐受性酵母的研究作一综述,旨在为乙醇耐受性酵母的选育提供参考.     

Functional analysis of mutations in the PIS gene, which encodes Saccharomyces cerevisiae phosphatidylinositol synthase

Abstract The PIS gene for an enzyme phosphatidylinositol synthase having an increased K _m for myo-inositol, was isolated from Saccharomyces cerevisiae . The mutant PIS gene contained a CAA codon at position 114 instead of the CAC codon observed in the wild-type gene, resulting in alteration of the amino acid from His to Gln. Oligonucleotide mediated site-directed mutagenesis of PIS at codon 114 revealed that mutant genes with codons for Ala, Thr and Leu could support yeast cell growth in vivo, but those for Asp, Lys and Tyr could not. All mutant enzymes when expressed in Escherichia coli showed greatly reduced in vitro activity.     

Ethanol production by Saccharomyces cerevisiae in biofilm reactors

Biofilms are natural forms of cell immobilization in which microorganisms attach to solid supports. At ISU, we have developed plastic composite-supports (PCS) (agricultural material (soybean hulls or oat hulls), complex nutrients, and polypropylene) which stimulate biofilm formation and which supply nutrients to the attached microorganisms. Various PCS blends were initially evaluated in repeated-batch culture-tube fermentation with Saccharomyces cerevisiae (ATCC 24859) in low organic nitrogen medium. The selected PCS (40% soybean hull, 5% soybean flour, 5% yeast extract-salt and 50% polypropylene) was then used in continuous and repeated-batch fermentation in various media containing lowered nitrogen content with selected PCS. During continuous fermentation, S. cerevisiae demonstrated two to 10 times higher ethanol production in PCS bioreactors than polypropylene-alone support (PPS) control. S. cerevisiae produced 30 g L⁻¹ ethanol on PCS with ammonium sulfate medium in repeated batch fermentation, whereas PPS-control produced 5 g L⁻¹ ethanol. Overall, increased productivity in low cost medium can be achieved beyond conventional fermentations using this novel bioreactor design. Received 20 May 1997/ Accepted in revised form 29 August 1997     

酿酒酵母类丙酮酸脱羧酶基因缺失对高级醇生成量的影响

【目的】通过构建酿酒酵母类丙酮酸脱羧酶基因(YDL080C)缺失的工程菌株,研究该基因对酿酒酵母浓醪发酵产高级醇特别是异戊醇的影响。【方法】以酿酒酵母工业菌株AY-15的单倍体a-8或α-22的基因组DNA为模板,PCR分别扩增YDL080C上下游非编码区片段YA和YB;以pUG6质粒为模板,PCR扩增KanMX抗性基因片段。分别将YA、YB和KanMX片段连入pUC19载体,构建重组质粒pUC-YABK;并以其为模板,PCR扩增YA-KanMX-YB重组盒,分别电转化单倍体a-8和α-22。将转化子和亲本分别进行酒精浓醪发酵,发酵结束后测定其发酵性能和高级醇的生成量。【结果】筛选获得了YDL080C基因缺失突变株。酒精发酵后发酵性能和高级醇测定结果显示,转化子的异戊醇及总高级醇生成量与对应的单倍体亲本相比没有明显变化,但酒精度分别比亲本提高了0.6(%,v/v)和0.4(%,v/v)。【结论】YDL080C基因缺失对降低酿酒酵母发酵产高级醇特别是异戊醇没有明显作用,但会使酒精度有所提高。     

Saccharomyces cerevisiae strains with different degrees of ethanol tolerance exhibit different adaptive responses to produced ethanol

Two Saccharomyces cerevisiae strains with different degrees of ethanol tolerance adapted differently to produced ethanol. Adaptation in the less ethanol-tolerant strain was high and resulted in a reduced formation of ethanol-induced respiratory deficient mutants and an increased ergosterol content of the cells. Adaptation in the more ethanol-tolerant strain was less pronounced. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2000) 24, 75–78. Received 22 June 1999/ Accepted in revised form 06 October 1999     

酿酒酵母木糖发酵酒精途径工程的研究进展

途径工程(Pathway engineering),被称为第三代基因工程,改变代谢流向,开辟新的代谢途径是途径工程的主要目的。利用途径工程理念,对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）代谢途径进行理性设计,以拓展这一传统酒精生产菌的底物范围,使其充分利用可再生纤维质水解物中的各种糖分,是酿酒酵母酒精途径工程的研究热点之一。这里介绍了近年来酿酒酵母以木糖为底物的酒精途径工程的研究进展。