几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

棉铃虫Ⅰ型几丁质酶的表达

昆虫几丁质酶主要参与昆虫蜕皮、围食膜降解、细胞增殖、机体免疫防御、生长因子等重要生理生长发育过程。在本研究中,从NCBI下载棉铃虫几丁质酶序列,并克隆验证正确,构建的系统发育树表明属于Ⅰ型几丁质酶。将不包含信号肽的开放阅读框序列(1 707 bp)与pET28a载体连接,转化至大肠杆菌transetta(DE3)中进行诱导表达,Western blot进一步验证融合蛋白His-HaCHT。用镍柱子纯化融合蛋白,纯化获得的融合蛋白对胶体几丁质有降解活性,其酶活力为0.023μg/mL·s~(-1)。不同龄期的qPCR结果显示,该基因在棉铃幼虫的6个幼虫期以及预蛹蜕皮后均有表达,但HaCHTI在4龄和6龄幼虫阶段表达相对较高,而在1龄、2龄、3龄、5龄幼虫和预蛹表达量较低。这些结果表明,异源表达的棉铃虫的I型几丁质酶对胶体几丁质具有降解活性,可能对棉铃虫正常蜕皮有着重要的作用。     

棉铃虫Ⅰ型和Ⅶ型几丁质酶基因表达规律的比较分析

几丁质酶（chitinase, CHT）在昆虫生长发育过程中主要有降解围食膜、外骨骼、角质层以及肠道内层的几丁质成分,从而参与昆虫的蜕皮和细胞增殖的功能。在本研究中,分析比较棉铃虫I型和Ⅶ型几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域及其时空表达特性,对的进一步功能研究提供重要的素材。首先利用生物信息学在线工具SMART对本课题组前期所获得的几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域进行分析;之后采用qRT-PCR方法研究棉铃虫6龄幼虫不同组织和幼虫不同龄期蜕皮前后的中肠中HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的时空表达特性。结果表明：对几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ结构域进行分析,发现HaCHTⅠ和HaCHTⅦ均具有信号肽序列、催化区域、连接区域,且HaCHTⅠ有一个几丁质结合结构域,而HaCHTⅦ则无;棉铃虫Helicoverpa armigera几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ在6龄幼虫不同组织部位的均有表达,其中HaCHTⅠ在各个部位的表达量没有显著的差异,而HaCHTⅦ在头壳和体壁中表达显著高于其它组织;几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ在棉铃虫幼虫蜕皮前后中肠的表达量变化较大,其中HaCHTⅠ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递减的趋势,在4、5、6龄初期时表达量则是先减后增的趋势,而HaCHTⅦ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递增的趋势,恰与同一时期HaCHTⅠ的表达量相反,在4、5、6龄初期时HaCHTⅦ的表达量呈递减的趋势。棉铃虫HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的结构域和时空表达都存在差异,据此我们测这些差异可能对其功能具有一定的影响。本结果为深入研究几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的功能奠定了基础。     

昆虫来源的几丁质酶的分离纯化及酶学性质

几丁质酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起着关键作用,该酶本身及其酶抑制剂是获取生物农药的重要途径。本研究从蚕蛹体内提取几丁质粗酶,经硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-150分离得到几丁质酶。用SDS-PAGE测得该酶的分子量为88kDa。水解胶体几丁质的Km值为22.3μmol/L。酶反应的最适温度为45℃,最适pH值为6.0,金属离子和有机试剂对几丁质酶活性都有影响,其中高浓度的Mn2+对酶有较强的激活作用,而Cu2+、SDS则有较强的抑制作用。研究结果为基于几丁质酶的生物农药筛选研究奠定了基础。     

莱氏野村菌产几丁质酶条件及酶学性质研究

对莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)菌株CQ031021产几丁质酶条件及酶学性质进行了研究。结果表明:该菌株最适产酶碳源为2.0%(W/V)葡萄糖,氮源为1.2%(W/V)复合氮源(蛋白胨、牛肉膏按1∶1的比例),接种量为孢悬液2mL(1×107个/mL),培养温度28℃,培养液初始pH6.0,培养时间6d;一定浓度的吐温-80对几丁质酶活性有促进作用,而SDS有抑制作用;粗酶液最适反应温度50℃,最适pH6.0,在40℃以下及pH5.5～6.5范围内酶活力较稳定。     

低温几丁质酶基因在乳酸克鲁维酵母中的重组表达及酶学性质表征

【目的】通过构建假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)低温几丁质酶(chitinaseA,chi A;chitinase C,chi C)的重组乳酸克鲁维酵母菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质表征,为低温几丁质酶潜在工业化生产几丁寡糖奠定理论基础。【方法】人工合成密码子优化的几丁质酶基因,构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒(p KLAC1-chi A、p KLAC1-chi C)并用电脉冲法转化到乳酸克鲁维酵母中,实现低温几丁质酶的可溶表达。利用镍柱亲和层析纯化得到高纯度的重组几丁质酶。【结果】成功构建产低温几丁质酶的重组乳酸克鲁维酵母并纯化获得高纯度的重组几丁质酶。经SDS-PAGE分析在110 k Da与90 k Da附近出现符合预期大小的蛋白条带。铁氰化钾法测得Chi A和Chi C的酶活分别为51.45 U/mg与108.56 U/mg。最适反应温度分别为20°C和30°C,最适p H分别为8.0和9.0。在低于40°C,p H 8.0–12.0时,Chi A和Chi C重组酶较稳定。Chi A和Chi C对胶体几丁质以及粉状底物α-几丁质与β-几丁质具有明显的降解活性,且具有一定协同降解能力。【结论】首次实现假交替单胞菌来源的低温几丁质酶在乳酸克鲁维酵母中的重组表达、纯化、酶学性质及其降解产物分析,为其他低温几丁质酶的研究提供借鉴意义。     

棘孢木霉几丁质酶tachi2 基因的原核表达及酶学性质研究

目的:实现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,研究几丁质酶Tachi2的酶学性质.方法:利用PCR技术扩增得到几丁质酶基因tachi2,将其克隆到原核表达载体pEHISTEV中,测序后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行Tachi2蛋白的纯化和复性.用纯化的目的蛋白Tachi2进行几丁质酶酶学性质的研究.结果:tachi2基因在重组大肠杆菌中正确表达,其主要以包涵体形式存在;重组蛋白Tachi2分子量约为44kDa,经过纯化和复性后得到的Tachi2有较高的几丁质酶活性.该酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,几丁质酶在40℃以下比较稳定、pH 6～9时酶有较高活性,受Cu2和Zn2+的强烈抑制.结论:成功实现了棘孢木霉几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,表达纯化了重组蛋白,明确了几丁质酶Tachi2的酶学性质,为该几丁质酶的进一步开发利用和深入研究奠定了基础.     

产气肠杆菌几丁质酶的分离纯化及性质研究

从自然罹病死亡的草原毛虫(Gynephorap ruoergnesis)体内分离到一株产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes),它在几丁质的诱导下能产生较高活性的几丁质酶。发酵液经硫酸铵盐析、DEAE纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析分离出几丁质酶。用SDSPAGE测得该酶的分子量为425kD。水解几丁质的Km值为2.88mg/mL-1。酶反应的最适温度为55℃,最适pH值为60,金属离子对几丁质酶活性影响较大,其中Zn2+、Ba2+、Ca2+和Mn2+对酶有较强的激活作用,而Hg2+、Co2+和Mg2+则有较强的抑制作用。     

杀鱼假交替单胞菌C923几丁质酶基因PpchiC的克隆表达与酶学性质

【背景】某些假交替单胞菌可分泌几丁质酶,在降解利用几丁质为水产动物提供营养、免疫、抗病等方面有着重要潜力。【目的】克隆杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)C923的一个几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组几丁质酶的酶学性质进行研究。【方法】从菌株C923测序的基因组中注释到一个几丁质酶家族基因PpchiC,设计引物克隆该基因后进行生物信息学分析;构建载体进行异源表达并从温度、时间与诱导剂浓度进行表达优化;对表达蛋白进行最适温度与pH等酶学性质研究,同时比较了重组菌破碎后上清与沉淀及纯化的酶蛋白对几丁质的降解效应。【结果】基因PpchiC长1350bp,编码450个氨基酸,PpchiC蛋白理论分子量为48.76kDa,等电点为4.78,不稳定系数为29.08。结构域分析发现该蛋白含有一个类型Ⅲ几丁质结合域和一个糖苷水解酶18家族(glycosyl hydrolase 18,GH18)的催化域;PpchiC蛋白含有GH18家族几丁质酶的保守催化基序DxxDxDxE、YxR和[E/D]xx[V/I]。16℃、0.25mmol/L IPTG、诱导12h为其最优化表达条件,PpchiC在50℃、pH8.0时表现出最大酶活性;以胶体几丁质为底物时,PpchiC的K_m值为2.58mg/mL、V_max值为5.04mg/(mL·min)。降解结果表明,菌体的沉淀与上清及从上清中纯化的酶蛋白均有着较好的几丁质降解效应。【结论】杀鱼假交替单胞菌C923基因PpchiC编码GH18家族的几丁质酶,能被大肠杆菌高效表达且降解几丁质效应明显,这为PpchiC及菌株C923的应用提供了参考依据。     

产几丁质酶的无色杆菌ZWW8的发酵产酶及酶学性质研究

从湖北武汉地区虾壳堆积土壤中筛选得到一株分泌胞外几丁质酶菌株ZWW8,通过16S rDNA序列比对发现其属于无色杆菌属;通过碳源、氮源、温度、培养基pH、培养时间的单因素优化实验获得ZWW8菌株的最优发酵条件,该菌株在添加0.5％几丁质胶体,0.5％NH4Cl,初始pH 7.0的培养基中,于37℃培养2 d后胞外上清酶...     

烟曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

探索获得优良的β-葡萄糖苷酶基因,对实现其工业化生产具有重要意义。烟曲霉Aspergillus fumigatus基因组中含有一个bgl基因(1 752 bp),编码的蛋白约65 kDa,推测为属于糖苷水解酶家族的β-葡萄糖苷酶。将bgl基因克隆并构建了重组表达载体pGEX-bgl,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导获得表达。重组蛋白经亲和层析纯化后,以七叶苷为底物进行了酶学分析,结果表明该酶的最适温度是45℃,最适pH在5.5~6.0之间,对七叶苷的Km值为17.7 mmol/L。该酶在pH 4~7范围内稳定;70℃保温2 h后仍能保持60%的活性。金属离子和化学试剂对酶活性有不同程度的影响,Ca2+对重组酶有轻微的激活作用,而SDS可强烈抑制其活性。由于其相对于真菌来源的其他葡萄糖苷酶稳定性较高,为进一步的研究与应用奠定了基础。     

重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶Tachi1的酶学性质研究及表达条件优化

【目的】对转棘孢木霉几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母工程菌GS-tachi1-K进行诱导表达,研究重组几丁质酶Tachi1的酶学性质,优化表达条件。【方法】对GS-tachi1-K进行甲醇诱导培养,纯化目的蛋白Tachi1进行几丁质酶酶学性质的研究;通过单因素和正交试验对GS-tachi1-K菌株产几丁质酶Tachi1表达条件进行优化。【结果】GS-tachi1-K表达的几丁质酶Tachi1表观分子量约为44 kDa,酶反应最适的温度和pH分别为50℃和5.5,具有较宽的温度、pH适用范围;50℃以下保持较高的酶活力,在碱性条件下稳定性较差;受Ag+、Hg2+、Cu2+、Fe2+和高浓度的SDS及β-巯基乙醇强烈抑制。该菌株的最佳表达条件为:pH为6.5,甲醇诱导浓度为0.5%,起始细胞浓度为OD600=2,甲醇诱导时间为180 h;几丁质酶Tachi1活力可达17.93 U/mL,蛋白表达量为6.19 g/L。【结论】成功实现了棘孢木霉新几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母高效分泌表达,工程菌GS-tachi1-K具有高表达量和表达产物酶活性高两个特点,明确了几丁质酶Tachi1的酶学性质和最佳诱导表达条件,为该几丁质酶及其基因的深入研究和开发利用奠定了基础。     

豇豆几丁质酶部分酶学特性的研究

该文测定了纯化的豇豆几丁质酶部分酶学特性。结果表明,该酶在pH5-8,温度低于60℃的范围内稳定性较好,酶活力最适pH为65,最适温度为50℃。10mmol/L浓度的Hg2 、Mn2 、Mg2 、Co2 等金属离子对酶活力有一定抑制作用,其中Hg2 离子抑制率最高(6883%)。Km(胶状几丁质)值为1662mg/ml;以SDS-PAGE电泳和SephadexG-100柱层析两种方法分别测得分子量为34kD、325kD;IEF电泳测得等电点为83。     

极耐热性阿拉伯糖苷酶基因的表达、纯化及酶学性质研究

采用PCR从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)克隆出编码极耐热稳定性阿拉伯糖苷酶基因,以pET20b为表达质粒,与其C末端6个组氨酸标签序列融合,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明,阿拉伯糖苷酶活性最适作用温度和最适作用pH分别为90～95℃和pH 5.0～5.5,在pH 4.2～8.2之间酶活力稳定,95℃的半衰期为4h;SDSPAGE测得酶的分子量为56.57 kD,与理论推算值相吻合。在所测定的底物中,阿拉伯糖苷酶仅对对硝基苯阿拉伯呋喃糖苷（pNPAF）有专一性水解作用,其动力学参数Km值为018mmol/L, Vmax为139μmol/min·mg。     

植物几丁质酶的结构,基因及其表达

几丁质酶按其蛋白氨基酸序列结构的特征及同源性可分为六类,即：ＣｌａｓｓⅠ－Ⅵ。ＣｌａｓｓＩ在蛋白氨基酸结构上包括三个功能区域,Ｎ－端是富含半胱氨酸的几丁质结合工,约４０个氨基酸;Ｃ－端是酶的催化区,也是酶的主要功能区域,约３００个氨基酸;二者通过一个多变的交联区连接在一起。ＣｌａｓｓⅡ仅具有类似于ＣｌａｓｓⅠ的酶催化区域,而没有几丁质结构区和交联区。ＣｌａｓｓⅢ几丁质酶在氨基酸序列上与ＣｌａｓｓⅠ     

WHS3菌株产几丁质酶对棉铃虫HaSNPV的增效作用

WHS3（Serratia marcescens）菌是一株几丁质酶的高产菌株,在诱导培养基中几丁质酶的产量可达84.4μg/mL。通过对中国棉铃虫进行的生物测定有明：WHS3菌所产的几丁质酶（A3）能有效地提高HaSNPV的毒力20%-70%,LT50、LT90比对照组缩短天数量高可达1.1、1.3d。     

蜂房哈夫尼菌植酸酶基因appA的克隆、表达及酶学性质研究

从蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)中克隆获得一个植酸酶编码基因appA,该基因全长1335bp,编码444个氨基酸,其中前33个氨基酸为信号肽,成熟蛋白的理论分子量为45.2kD。将基因appA克隆到大肠杆菌E.coli表达载体pET-22b( ),并在大肠杆菌中表达,表达产物具有植酸酶活性。对表达的酶蛋白进行纯化,并初步研究了该酶的酶学性质,结果表明:酶的作用最适pH值为4.5;在pH2.0~10.0范围内,酶活性保留80%以上;酶的作用最适温度为60℃;酶的比活性为356.7U/mg,酶动力学分析表明其Km为0.49mmol/L,Vmax为238U/mg;该酶对胰蛋白酶和胃蛋白酶有一定的抗性。该研究为哈夫尼菌属来源植酸酶的首次报道。     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒几丁质酶基因的克隆与表达

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)几丁质酶基因的序列,设计引物,引入适当的酶切位点,利用PCR扩增出不含N末端信号肽以及C末端内质网定位肽的几丁质酶基因片段.将该基因片断克隆至原核表达载体pProEXHTb,经IPTG诱导,在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达,表达产物的大小为60kD,含量占菌体总蛋白量的40%.利用来源于AcMNPV 几丁质酶的抗体对表达蛋白进行检测,获得特异性的显色信号,证实所获原核表达产物与杆状病毒的几丁质酶具有同源性.     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒几丁质酶基因的克隆与表达

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (HaSNPV)几丁质酶基因的序列 ,设计引物 ,引入适当的酶切位点 ,利用PCR扩增出不含N末端信号肽以及C末端内质网定位肽的几丁质酶基因片段。将该基因片断克隆至原核表达载体 pProEXHTb ,经IPTG诱导 ,在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达 ,表达产物的大小为 6 0kD ,含量占菌体总蛋白量的 4 0 %。利用来源于AcMNPV几丁质酶的抗体对表达蛋白进行检测 ,获得特异性的显色信号 ,证实所获原核表达产物与杆状病毒的几丁质酶具有同源性     

猴头菌UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因克隆表达及酶学性质

通过实验室前期对诱变菌株猴头菌321的多组学分析结果,获得了一个多糖合成过程中起关键作用的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因（UDP-glucose-4-epimerase,UGE）,并在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）中进行了异源表达。通过筛选最优的目的蛋白诱导表达条件后,通过镍柱亲和层析纯化后获得高纯度目的蛋白,并对目的蛋白进行了酶学性质的研究,明确了其生物学性质和动力学参数,为其开发利用提供理论参考。