三种方法对草地贪夜蛾基因组转座子的注释

[目的]转座子(Transposable element,TE)是昆虫基因组的重要组成,不同昆虫类群的TE组成、基因组占比及转座活性等基本特征存在巨大差异.本研究旨在探究不同方法对于草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda TE的注释效果,并在基因组水平阐明草地贪夜蛾TE的基本特征.[方法]采用3种方法对草地贪夜蛾基因组TE进行预测,包括基于数据库Repbase、ArTEdb进行同源预测,基于重复序列的特性和结构进行从头预测.[结果]ArTEdb方法和从头预测方法鉴定的TE分别占基因组21.48％和27.26％,其中LINE元件无论是拷贝数还是分布密度都最高;其次是DNA元件.2种方法预测的TE分歧率分布峰值约10％,而分歧率＜10％的TE主要是DNA转座子和LINE.比较3种方法的预测结果,Repbase方法灵敏度低,预测的TE远少于其他2种方法.ArTEdb方法能注释出更多的TE,但该方法对于已知超家族鉴定效果不佳.而从头预测注释出的TE数量多,且能划分到不同超家族,甚至能鉴定不包含在Repbase鳞翅目库的TE超家族.[结论]草地贪夜蛾基因组最主要的TE类型是LINE和DNA元件,基因组存在 大量年轻的转座子,草地贪夜蛾在TE家族的组成上与其它鳞翅目物种存在差异.从头预测的方法对草地贪夜蛾基因组TE注释效果较其它2种方法更好.这一研究结果为深入研究转座子的功能及其对草地贪夜蛾基因组多样性奠定了基础.     

草地贪夜蛾解毒代谢相关基因家族的进化分析

近年来草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda在世界各地猖獗为害,其寄主范围广,且已对多种化学药剂和转Bt玉米产生抗性。本文对包括草地贪夜蛾在内的14种昆虫进行了解毒代谢相关基因家族的注释,在草地贪夜蛾中发现了152个细胞色素P450(cytochrome p450,P450)、92个ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC transporter)、44个谷胱甘肽转移酶(glutathione s-transferase,GST)以及39个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyl-transferase,UGT)。与其他鳞翅目物种相比,草地贪夜蛾的P450和GST基因数量最多,其中152个P450基因可被归类至Mito、CYP2、CYP3和CYP4四个簇中;Mito和CYP2簇的P450基因总数与家蚕Bombyx mori相近,但CYP3和CYP4簇的P450基因明显多于家蚕,进化分析结果显示CYP3和CYP4簇的P450基因发生了明显的扩增;与家蚕P450基因的共线性分析发现草地贪夜蛾89个P450基因在其基因组上呈簇分布并发生了簇的扩增;与家蚕相比,GST和ABC转运蛋白家族基因的数量明显增多。UGT基因家族没有明显增加,但在基因进化分析中有成簇现象,表明可能存在近期的扩增事件。本研究首次从基因组水平鉴定了草地贪夜蛾解毒代谢相关基因家族,对理解草地贪夜蛾的生物学特性及抗性的形成具有重要指导意义。     

草地贪夜蛾4个性信息素结合蛋白基因的克隆及表达模式分析

草地贪夜蛾是世界性的重大害虫,2019年1月入侵我国并迅速扩散到20多个省市。性诱剂是对草地贪夜蛾进行监测和诱杀的有效手段,但是其作用识别机制仍不清楚,限制了高效性诱剂的研发和应用。性信息素结合蛋白(PBPs)在鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾性信息素识别过程中起重要作用。本研究从草地贪夜蛾中克隆了4个编码PBPs的cDNA序列,命名为SfruPBP1-SfruPBP4。4个SfruPBPs均含有完整的开放阅读框,所编码的蛋白具有性信息素结合蛋白的典型特征:N-端有信号肽、具有保守的6个半胱氨酸残基。系统进化分析显示SfruPBPs与斜纹夜蛾和海灰翅夜蛾PBPs的亲缘关系最近,且4个SfruPBPs被聚在不同的进化分支。4个SfruPBPs基因均由3个外显子和2个内含子组成,内含子插入位点高度保守。此外,4个SfruPBPs在草地贪夜蛾基因组上呈串联排列。SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3在成虫触角中特异性表达,其中SfruPBP1和SfruPBP2在雄成虫触角中的表达水平显著高于雌虫,而SfruPBP3在雌雄触角中的表达水平无显著差异。SfruPBP4特异性表达于雄成虫腹部。本研究结果为揭示草地贪夜蛾性信息素识别机制奠定了基础。     

草地贪夜蛾V-ATPase亚基A、B、C和D基因的克隆与分析

【目的】克隆获得草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda V-ATP酶（Vacuolar-type proton,ATPase）V1结构域A、B、C和D亚基的cDNA序列,分析其在草地贪夜蛾不同生长阶段的表达情况,为筛选新型农药的靶点奠定基础。【方法】利用PCR技术获得草地贪夜蛾V-ATP酶V1结构域A、B、C和D亚基基因的ORF区域,采用qRT-PCR技术检测各基因在草地贪夜蛾不同发育时期的表达水平。【结果】A、B、C和D亚基基因均在不同鳞翅目昆虫中高度保守。A-D亚基在草地贪夜蛾各生长阶段均有表达,在幼虫阶段和成虫阶段的表达量均较高,表明V-ATP酶可能影响幼虫生长发育和成虫交配繁殖。卵期和蛹期表达量低,这与卵期和蛹期昆虫各项生命活动低有关。各亚基在各发育时期的表达量存在差异,说明V-ATP酶A、B、C和D发挥不同的功能。【结论】从草地贪夜蛾中克隆了V-ATP酶V1结构域A、B、C和D亚基4个基因在草地贪夜蛾不同发育阶段表达量具有差异,推测其对草地贪夜蛾的生长、发育和繁殖具有重要的调控作用。     

草地贪夜蛾热激蛋白基因SfHsp90的克隆及在高低温和UV-A胁迫下的表达分析

【目的】本研究旨在探索草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda响应高低温和UV-A胁迫的分子机制。【方法】通过RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾热激蛋白基因Hsp90,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-qPCR技术检测草地贪夜蛾Hsp90基因在不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(去除触角和复眼的头、胸、腹、触角、复眼、足、翅、中肠、精巢和卵巢)及在不同时长(0, 30, 60, 90, 120和150 min)高温(36℃)、低温(4℃)和UV-A胁迫下成虫中的相对表达量。【结果】克隆获得草地贪夜蛾Hsp90基因,命名为SfHsp90(GenBank登录号:MN832694),该基因开放阅读框(ORF)长2 154 bp,编码717个氨基酸,编码蛋白质相对分子量为82.52 kD,等电点(pI)为5.01,C末端序列含保守基序EEVD,说明该蛋白为胞质型热激蛋白。系统进化分析结果表明,昆虫Hsp90高度保守。发育表达模式显示SfHsp90在草地贪夜蛾1龄幼虫中表达量最高;组织表达模式显示,SfHsp90在草地贪夜蛾雌雄成虫的触角、复眼和去除触角和...     

草地贪夜蛾组织蛋白酶L的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L(cathepsin L,CatL)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%~96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。     

草地贪夜蛾与斜纹夜蛾嗅觉味觉相关基因的比较分析

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda,近期侵入中国并迅速扩张。与其近缘物种斜纹夜蛾Spodoptera litura不同,草地贪夜蛾主要偏好玉米、水稻、小麦等禾本科农作物,暴食危害重。此外两种害虫在交配、产卵频率等繁殖特征上也存在差异。这些差异可能与嗅觉、味觉相关蛋白的分歧密切相关。本研究对两种夜蛾科害虫的嗅觉、味觉相关基因进行了系统的鉴定及系统发育分析,并对部分嗅觉结合蛋白进行了选择信号与氨基酸差异位点分析。分别在草地贪夜蛾中鉴定到261个嗅觉相关基因,数目明显大于斜纹夜蛾(179个);鉴定到233个味觉相关基因,数目略大于斜纹夜蛾(217个)。嗅觉相关基因中气味结合蛋白(OBP)基因数目差异最为明显。系统发育分析显示该基因存在夜蛾科特异的分支,且该分支中草地贪夜蛾中基因数目远高于斜纹夜蛾;发现位于I类触角结合蛋白(ABPI)分支的一类OBP成员在草地贪夜蛾中拷贝数增加,其中两个基因拷贝受到正选择,且在草地贪夜蛾中特有的氨基酸替换还可能影响蛋白质功能。本研究为草地贪夜蛾食性特征的遗传机制解析提供线索,为草地贪夜蛾的生物防治提供参考依据和基因素材。     

草地贪夜蛾半胱氨酸蛋白酶Sf-caspase-3基因克隆与表达分析

半胱氨酸蛋白酶caspases是细胞凋亡过程中重要的酶类,参与调控昆虫变态发育及响应外界压力等多种生理过程。本研究通过转录组数据及逆转录PCR鉴定并验证得到Sf-caspase-3基因编码区全长。该基因编码区长840 bp,编码279个氨基酸,预测蛋白分子量为31.43 kDa。氨基酸序列分析表明Sf-caspase-3具有保守的QACRG五肽序列,且与Lep-caspase-3高度保守。进化树分析表明Sf-caspase-3与甜菜夜蛾Spodoptera exigua Se-caspase-3亲缘关系最近。RT-qPCR检测结果表明Sf-caspase-3在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda各个龄期均有表达,其中3~6龄幼虫期表达量最高,蛹期和卵期表达量最低。此外Sf-caspase-3在6龄幼虫中肠组织中表达量最高,而在表皮、脂肪体及马氏管中表达量极低。本研究成功构建Sf-caspase-3原核表达重组质粒,在28℃下0.4 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组菌株4 h得到约50 kDa大小条带,与预期条带大小相符。蛋白可溶性分析表明Sf-caspase-3主要以不可溶的形式存在包涵体中。本研究为草地贪夜蛾Sf-caspase-3功能及鳞翅目昆虫细胞凋亡机制研究提供一定的理论依据。     

Bax通道在斑蝥素诱导草地贪夜蛾Sf9细胞凋亡中的作用

【目的】为明确Bax通道在斑蝥素诱导鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中的作用。【方法】本文利用Bax通道抑制法测定了斑蝥素诱导鳞翅目昆虫草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)细胞系Sf9细胞凋亡过程中线粒体膜电位、线粒体琥珀酸脱氢酶活性及细胞形态等方面的影响。【结果】Bax通道被抑制后,斑蝥素诱导造成的Sf9细胞线粒体膜电位的降低时间延迟,细胞形变率下降,但琥珀酸脱氢酶活性的下降未受影响。【结论】Bax通道参与了斑蝥素引起的Sf9细胞线粒体膜电位改变和细胞形态变化,而与抑制线粒体有关能量代谢的酶无直接关系。     

草地贪夜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6和α7亚基基因克隆及其对乙基多杀菌素胁迫的响应

【目的】烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAchRs)作为昆虫中枢神经系统中重要的神经递质受体,是乙基多杀菌素的重要靶标。本研究旨在克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda nAchR基因,并探析其对乙基多杀菌素胁迫的响应。【方法】基于前期草地贪夜蛾转录组数据,采用RT-PCR和RACE分别克隆草地贪夜蛾nAchRα6和α7亚基基因;乙基多杀菌素(0.400 mg/L)处理草地贪夜蛾3龄幼虫48 h后,采用RT-qPCR技术检测nAchRα6和α7亚基基因的表达量的变化。【结果】nAchRα6亚基基因(GenBank登录号：MT951400)开放阅读框长1 506 bp,编码502个氨基酸,并具有跨膜区与信号肽;nAchRsα7亚基基因(GenBank登录号：MW557608)开放阅读框长1 524 bp,编码508个氨基酸,并具有跨膜区与信号肽。根据氨基酸多序列比对分析,草地贪夜蛾nAchR亚基α6和α7具有烟碱性乙酰胆碱受体α家族典型特征。0.400 mg/L乙基多杀菌素胁迫48 h后,草地贪夜蛾3龄幼虫nA...