家蚕非编码RNA在神经系统中的表达分析

【目的】非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在家蚕Bombyx mori发育过程中具有重要调控作用。本研究旨在探索ncRNA参与家蚕神经系统发育的分子机理。【方法】采用实时荧光定量PCR技术对22个中等长度的ncRNA及3个ncRNA的邻近编码基因在家蚕幼虫神经系统中的表达水平进行检测。【结果】8个ncRNA(包括1个C/D box snoRNA,4个H/ACA box snoRNA和3个不能归类的ncRNA)在家蚕5龄幼虫神经组织和非神经组织中均有表达,且在胸腹神经中的表达量明显高于头部神经中的表达量。其中,snoRNA Bm-51,Bm-18和Bm-86在胸腹神经中的表达量分别是头部神经中的23,5和4.7倍。进一步研究发现,这3个内含子起源的ncRNA与其宿主基因在家蚕神经系统中的表达趋势一致,宿主基因在胸腹神经中的表达量也明显高于头部神经中的表达量。【结论】本研究筛选到的在家蚕不同神经部位存在差异表达的ncRNA,特别是在胸腹神经中高表达的ncRNA可能协同其邻近编码基因,参与家蚕神经发育或神经活动过程。该结果为研究ncRNA参与家蚕神经系统发育提供了分子依据,为从非编码RNA角度探索鳞翅目害虫防治提供了新的思路。     

家蚕snoRNA Bm-15的细胞定位及与类Notch受体基因的互作关系

【目的】前期研究中发现的一个家蚕Bombyx mori C/D box snoRNA Bm-15能够与类Notch受体基因(Notch-like receptor gene,NLR)发生体外互作。本研究旨在了解家蚕中snoRNA Bm-15与NLR的互作机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测snoRNA Bm-15和NLR在家蚕幼虫、蛹及成虫不同发育阶段的表达谱;利用原位杂交鉴定snoRNA Bm-15与NLR在BmN4细胞中的定位,以探索两者之间的互作机制。【结果】表达谱分析发现,snoRNA Bm-15及NLR在家蚕幼虫期的表达趋势基本一致,均呈现先下降后上升的趋势,2龄幼虫中表达量最低。在家蚕化蛹过程中,snoRNA Bm-15表达量呈现逐渐下降的趋势,到处女蛾时表达量最低。而NLR在雌虫化蛹后第1天表达量最低,处女蛾中表达量最高。利用原位杂交进行细胞定位发现,snoRNA Bm-15不仅存在于BmN4细胞核中,在细胞质中也有分布;而NLR则大部分分布于细胞核中,与Bm-15在核内有位置重叠。【结论】首次在鳞翅目昆虫中发现一个snoRNA Bm-15同时存在于细胞核和细胞质中,与其互作的基因NLR则主要存在于细胞核中,与Bm-15有位置重叠。二者在家蚕幼虫阶段存在一致的表达模式,在化蛹及化蛾过程中存在相反的表达模式,提示snoRNA Bm-15与NLR在家蚕不同发育阶段可能存在不同的互作模式。     

家蚕转基因载体pBacA3EG的构建及其表达

以家蚕Bombyx mori肌动蛋白A3(actin 3)启动子、增强性绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因及SV40的多聚腺苷酸识别序列为元件,经多次克隆,将其插入到piggyBac转座载体中。经PCR、酶切鉴定及测序表明各元件已按正确的方式插入到piggyBac载体中。将构建好的piggyBac表达载体显微注射到胚盘形成前期的蚕卵中,在胚胎早期发育的第3天,通过体视荧光显微镜检测到蚕卵内发出较强的绿色荧光。结果表明该载体构建正确且能在蚕卵中进行表达。家蚕转基因载体的体外瞬时表达不但是成功进行家蚕转基因所必需的第一步,而且其自身也可以应用于基因的功能研究,为家蚕后基因组研究奠定了基础。     

吡哆醛激酶基因在家蚕体内的时空表达特征

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B₆关键代谢酶吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）在家蚕不同组织间的表达差异。【方法】原核表达家蚕重组PLK, 获得目的蛋白制备多克隆抗体, 利用Western blot方法对PLK在家蚕不同发育时期、 5龄第3天幼虫不同组织及5龄不同日龄幼虫表皮、 头部和马氏管中的表达进行分析; 并采用实时荧光定量PCR的方法对PLK基因在家蚕不同组织中的mRNA转录水平进行比较。【结果】PLK在家蚕5龄幼虫的表达水平最高, 在5龄第3天幼虫各组织中的表达由高到低依次为： 精巢、 马氏管、 表皮、 中肠、 头部、 卵巢、 脂肪体、 丝腺; 5龄期不同日龄幼虫表皮组织的表达差异最大, 头部和马氏管中均为前期表达量稍高于后期。在转录水平方面, 精巢的表达量最高, 其次是马氏管和头部。【结论】PLK在家蚕不同发育时期及组织中的差异表达进一步证实PLK在家蚕VB6代谢中的生物学功能的重要性。     

转植酸酶基因家蚕的制作及表达检测

家蚕Bombyx mori丝腺具有高效合成蛋白质的特性,开发在丝腺特异表达外源蛋白质的生物反应器具有重要的意义。本研究利用piggyBac来源的两种载体pPIGA3GFP和pBac{3×P3-EGFPaf},建立了稳定的家蚕转基因技术体系; 然后,利用一株黑曲霉来源的植酸酶基因,构建了在家蚕后部丝腺特异表达的融合表达载体pBac [3×P3-EGFP+ FibLphyADsRed],注射蚕卵后,在53个G1蛾区中检测到3个有荧光蚕的蛾区。经Southern blot和反向PCR验证,转基因表达盒整合到家蚕染色体上。RT-PCR结果显示,植酸酶基因特异性地在后部丝腺表达,其表达模式与家蚕轻链丝素基因一致。结果表明我们成功获得了在后部丝腺特异表达植酸酶融合蛋白的转基因蚕,这为进一步开发家蚕生物反应器,利用转基因蚕生产各种重组蛋白具有积极的促进作用。     

家蚕miR-2769靶基因的鉴定及表达分析

【目的】MiRNAs在昆虫变态发育过程中发挥非常重要的作用。对家蚕Bombyx mori miRNAs及靶基因的研究将有助于阐明miRNAs参与调控家蚕变态发育的分子机制。【方法】往家蚕5龄第2天幼虫血淋巴注射蜕皮激素20E后,qRT-PCR检测miR-2769在家蚕脂肪体中的表达;通过生物信息学方法预测家蚕miR-2769的靶基因;利用双荧光酶报告载体系统分析miR-2769与预测靶基因BmE75B的互作;qRT-PCR检测miR-2769及其靶基因BmE75不同剪接体在家蚕不同发育时期(幼虫、蛹和成虫)和幼虫不同组织(头、表皮、丝腺、脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、中肠和血淋巴)中的表达量。【结果】研究结果表明,miR-2769可通过与家蚕BmE75B的3′UTR区结合位点的互作,显著抑制荧光素酶报告基因的表达。qRT-PCR结果表明,miR-2769和BmE75A/BmE75B在20E诱导家蚕脂肪体中表达趋势相反。时空表达分析结果表明,miR-2769与BmE75的不同剪接体在家蚕不同发育时期和不同组织中均具有特异性表达特征。在家蚕变态发育的不同阶段,miR-2769和BmE75A的表达量均较低,而BmE75B在蛹期表达量较高,BmE75C在5龄末幼虫和蛹早期有极高表达水平。此外,miR-2769与BmE75不同剪接体均存在一定程度的表达负相关。在家蚕5龄幼虫血淋巴中miR-2769可促进BmE75A的表达,在脂肪体中miR-2769可促进BmE75B的表达,而在其他组织中miR-2769抑制BmE75不同剪接体的表达。【结论】家蚕miR-2769可通过与BmE75B的3′UTR区的互作对BmE75不同剪接体的表达进行负调控。     

LncRNA63及其共表达基因Hr3在家蚕中的表达和功能分析

【目的】本研究旨在通过对一个新的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)及其共表达基因在家蚕Bombyx mori中的表达和功能进行分析,进一步阐明lncRNA在调控家蚕变态发育中的分子机制。【方法】基于前期家蚕脂肪体转录组测序数据,我们发现在蜕皮激素20E(2 μg/μL)处理5龄幼虫早期的脂肪体中lncRNA63表达显著上调,家蚕激素受体基因Hr3与之共表达。利用qRT-PCR对lncRNA63和Hr3在家蚕不同发育时期(4-5龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(头、体壁、血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、丝腺、精巢和卵巢)和2 μg/μL 20E处理2, 6, 12和24 h后5龄幼虫脂肪体中的表达谱进行分析;采用核质分离检测和原位杂交技术检测lncRNA63在家蚕BmN细胞中的定位;利用dsRNA干涉家蚕5龄幼虫个体中lncRNA63的表达,并利用qRT-PCR检测RNA干涉lncRNA63对头、丝腺、脂肪体和体壁中Hr3表达的影响。【结果】qRT-PCR结果表明,lncRNA63和Hr3在家蚕羽化前的蛹末期有一个表达高峰;二者在家蚕5龄幼虫头、体壁和丝腺中都有较高表达;lncRNA63和Hr3在2 μg/μL 20E处理2, 6和12 h的家蚕5龄幼虫脂肪体中较对照组(无水乙醇处理组)都显著上调,24 h下降到与对照组相当水平,二者的表达趋势完全一致。LncRNA63主要定位于BmN细胞核,但20E可诱导lncRNA63的核质迁移。利用dsRNA干涉lncRNA63表达后,Hr3的表达显著下调。【结论】20E不仅可调控lncRNA63的表达,还可诱导lncRNA63的核质迁移;lncRNA63可通过调控共表达基因Hr3的表达参与家蚕的变态发育过程。     

家蚕肽聚糖识别蛋白L1参与Imd信号通路

【目的】肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRP)作为一个重要的模式识别受体,在家蚕Bombyx mori的先天免疫中发挥重要的作用。本研究主要探讨家蚕PGRP-L1基因的功能及其所参与的免疫信号通路。【方法】本实验通过RT-PCR扩增获得家蚕PGRP-L1基因。利用微生物诱导实验对5龄起蚕分别注射大肠杆菌Escherichia coli、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和PBS,12 h后取体壁和头部提取RNA,然后采用RT-PCR和凝胶电泳技术测定BmPGRP-L1基因的表达水平;利用RNA干涉实验向5龄起蚕注射PGRP-L1 dsRNA或PBS,6 h后再分别注射3种灭活的微生物或PBS,然后检测家蚕体壁及头部的免疫相关转录因子(Rel,Cactus和Relish)以及家蚕多个抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)基因(攻击素基因Attacin,Moricin和葛佬素基因Gloverin)的表达情况。【结果】微生物诱导实验显示,注射大肠杆菌的实验组比注射PBS的对照组Bm PGRP-L1基因转录水平显著上调,而注射酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的实验组Bm PGRP-L1转录水平没有变化。利用RNAi技术成功敲低Bm PGRP-1表达,对Bm PGRP-L1敲低的5龄起蚕注射灭活的微生物,敲低实验组relish因子表达低于正常对照组,相应地抗菌肽基因的表达也有不同程度的下调。【结论】结果提示,BmPGRP-L1基因参与家蚕对革兰氏阴性菌大肠杆菌的免疫响应;Bm PGRP-L1基因在家蚕的体壁和头中参与Imd信号通路。     

家蚕幼虫BmToll9基因对肽聚糖和金黄色葡萄球菌的响应表达

【目的】Toll信号通路是昆虫中重要的免疫信号通路,其中Toll受体在保持Toll通路的正常免疫应答、抵抗外源病原体中起到关键的作用。本研究旨在探究肽聚糖和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus对家蚕Bombyx mori Toll受体基因BmToll9-1和BmToll9-2表达的影响。【方法】将革兰氏阳性菌细胞壁主要成分肽聚糖和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌分别注射感染家蚕5龄第1天幼虫,诱导其发生免疫反应;采用实时荧光定量PCR分析注射后不同感染时间点BmToll9-2和BmToll9-1基因在家蚕幼虫中肠、表皮、脂肪体和丝腺中的相对表达水平。【结果】往家蚕5龄幼虫中注射肽聚糖或金黄色葡萄球菌后,BmToll9-2基因出现了时间和组织的差异性表达。注射肽聚糖和金黄色葡萄球菌均能诱导5龄幼虫中肠BmToll9-2基因的表达上调,注射肽聚糖和金黄色葡萄球菌分别在3和6 h时对基因表达的诱导效果最好,且注射金黄色葡萄球菌比注射肽聚糖对基因表达的诱导效果更好。注射金黄色葡萄球菌能引起5龄幼虫表皮、脂肪体和丝腺中BmToll9-2基因的表达上调,分别于注射后24, 6和24 h时诱导效果最好。注射金黄色葡萄球菌亦能诱导同源的BmToll9-1基因的上调表达。【结论】家蚕幼虫BmToll9基因在肽聚糖或金黄色葡萄球菌注射处理后均能在不同组织中发生上调表达,推测BmToll9基因参与了家蚕对肽聚糖和金黄色葡萄球菌的免疫反应。     

脂多糖对家蚕幼虫Toll样受体基因BmToll9-2表达的影响

【目的】Toll样受体是昆虫Toll信号传导途径的一个重要组成成员,对激活昆虫机体对入侵病原微生物的先天免疫应答起着至关重要的作用。本研究旨在探究脂多糖对家蚕Bombyx mori幼虫中Toll样受体基因BmToll9-2基因表达的影响。【方法】利用RT-PCR分析BmToll9-2基因在家蚕大造品系4龄和5龄幼虫表皮、脂肪体、马氏管、中肠、神经、丝腺、胸部肌肉共7种组织中的表达特征;将脂多糖和大肠杆菌Escherichia coli注射到5龄幼虫体腔内,诱导其免疫系统响应,采用实时荧光定量PCR分析注射后不同时间BmToll9-2基因在中肠中的表达水平。【结果】RT-PCR结果表明,BmToll9-2基因在家蚕4龄幼虫的脂肪体、马氏管、神经和丝腺中高度表达,在5龄幼虫脂肪体、中肠、马氏管和神经中均有较高表达。实时荧光定量PCR结果显示,注射脂多糖能诱导5龄幼虫中肠中BmToll9-2基因转录,在注射后6 h时的诱导效果最好;注射大肠杆菌也能诱导BmToll9-2基因转录,在注射后3和6 h时的诱导效果最好。【结论】家蚕幼虫BmToll9-2基因在脂多糖和大肠杆菌处理后上调表达,提示BmToll9-2受体可能参与昆虫Toll样受体对脂多糖和细菌的识别过程。     

显微注射法制备转基因家蝇技术的建立

旨在利用显微注射法对早期家蝇(Musca domestica L.)卵注射含有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的转座子载体,实现活体基因稳定表达并对其进行验证,为开展家蝇基因功能的研究奠定基础。文中自制适用于显微注射家蝇卵的硼硅酸盐玻璃微量注射针,摸索出家蝇卵壳的软化处理条件,以NanojectⅢ高精度微量注射器为主体构建适用于家蝇的显微注射技术平台;将含有眼部特异表达的3×P3启动子、EGFP的重组质粒PiggyBac-[3×P3]-EGFP与稳定遗传表达辅助质粒pHA3pig helper显微注射到处理过的家蝇卵中,待羽化观察眼部发光情况,检测EGFP的表达及转录水平。结果表明,将家蝇卵在漂白水中漂洗35 s时卵的正常孵化率为55%,处理35 s的卵壳其硬度适宜注射且注射针头不易破碎;羽化后的家蝇眼部带有绿色荧光的占比约为3%,通过分子检测,家蝇的DNA和RNA中均扩增出EGFP特异片段,大小为750 bp。通过该技术平台,能够便捷、有效地实现报告基因在家蝇中的稳定表达,建立以家蝇为主体的生物反应器,为后续家蝇基因功能的研究提供一定参考价值。     

中华按蚊电转化显微注射技术平台的构建及其在基因瞬时过表达中的应用

【目的】构建在中华按蚊 Anopheles sinensis 中的电转化显微注射技术平台,并利用该技术平台实现活体基因瞬时过表达对其进行验证,为开展系统的基因功能研究奠定基础。【方法】以CUY21EDIT Ⅱ电转仪为主体构建中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;使用同源重组法构建 EGFP 和 Bm-iAANAT 基因的瞬时过表达质粒,在中华按蚊化蛹3 h时注射该质粒进入蛹体,随即使用电转仪对注射后的蛹进行电击,待注射个体发育至化蛹39 h时,利用体视荧光显微镜观察蛹体表皮着色和发光情况,并通过荧光定量PCR检测 EGFP 和 Bm-iAANAT 的表达。【结果】构建了用于显微注射的 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40和 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A-EGFP-SV 40过表达载体。 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40注射组中华按蚊在化蛹39 h时约87.5%的个体成活并正常黑化,这其中约92.7%的个体的表皮检测到明显的绿色荧光,注射无启动子载体 PIZ-modi-EGFP-SV 40并进行电击的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体则没有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,注射组中发光个体的 EGFP 基因明显高表达。 PIZ-modi-Aepub-AANAT-T 2 A-EGFP-SV 40注射组的蛹在化蛹39 h时有80.4%个体存活,这其中92.2%的个体相对于注射无启动子载体 PIZ-modi-AANAT- T2A -EGFP-SV 40的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A -EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体黑化明显受阻,且有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,报告基因 Bm-iAANAT 和 EGFP 的表达明显提高。【结论】成功构建了在中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现报告基因在活蛹中的瞬时过表达,并产生了目的表型。这为中华按蚊功能基因组研究奠定了基础。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin2对酚氧化酶原激活和抗菌肽基因表达的抑制作用

【目的】丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白是昆虫中调控自身免疫反应的重要蛋白酶抑制剂,本研究旨在研究家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂2(Bmserpin2)在家蚕2个重要的自身免疫通路即酚氧化酶原(prophenol oxidase, PPO)激活通路和革兰氏阳性菌诱导抗菌肽的TOLL通路中的调控作用。【方法】PCR扩增家蚕Bmserpin2基因片段后原核表达并通过镍柱纯化。利用纯化后的重组Bmserpin2蛋白分别与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白酶K反应,检测Bmserpin2对上述蛋白酶活性的影响。通过RT-qPCR检测Bmserpin2在家蚕5龄第3天幼虫头、中肠、脂肪体、血淋巴、丝腺和表皮组织中表达的模式。往家蚕5龄第3天幼虫注射Bmserpin2重组蛋白,检测Bmserpin2对其血淋巴中PPO活性的影响。通过滕黄微球菌Micrococcus luteus诱导家蚕5龄第3天幼虫产生抗菌肽并注射Bmserpin2重组蛋白后,RT-qPCR检测其血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin表达量。【结果】成功构建重组质粒并表达纯化目的蛋白Bmserpin2。通过与不同蛋白酶反应得出Bmserpin2可极显著抑制消化酶胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性,对胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K活性影响不显著,提示Bmserpin2对不同蛋白酶具有生物学活性和催化特异性。基因表达模式显示Bmserpin2在家蚕5龄幼虫血淋巴和脂肪体中表达量最高。家蚕5龄幼虫注射重组Bmserpin2蛋白后发现目的蛋白能有效抑制血淋巴中PPO活性。利用滕黄微球菌诱导家蚕5龄幼虫产生抗菌肽后,滕黄微球菌和Bmserpin2混合注射组中血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin的转录表达与只注射滕黄微球菌的比较被显著下调。【结论】Bmserpin2可能参与家蚕酚氧化酶原激活和TOLL途径的胞外级联反应的免疫通路。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin2对酚氧化酶原激活和抗菌肽基因表达的抑制作用

【目的】丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白是昆虫中调控自身免疫反应的重要蛋白酶抑制剂,本研究旨在研究家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂2(Bmserpin2)在家蚕2个重要的自身免疫通路即酚氧化酶原(prophenol oxidase, PPO)激活通路和革兰氏阳性菌诱导抗菌肽的TOLL通路中的调控作用。【方法】PCR扩增家蚕Bmserpin2基因片段后原核表达并通过镍柱纯化。利用纯化后的重组Bmserpin2蛋白分别与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白酶K反应,检测Bmserpin2对上述蛋白酶活性的影响。通过RT-qPCR检测Bmserpin2在家蚕5龄第3天幼虫头、中肠、脂肪体、血淋巴、丝腺和表皮组织中表达的模式。往家蚕5龄第3天幼虫注射Bmserpin2重组蛋白,检测Bmserpin2对其血淋巴中PPO活性的影响。通过滕黄微球菌Micrococcus luteus诱导家蚕5龄第3天幼虫产生抗菌肽并注射Bmserpin2重组蛋白后,RT-qPCR检测其血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin表达量。【结果】成功构建重组质粒并表达纯化目的蛋白Bmserpin2。通过与不同蛋白酶反应得出Bmserpin2可极显著抑制消化酶胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性,对胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K活性影响不显著,提示Bmserpin2对不同蛋白酶具有生物学活性和催化特异性。基因表达模式显示Bmserpin2在家蚕5龄幼虫血淋巴和脂肪体中表达量最高。家蚕5龄幼虫注射重组Bmserpin2蛋白后发现目的蛋白能有效抑制血淋巴中PPO活性。利用滕黄微球菌诱导家蚕5龄幼虫产生抗菌肽后,滕黄微球菌和Bmserpin2混合注射组中血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin的转录表达与只注射滕黄微球菌的比较被显著下调。【结论】Bmserpin2可能参与家蚕酚氧化酶原激活和TOLL途径的胞外级联反应的免疫通路。     

家蚕Sox家族基因BmDichaete的克隆与表达分析

【目的】Sox家族是一类转录调控因子,在多细胞动物的发育过程中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得家蚕Bombyx mori Sox家族基因,并分析其在幼虫不同组织和发育阶段的表达模式及功能。【方法】采用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆家蚕Sox家族基因,并对其序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体,诱导原核表达并得到其蛋白的多克隆抗体,并以Western blot验证其蛋白在家蚕胚胎发育时期(产卵后24,48,72,96,120,144,168,192和216 h)和蚁蚕的表达特征。同时,使用半定量RT-PCR技术分析这一基因在家蚕整个发育过程以及5龄第3天幼虫不同组织(精巢、卵巢、神经节、头部、丝腺、脂肪体、马氏管、中肠、后肠、表皮、血液、气管)中的表达谱。【结果】克隆获得一个家蚕Sox家族基因,将其命名为BmDichaete(Gen Bank登录号:KY914554),其cDNA序列全长为1 541 bp,开放阅读框长741 bp,编码246个氨基酸,预测分子量大小为27.3 kD,等电点为9.89。同源序列比对和系统进化分析显示,BmDichaete具有Sox家族的典型HMG结构域,并与其他鳞翅目昆虫的Dichaete蛋白具有较高的同源性。对其表达模式分析发现,BmDichaete在家蚕整个发育时期都有表达,从胚胎发育后期到蛹前期持续高表达,在蛹后期及成虫期表达量有所下降,并且该基因在家蚕5龄第3天幼虫的卵巢、头部、丝腺及后肠组织中显著高表达。Western blot分析结果显示,BmDichaete在家蚕胚胎发育过程中持续而稳定地表达。【结论】家蚕BmDichaete具有典型HMG结构域,属于Sox家族成员。BmDichaete在家蚕胚胎发育的各个时期都发挥作用。本研究为进一步探索该基因在家蚕中的功能奠定了基础。     

家蚕类泛素化翻译后修饰蛋白NEDD8的cDNA克隆、表达分析和亚细胞定位

【目的】NEDD8是一种重要的蛋白质翻译后修饰蛋白,对底物蛋白的功能具有重要的调节作用。本研究旨在探索家蚕Bombyx mori中NEDD8的功能。【方法】利用RT-PCR技术,从家蚕Bm N细胞中克隆了家蚕NEDD8完整的开放阅读框。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测家蚕NEDD8在不同发育阶段、5龄第3天幼虫不同组织中以及Bm NPV感染Bm N细胞后的相对表达量。通过构建GFP融合表达的重组Bm NPV(B.mori nucleopolyherovirus)感染家蚕Bm N细胞,在共聚焦显微镜下观察NEDD8在细胞中分布情况,用GFP抗体进行Western blot验证。【结果】克隆获得了NEDD8基因。序列分析表明,家蚕NEDD8高度保守,与家蚕泛素蛋白氨基酸序列一致性最高。qRT-PCR分析结果表明,NEDD8在家蚕的不同组织中均有表达,其中头部中表达量最高,其次是丝腺中,而在精巢和卵巢中表达量最低;在家蚕5龄第3天幼虫始到化蛹后第3天NEDD8的表达量开始逐渐增加,化蛾后降至低水平;在家蚕杆状病毒感染Bm N细胞的早期和极晚期NEDD8的表达量都有明显增加。GFP-NEDD8融合表达定位显示NEDD8在Bm N细胞内普遍存在,分布于整个细胞中,并且在感染48 h后存在细胞质内的聚集现象。【结论】NEDD8编码序列在物种间高度保守;NEDD8在家蚕幼虫头部中表达量最高,在化蛹阶段表达量逐渐增加;NEDD8在Bm N细胞内普遍存在并且可能与参与Bm NPV复制。本研究所得结果为进一步研究NEDD8在家蚕中的生物学功能及修饰底物蛋白的作用机制奠定了基础。     

细菌感染对家蚕DNA甲基化与组蛋白乙酰化相关基因表达的影响

【目的】探讨DNA甲基化及组蛋白乙酰化是否参与家蚕 Bombyx mori 免疫反应的调控。【方法】对家蚕与其他生物的DNA甲基转移酶 (DNMT)、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）与组蛋白乙酰转移酶（HAT）的蛋白序列进行系统进化分析;利用定量PCR检测家蚕5龄第3天幼虫感染病原菌绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 后 BmDNMT 1, BmHDACI-1, BmHDACI-2和 BmHAT 1在家蚕脂肪体组织中的表达变化;给家蚕5龄第2天幼虫注射DNMT, HDAC和HAT抑制剂,观察它们对家蚕感染细菌后的存活率的影响。【结果】系统进化分析显示,BmDNMT1在进化上呈现特殊性,独立于其他昆虫DNMT1的进化,而BmHDACs和BmHAT在进化上相对保守。定量PCR检测表明,在两种细菌感染后,BmDNMT1, BmHDACs 和 BmHAT1 在家蚕幼虫脂肪体中的表达水平均有不同程度的上升。然而,DNMT, HDAC和HAT抑制剂对家蚕幼虫感染细菌后的存活率并无明显影响。【结论】本研究发现感染绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌后,家蚕幼虫脂肪体中 BmDNMT1, BmHDACs 和 BmHAT1 的表达水平有不同程度的上调,推测DNA甲基化和组蛋白乙酰化/去乙酰化可能参与家蚕免疫反应的调控。     

家蚕β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1的CRISPR敲除载体的构建与导入

【目的】CRISPR/Cas9是近些年报道较多的基因编辑新工具,具有简便高效、特异性强等优势。BmSuc1是从鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx mori体内发现的编码β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)的基因,也是首个被克隆和鉴定的动物型β-FFase编码基因。β-FFase是作用于果糖基的蔗糖水解酶,BmSUC1可能与家蚕防御桑叶生物碱的生理过程有关,但目前其发挥作用的分子机制尚不清晰。为了解析BmSuc1在蚕体的作用途径及其生理功能,本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建表达双元sgRNA的CRISPR载体,用于敲除家蚕基因组中的BmSuc1基因。【方法】根据目的基因BmSuc1的ORF序列设计2条sgRNA,通过同源重组的方法分别插入CRISPR载体的Sal I和Nhe I酶切位点。进而利用转基因显微注射技术将该编辑载体注入G_0代蚕卵,经催青孵化饲养家蚕并自交制备G_1代蚕种。【结果】PCR验证及测序结果均表明CRISPR编辑载体构建成功。根据Ds Red2红色蛋白的荧光标记,从G_1代家蚕幼虫中成功筛选出阳性转基因个体。【结论】本文详细介绍了表达双元sgRNA的CRISPR载体的构建方法,所获得的阳性转基因家蚕对于下一步探讨BmSuc1在家蚕糖类营养的吸收与利用途径中的作用奠定了重要的实验基础,有助于阐明蚕-桑相互选择和适应的分子机制。     

家蚕吡哆醛激酶基因干扰降低转氨酶基因的转录表达

【目的】维生素B₆在氨基酸代谢中是多种酶的辅酶,维持氨基酸代谢的正常运行。磷酸吡哆醛（pyridoxal-5′-phosphate, PLP）是维生素B₆的主要辅酶形式,吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）是PLP的重要生成酶,本研究试图明确PLK基因与PLP依赖酶之间转录水平的调节关系。【方法】本研究采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）方法对家蚕 Bombyx mori 的PLK基因进行干扰,通过体外合成PLK基因的3个干扰片段（siRNA1, siRNA2和siRNA3）,将siRNA从体腔注入5龄第3天的家蚕幼虫体内诱导RNAi。利用荧光定量PCR测定不同干扰片段、不同时间点及不同组织中PLK基因表达量的变化;并测定家蚕体内磷酸丝氨酸转氨酶（phosphoserine aminotransferase, SerB）和天门冬氨酸氨基转移酶（asparate aminotransferase, AST）基因的表达量。【结果】注射干扰片段后48 h干扰效果达到最佳。3个干扰片段干扰效果从高到低依次为siRNA1, siRNA2和siRNA3。RNAi效果最好的是中肠组织,其PLK基因的相对表达量下降了55%。RNA干扰PLK基因后,后部丝腺中SerB和AST基因相对表达量分别下降了90%和29%。【结论】本研究通过RNAi实现了家蚕PLK基因干扰,并进一步证明了家蚕PLK基因和SerB基因及AST基因存在联动调节关系。     

Bmttv在家蚕翅发育过程中的功能分析

【目的】探析家蚕Bombyx mori糖基转移酶基因Bmttv在家蚕翅发育过程中的功能。【方法】通过RACE克隆家蚕Bmttv的CDS全长序列并进行生物信息学分析；使用qRT-PCR检测Bmttv在家蚕不同发育阶段(5龄幼虫、游走期幼虫、预蛹、蛹和成虫)和5龄幼虫不同组织(表皮、翅原基、精巢、马氏管、气管、丝腺、头、血淋巴、脂肪体和中肠)中的表达量；构建过表达载体，瞬时转染BmE细胞，通过免疫荧光对BmTTV进行亚细胞定位，利用qRT-PCR检测家蚕翅发育关键基因BmHippo,Bmwg,BmDpp,Bmsotv和BmHh的表达量。【结果】成功克隆到家蚕Bmttv的CDS全长序列，长2 228 bp; BmTTV蛋白具有两个特殊结构域，均与硫酸肝素聚糖(heparan sulfate proteoglycans, HSPGs)的合成相关，与黑腹果蝇Drosophila melanogaster和智人Homo sapiens TTV的氨基酸序列一致性达45%左右，与鳞翅目昆虫TTV的亲缘关系更近。Bmttv主要在家蚕蛹期开始高量表达，在5龄幼虫中肠、精巢和翅原基中高量表达。BmTTV主要...