飞蝗细胞色素P450基因LmCYP6FD3的表达及其在杀虫剂解毒中的作用

【目的】研究飞蝗Locusta migratoria细胞色素P450基因的分子特性和生物学功能。【方法】搜索飞蝗转录组数据库,获得细胞色素P450基因cDNA序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因cDNA全长序列。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术测定其在飞蝗5龄若虫不同组织(胃盲囊、前肠、中肠、后肠、体壁、精巢、卵巢、肌肉、血淋巴、脂肪体和马氏管)中及不同发育阶段(卵、1-5龄若虫及成虫)的表达水平。采用RNA干扰(RNAi)技术沉默飞蝗2龄若虫细胞色素P450基因,检测基因的沉默效率,并研究该基因干扰后,2龄若虫对杀虫剂马拉硫磷、西维因和溴氰菊酯3种杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列(Gen Bank登录号:KT316378),将其命名为LmCYP6FD3,其核苷酸序列全长为1 563 bp,编码521个氨基酸。研究发现该基因在飞蝗5龄若虫马氏管中高表达,其次是后肠和脂肪体中,在其他组织中的表达量相对较低;对LmCYP6FD3在飞蝗不同发育阶段的表达进行检测,发现该基因在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫期表达量较高。RNA干扰结合杀虫剂生物测定结果表明,LmCYP6FD3在RNA干扰24 h时的沉默效率最高;2龄若虫点滴接触西维因,RNAi处理组(dsLmCYP6FD3注射组)与对照组(ds GFP注射组)相比,死亡率提高了32%。【结论】克隆获得飞蝗LmCYP6FD3的cDNA全长序列,该基因在飞蝗马氏管中高表达,并可能参与西维因在飞蝗体内的解毒代谢。     

细胞色素P450基因及其在植物改良中的应用

细胞色素P450是一类含血红素的氧化还原酶类,它参与多种生化反应,在防御生物免受病虫害及逆境胁迫等方面具有重要作用。生物基因组序列分析表明,它是一个基因超家族。许多细胞色素P450基因已被鉴定和克隆,并应用于植物遗传改良;在转基因培育多抗性植物、创造植物雄性不育系,提高植物降解化学农药残留等污染物的能力和有效生产具有药用价值的化合物等方面已取得可喜进展,显示出广阔的应用前景。 Abstract:Cytochrome P450s are heme-containing mixed-function oxidases,involving in lots of biochemical reactions.They play an important role in preventing plants from pathogen and insect attacks and environmental stress.Sequence analysis of genomes has revealed that P450 is a gene super-family.Many cytochrome P450s have been characterized and cloned.Some of them have been used in plant genetic improvement.A great progress has been made in using these P450 genes to create the transgenic plants with multiple resistances,male sterility,higher capability to dissolve toxic chemicals and pollutants and effective productivity of high valuable compounds,indicating P450 genes have a broad prospect with great potential application.     

真菌细胞色素P450在大肠杆菌中的表达

【背景】真菌细胞色素P450蛋白在大肠杆菌中表达水平低甚至不表达,近期研究发现通过对该类蛋白氨基端(N端)氨基酸序列的修饰可优化其表达水平。【目的】在大肠杆菌系统中表达预测功能为P450酶的焦曲霉094102菌株的Au8002蛋白,为真菌P450蛋白在大肠杆菌表达系统中的N端氨基酸序列修饰策略提供有效依据。【方法】对野生型P450蛋白Au8002的氨基酸序列进行分析,对其N端序列进行了3种序列修饰,并在诱导蛋白表达时添加P450生物合成前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA),研究N端氨基酸序列修饰策略及前体添加对真菌P450在大肠杆菌中蛋白表达的影响。【结果】SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,对目的蛋白进行的3种氨基酸序列修饰均使Au8002蛋白获得了表达,前体5-ALA的添加提高了目的蛋白表达量。其中对目的蛋白进行N端全长截短时可部分增加其可溶性,同时也验证了其特征性的CO结合能力。【结论】对预测为P450酶的菌株094102蛋白Au8002氨基端(N端)氨基酸序列的修饰有效解决了其在大肠杆菌内不表达的难题,实现了其可溶性表达;另一方面P450生物合成前体5-ALA的添加也能有效提高该类蛋白的表达水平,上述策略对改善其它该类蛋白在大肠杆菌内的表达水平具有借鉴意义。     

细胞色素P450基因AsCYP6Z2在中华按蚊溴氰菊酯抗性维持中的作用

【目的】探究细胞色素P450基因AsCYP6Z2是否与中华按蚊Anopheles sinensis抗拟除虫菊酯有关。【方法】克隆中华按蚊AsCYP6Z2基因的编码区。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)检测该基因在中华按蚊溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)和抗性品系(YN-LR)雌蚊不同发育阶段的表达和在敏感品系雌蛹不同组织中的表达。雌蛹腹部后端分别在25 mg/mL溴氰菊酯溶液和纯丙酮溶液(对照)中体外培养后,采用qPCR检测AsCYP6Z2在溴氰菊酯处理组和丙酮对照组中的表达差异。于化蛹后10 h分别注射dsAsCYP6Z2(RNAi组)和dsEGFP(对照组),采用qPCR检测AsCYP6Z2在RNAi组和对照组中的表达差异;采用生物测定方法测定RNAi组和对照组中雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h内的击倒率及雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h并恢复24 h时的死亡率。通过分子对接预测该基因与溴氰菊酯相互作用的氨基酸残基。【结果】克隆获得了AsCYP6Z2基因(GenBank登录号： MT840336)的编码区,其开放阅读框(ORF)长1 251 bp,编码416个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域。发育表达谱表明,AsCYP6Z2基因主要在化蛹30 h至成蚊3 h期间高表达,且抗性品系的基因表达量明显高于敏感品系的;组织表达谱显示该基因在腹部后端的表达量较高,其次是在腹部前端和胸部,在头部的表达量最低。雌蛹腹部后端在25 mg/mL溴氰菊酯溶液中培养12 h和24 h后,处理组中AsCYP6Z2的表达量相比于对照组(纯丙酮培养组)分别上调4倍和13倍。RNAi干扰AsCYP6Z2后,RNAi组中AsCYP6Z2基因的表达量相较于对照组(dsEGFP注射组)下调了约80%。雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h后,RNAi组中的个体比对照组中的约提前20 min出现明显的击倒现象,且击倒率明显高于对照组;雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h并恢复24 h后,RNAi组中的个体死亡率相比对照组增加了17%, 表明沉默AsCYP6Z2基因导致蚊虫对溴氰菊酯的敏感度显著增加。溴氰菊酯与AsCYP6Z2预测蛋白的分子对接研究结果显示,溴氰菊酯可以进入AsCYP6Z2蛋白的结合口袋,并且与Cys-155形成Pi-硫相互作用以及产生较稳定的氢键,侧链也可与AsCYP6Z2的Ala-165, Val-72, Leu-76, Leu-82和Ala-24等氨基酸残基形成稳定的疏水相互作用网络。【结论】研究结果表明AsCYP6Z2基因参与中华按蚊溴氰菊酯抗性表型的维持,这为进一步探究该基因在拟除虫菊酯类杀虫剂代谢过程中的分子机理奠定了前期基础。     

细胞色素P450基因AsCYP6Z2在中华按蚊溴氰菊酯抗性维持中的作用

【目的】探究细胞色素P450基因AsCYP6Z2是否与中华按蚊Anopheles sinensis抗拟除虫菊酯有关。【方法】克隆中华按蚊AsCYP6Z2基因的编码区。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)检测该基因在中华按蚊溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)和抗性品系(YN-LR)雌蚊不同发育阶段的表达和在敏感品系雌蛹不同组织中的表达。雌蛹腹部后端分别在25 mg/mL溴氰菊酯溶液和纯丙酮溶液(对照)中体外培养后,采用qPCR检测AsCYP6Z2在溴氰菊酯处理组和丙酮对照组中的表达差异。于化蛹后10 h分别注射dsAsCYP6Z2(RNAi组)和dsEGFP(对照组),采用qPCR检测AsCYP6Z2在RNAi组和对照组中的表达差异;采用生物测定方法测定RNAi组和对照组中雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h内的击倒率及雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h并恢复24 h时的死亡率。通过分子对接预测该基因与溴氰菊酯相互作用的氨基酸残基。【结果】克隆获得了AsCYP6Z2基因(GenBank登录号:MT840336)的编码区,其开放阅读框(O...     

人细胞色素P450在大肠杆菌中的功能表达

研究人细胞色素P450（P450,CYP）在大肠杆菌中的功能表达对新药研发,临床药物治疗和药物早期ADME/T性质研究均有重要意义。异源表达人P450使用最多的宿主是大肠杆菌E.coli,然而要获得足量的有催化活性的P450仍是一个难题。结合作者近年研究,对异源表达的研究意义,P450在E.coli中功能表达的策略,高效表达的影响因素和共表达等方面做一评述,指出今后的研究应用方向。     

昆虫细胞色素P450基因的克隆及其策略

本记述了目前已克隆的105个昆虫细胞色素P450基因cDNA和片段,它们分属CYP4、CYP6、CYP9、CYP12、CYP18和CYP28等6个家族：同时,综述和分析了克隆这些基因、cDNA和片段所采用的策略及其优缺点。     

刺五加细胞色素P450基因的克隆与表达分析

根据已报道的人参、三七等植物的细胞色素P450(Cytochrome P450,P450)基因的cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加P450基因的cDNA全长序列,并分析其在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果显示,克隆了全长为1 410 bp的刺五加P450基因的cDNA序列,该基因编码469个氨基酸残基组成的蛋白质。GenBank登录号为KF498590,与人参、三七的P450氨基酸序列一致性分别为91.5%和90.4%。刺五加的P450基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P0.05)。最大表达量出现在盛花期,为最低表达量(萌芽期)的1.26倍。各器官中,叶片的表达量最高,是最低量幼茎的1.49倍。     

植物细胞色素P450基因的异源表达系统研究进展

细胞色素P450氧化酶是一类具有多种催化功能含血红素的氧化酶系。由于参与多种类型的氧化反应,在植物生命活动中有重要功能,其研究一直受到重视。自1990年第一个植物P450基因成功克隆以来,到2002年年底,已有600多个P450基因被克隆,有100多个基因在细菌、酵母、杆状病毒昆虫细胞等异源表达系统中成功表达并鉴定了功能。拟对植物P450的大肠杆菌、酵母、杆状病毒昆虫细胞表达系统的特点进行比较,对在各表达系统中成功表达并进行了功能鉴定的植物P450进行归纳,并对目前植物P450异源表达的现状和应用进行概述。     

家蚕细胞色素P450基因的研究进展

细胞色素P450（P450s, CYPs）超基因家族是由数量众多、 功能复杂的一类血红蛋白酶基因所组成, 对许多结构多样的外源与内源化合物起着氧化代谢的作用。本文系统地综述了家蚕Bombyx mori基因组中P450s的数量与种类, 其数量比食腐昆虫和杂食性的植食昆虫少, 但比意大利蜜蜂Apis mellifera多, 在基因组中大多呈串联重复排列, 基因结构与系统进化树之间有着紧密的联系。家蚕与黑腹果蝇Drosophila melanogaster P450s的比较基因组学分析发现, 存在10对直向同源基因, 但CYP3与CYP4集团（Clan）的P450s表现出种属特异性扩增。家蚕P450s与其蜕皮激素和保幼激素合成代谢有关, 并涉及到对氟化物与杀虫剂抗性。家蚕作为鳞翅目昆虫的代表, 通过对其P450s的研究, 可望为其他昆虫, 特别是鳞翅目昆虫的生长发育研究和抗性治理提供理论依据和研究模式。     

细胞色素P450基因的命名及其基因表达的调控

<正> 作者于1990年对细胞色素P450的分子特征和光谱特征、P450的多样性、诱导性及其分子机理、以及P450在昆虫的适应性和抗药性中的作用作了介绍。如前二文所述,在动物、植物、微生物等生物体内都存在着许多种不同的细胞色素P450(以下简称P450)。这些含血红素的蛋白能催化许多种不同亲脂底物的加单氧反应,其氧化产物可能成为无毒物质,     

棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆与融合表达

细胞色素P450 CYP6B7被推测与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关,但至今尚无CYP6B7参与杀虫剂代谢方面的直接证据。为揭示CYP6B7的代谢功能,作者以棉铃虫幼虫基因组DNA 为模板,以CYP6B7基因设计特异性引物,扩增出包含321 bp内含子的CYP6B7基因。用反向PCR的方法消除内含子,获得包含完整的CYP6B7基因的开放阅读框。将CYP6B7基因与pMAL-c2X载体连接,并转化E.coli TB1细胞,在IPTG诱导下,CYP6B7能与载体基因编码的麦芽糖结合蛋白（MBP）在大肠杆菌中融合表达,表达产物经直链淀粉（amylose） 柱亲和层析分离洗脱后,得到SDS-PAGE电泳纯的融合蛋白。     

淡色库蚊细胞色素P450基因研究

采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,以反转录-聚合酶链反应从淡色库蚊对溴氰菊酯敏感品系和抗性品系成虫RNA扩增到约485 bp和510 bp两个片段,将这两个片段与PinPoint^TMXa-1 T质粒重组,然后克隆至大肠杆菌JM109菌株,筛选获得68个阳性克隆;其中24个阳性克隆测序后与GenBank资料对照,显示为细胞色素P450新序列;分子系统学研究显示,24个新基因（等位基因）分别属CYP4家族CYP4C、CYP4D、CYP4H和CYP4J等4个亚家族,其已由细胞色素P450命名委员会命名和GenBank登录上网;其中CYP4C23可能是一个假基因,CYP4H13具有一段58个碱基长度的内含子,CYP4J4V1在近3′端具有一个终止密码子TAG.     

昆虫细胞色素P450的研究:P450基因的进化

80年代分子生物学方法被用于分离和鉴定特定P450的CDNA或基因组克隆［‘］,至今已知的P450基因包括70个基因家族、127个亚家族的40O多个,基因序列的数量还在迅速增加I’］。不同P450间的进化关系在一些综述中都有涉及［”’,‘］,本文介绍这一主题的一些主要观点,重点放在P450功能的进化及其机制。亚细胞色素P450的基本特征及其分类与命名所有细胞色素P450具有一非共价结合的血红素和环绕高度保守的半跳氨酸的一段26氨基残基的保守序列,这一半跳氨酸提供血红素铁的第5个配体（ligand）。当血红素铁接受电子被还原后再与CO结合产…     

细胞色素P450在植物与昆虫相互关系中的作用

细胞色素P4 5 0在植物与昆虫相互关系中发挥重要的作用 ,植物可以利用P4 5 0来合成有毒物质以防御昆虫的取食 ,而昆虫则利用P4 5 0对植物毒素进行代谢解毒 ,昆虫以植物代谢中间物为原料合成自身活性物质的过程也有P4 5 0的参与。通过长期的协同进化 ,植物与昆虫的相互作用不仅表现在P4 5 0底物特异性方面 ,也反映在P4 5 0的表达调控上。     

三角帆蚌细胞色素P450基因的克隆与表达分析

CYP是一类以血红素为辅基的末端加氧酶,广泛存在于人、动物、植物和微生物之中,参与许多外源性物质(药物、毒物和环境污染物质等)和内源性物质(激素、脂肪酸等)的代谢,在碳源同化、激素合成、外源物质降解和致癌物质消除等方面发挥重要作用,亦对维持生物体     

昆虫抗药性相关细胞色素P450基因的表达调控机制

杀虫剂的频繁持续使用,必然导致昆虫产生抗药性.大量研究事例表明参与杀虫剂解毒的细胞色素P450(简称P450)过量表达是昆虫对不同类型杀虫剂产生抗性的重要原因,但目前人们对P450基因过量表达机制的认识还非常有限.近十年来,随着生命科学与相关研究技术的发展,有关昆虫P450基因表达调控机制的研究取得了实质性的进展.本文...     

东亚飞蝗细胞色素P450基因的克隆及表达分析

本文克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)细胞色素P450(cytochrome P450)基因全长,表达重组蛋白,并对其可溶性进行了分析。通过提取东亚飞蝗总的RNA,反转录成cDNA,设计特异性引物,PCR克隆东亚飞蝗细胞色素P450基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达结果。结果表明:东亚飞蝗细胞色素P450基因开放阅读框全长为1 551 bp,编码516个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗细胞色素P450基因(HM153426)的同源性为99%,重组质粒pET-28a-P450在E.coli Rosetta中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为53 000,主要以包涵体的形式存在。     

细胞色素P450在生物除污中的应用

人类生存环境中的有毒废物日益增多 ,特别是多环芳烃及多卤代有机物 ,它们的生物利用率低且化学上惰性 ,成为环境污染治理的一大难题 ,迫切需要开发一种有效的途径以解毒或降解这些废物。Ｐ45 0酶系可以催化许多结构不同的物质羟基化、环氧化、脱烷基或脱卤化氢等 ,使其化学性质发生改变。人类活动产生的 2 0 0 0 0 0种环境化合物中大多数是Ｐ45 0的可能底物 ,这使Ｐ45 0在环境的生物除污 (ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ)应用中具有广阔前景。1 .天然Ｐ45 0的利用微生物Ｐ45 0无处不在 ,它们具有强的还原和氧化能力 ,对于环境的生物净化十分…     

棉蚜细胞色素P450 CYP6J1的克隆与表达

为了深入了解细胞色素P450 CYP6J1蛋白的结构和功能,本实验克隆获得了棉蚜Aphis gossypii P450CYP6J1基因,对该基因进行信息学及原核表达分析,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达结果,并用Western-blot进行验证。结果表明,P450 CYP6J1序列长1 398 bp,编码氨基酸数为465,理论分子量为53.67 k D,理论等电点为8.80。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。同源性分析表明,棉蚜c DNA序列推导的氨基酸与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的保守性最为接近,一致性可达92%。在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得的His-CYP6J1蛋白,并用Western-blot检测目的蛋白大小正确。这些研究结果为棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗体制备提供了基础。