管氏肿腿蜂毒液过敏原3基因的克隆及表达分析

为研究管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液过敏原3基因SgA3的功能,通过RT-PCR克隆SgA3基因,采用荧光定量PCR分析其在不同发育阶段和组织中的表达特征,并利用载体pSUMO-Mut对其进行原核表达。克隆获得SgA3基因开放阅读框长699 bp,编码233个氨基酸,其中信号肽位于N端第1~23位氨基酸。多序列比对分析发现,SgA3与丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis、粉蝶盘绒茧蜂Cotesia glomerata、红火蚁Solenopsis invicta和常见黄胡蜂Vespula vulgaris过敏原3的氨基酸序列一致性分别为50.44%、50%、48.89%和47.83%。荧光定量PCR结果表明,SgA3基因在雌成虫中高表达,且在毒液器官中的表达量显著高于雌成虫其他组织和雄成虫中的表达量。利用pSUMO-Mut表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的SgA3重组蛋白。该研究结果为进一步研究SgA3基因的功能奠定了基础。     

管氏肿腿蜂毒液抗凝血酶Ⅲ基因的克隆与表达分析

[目的]克隆和表达管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液抗凝血酶Ⅲ(AntithrombinⅢ)基因SgAT-Ⅲ,为深入研究该毒液基因的生理功能奠定基础.[方法]利用逆转录PCR技术克隆SgAT-Ⅲ基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列,使用生物信息学软件分析其基因序列结构特征,通过qPCR技术分析其在雌成虫不同组织中的表达模式,采用载体pCzn1对其进行原核表达.[结果]克隆得到SgAT-Ⅲ基因的ORF,长1338 bp,编码446个氨基酸,其中第1-19位氨基端为信号肽,理论分子量49.49 ku,等电点6.23.多序列比对分析表明,SgAT-Ⅲ与蚂蚁AT-Ⅲ具有较高的氨基酸一致性(＞64％),C末端具有serpin蛋白家族典型反应中心环区,含有供靶标蛋白识别的活性裂解位点.系统发育分析表明,SgAT-Ⅲ与膜翅目其他昆虫的AT-Ⅲ亲缘关系较近,且与蚂蚁的AT-Ⅲ聚为一支.qPCR分析表明,SgAT-Ⅲ基因在毒液器官中高表达.SDS-PAGE电泳检测发现,成功表达SgAT-Ⅲ重组蛋白,纯化得到高纯度的重组蛋白.[结论]克隆得到SgAT-Ⅲ基因,其在毒液器官中高表达,纯化得到SgAT-Ⅲ重组蛋白,为进一步研究该毒液基因的生理功能奠定了基础.     

管氏肿腿蜂毒液器官超微结构观察

应用透射电镜技术,观察了管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液器官的超微结构.毒腺由基膜层、分泌细胞层、导管细胞层和内膜层构成,分泌细胞内含内质网、末端附器、分泌囊泡、分泌颗粒、液泡等细胞器,其内合成的毒液由末端附器输送至毒腺的腔体.毒囊由肌肉鞘层、上皮细胞层和内膜层组成,肌肉鞘内的肌纤丝规则排列不交错,上皮细胞层内细胞器稀少,内膜层呈波浪状均匀加厚.     

烟夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析

为了深入了解精氨酸激酶基因的作用和寻求害虫防治新的分子靶标, 本研究采用RT-PCR和RACE技术, 从烟夜蛾Helicoverpa assulta脂肪体中克隆了精氨酸激酶cDNA序列, 命名为HassAK（GenBank登录号: HQ336337）, 并采用荧光定量PCR测定了HassAK基因在不同发育阶段（4龄幼虫第1天到化蛹第1天）、 不同组织（头部、 中肠、 脂肪体、 体壁和腹足）和不同温度条件下的表达情况。测序和序列分析结果表明, HassAK基因阅读框架全长1 068 bp, 编码355个氨基酸残基, 预测蛋白质分子量和等电点分别为40.0 kD和5.76。氨基酸序列分析表明, 该序列具有精氨酸激酶典型的酶活性部位、 酶活性中心位点和能形成离子偶结构的保守区。序列比对结果表明, HassAK与其他昆虫AK的氨基酸序列具有70%以上的一致性。荧光定量分析结果显示, HassAK基因在幼虫头部、 中肠、 脂肪体、 体壁和腹足均可表达, 其中以腹足和中肠内的表达水平较高。时序表达分析表明, 预蛹期HassAK基因的表达量达到高峰。此外, 高温和低温均诱导HassAK基因的表达, 说明该基因可能参与昆虫抵御外界不良环境。     

滇龙胆甲羟戊酸激酶基因的克隆与表达分析

甲羟戊酸激酶是甲羟戊酸途径的关键酶。根据滇龙胆转录组甲羟戊酸激酶基因Gr MK序列,设计一对基因特异性引物克隆该基因,并进行序列分析;构建原核表达载体p GEX-4T-1-Gr MK,转入大肠杆菌Rosetta(DE3),重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下成功表达。生物信息学分析结果表明,Gr MK蛋白为甲羟戊酸激酶家族成员,具有MK蛋白保守结构域:乳糖激酶/高丝氨酸激酶/甲羟戊酸激酶/磷酸甲羟戊酸激酶(GHMP kinase)N端结构域、C端结构域和ATP结合结构域;Gr MK与长春花Cr MK亲缘关系最近.原核表达结果表明,融合蛋白相对分子质量与推断大小一致。组织特异性表达分析结果表明Gr MK基因主要在根中表达.这些结果为Gr MK蛋白结构和功能的研究奠定基础。     

东亚飞蝗主要过敏原精氨酸激酶基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

本研究克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因全长,表达并纯化重组AK蛋白,研究重组蛋白的免疫反应性。东亚飞蝗AK基因开放阅读框全长为1 068 bp,编码355个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗AK(DQ513322)基因同源性为98%,重组质粒pET-28a-AK在E.coli中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为40 000,主要以可溶性形式表达,经亲和层析获得重组蛋白。通过免疫印迹分析结果表明,重组AK蛋白可被过敏性患者血清识别,免疫原性良好。结果表明我们成功获得东亚飞蝗精氨酸激酶全长基因并表达出重组AK蛋白,重组AK蛋白具有良好的免疫反应性。     

发菜中超氧化物歧化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用基因工程技术从发菜总DNA中克隆了一段的基因序列,该序列与基因库中已公布的编码地木耳（Nostoc commnue）超氧化物歧化酶的氨基酸序列同源性为97%。将该基因插入含T7启动子质粒pET-32中构建表达质粒pET-sod,然后将该表达质粒转入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达,表达菌株用1 mmol·L^-1 IPTG诱导表达数小时后,产生较多的重组的蛋白,且该蛋白以可溶性蛋白形式存在。SDS-PAGE分析表明,在相对分子量约为22 kd的位置有一条明显蛋白质带。将诱导表达后的蛋白通过亲和层析的方法进行蛋白纯化;NBT光还原法测定表达产物的比活力,每毫克纯化蛋白约为2 550 U。对纯化后的蛋白进行高温胁迫研究,将该纯化蛋白在60℃高温下胁迫90 min后,其活性为原（未经胁迫）蛋白活性的85%。     

昆虫精氨酸激酶的研究进展

精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是广泛分布于无脊椎动物组织内的磷酸原激酶,在能量代谢方面起着关键性作用,与昆虫和其他无脊椎动物的一系列重要生命活动密切相关。本文从组织化学和结构特点、cDNA序列特征和表达、生理学和生物学功能3个方面概述了昆虫精氨酸激酶的研究进展,探讨了未来的主要研究领域。     

柑橘果糖激酶基因的克隆及表达

植物果糖激酶(FRK)在果糖磷酸化中起重要作用。通过PCR技术从温州蜜柑(Citrus　unshiu　Marc.)基因组中扩增得到编码果糖激酶基因的2个基因组DNA片段,分别命名为Cufrk1、Cufrk2,利用RT-PCR从果实中分离到了与Cufrk1外显子序列一致的cDNA序列,并通过RACE技术分离到这个基因的全长cDNA序列,命名为CuFRK1(GenBank号:　AY561840)。Cufrk1与Cufrk2编码氨基酸序列相似性为68%。CuFRK1　cDNA全长为1　459　bp,5'端和3'端的非翻译区分别为167　bp和239　bp,该序列含有一个完整的开放读码框,编码350个氨基酸,蛋白质分子量约为37.5　kD,等电点为5.03,含有2个果糖激酶糖特异结合域及3个ATP结合域,其氨基酸序列与其他植物中已分离的果糖激酶基因相似性在62%￣78%。Northern分析显示,CuFRK1(Cufrk1)与Cufrk2在柑橘幼叶、发育初期果实中表达量较高,在果皮和茎中不表达,在花瓣及成熟果实中表达模式有一定差异。酶活性分析表明,果实中的果糖激酶活性随果实的发育而降低,同时,果实中的果糖不断积累,在果实整个发育过程中果糖含量与果糖激酶活性呈极显著负相关。     

Molecular cloning and expression analysis of the mevalonate kinase gene from Arabidopsis thaliana

Mevalonate kinase (MVK), the enzyme that catalyzes the phosphorylation of mevalonate to produce mevalonate 5-phosphate, is considered as a potential regulatory enzyme of the isoprenoid biosynthetic pathway. The Arabidopsis thaliana MVK gene corresponding to the MVK cDNA previously isolated has been cloned and characterized. RNAse protection analysis indicated that the expression of the MVK gene generates three mRNA populations with 5 ends mapping 203, 254 and 355 nt upstream of the MVK ATG start codon. Northern blot analysis showed that the MVK mRNA accumulates preferentially in roots and inflorescences. Histochemical analysis, with transgenic A. thaliana plants containing a translational fusion of a 1.8 kb fragment of the 5 region of the MVK gene to the -glucuronidase (GUS) reporter gene, indicated that the MVK 5-flanking region directs widespread expression of the GUS gene throughout development, although the highest levels of GUS activity are detected in roots (meristematic region) and flowers (sepals, petals, anthers, style and stigmatic papillae). The expression pattern of the MVK gene suggests that the role of the encoded MVK is the production of a general pool of mevalonate-5-phosphate for the synthesis of different classes of isoprenoids involved in both basic and specialized plant cell functions. Functional promoter deletion analysis in transfected A. thaliana protoplasts indicated that regulatory elements between positions –295 and –194 of the MVK 5-flanking region are crucial for high-level MVK gene expression.     

人工扩繁管氏肿腿蜂的蜂种复壮研究

利用中间寄主黄粉甲Tenebrio molitor L.蛹大量扩繁管氏肿腿蜂Scleroderma guani Xiao et Wu经多代后寄生效果下降,系由蜂种退化所致:利用一种中间寄主导致蜂种的营养来源单一;采用同一种群的蜂及较低的蜂虫比造成近亲繁殖。据此设计复壮措施:利用自然寄主回接、杂交和控制交尾方式。结果表明:(1)回接1代,其子代蜂种的寄生率和寄生成功率分别提高26%和28%~33%。(2)用外缘蜂种与本群蜂种杂交,其子代蜂的发育历期比对照少4d,寄生率和寄生成功率分别提高22%和17%。(3)控制交尾方式促进蜂种复壮。     

Molecular cloning and expression of a MAP kinase homologue from pea

The cdc2 kinases are important cell cycle regulators in all eukaryotes. MAP kinases, a closely related family of protein kinases, are involved in cell cycle regulation in yeasts and vertebrates, but previously have not been documented in plants. We used PCR to amplify Brassica napus DNA sequences using primers corresponding to amino sequences that are common to all known protein kinases. One sequence was highly similar to KSS1, a MAP kinase from Saccharomyces cerevisiae. This sequence was used to isolate a full-length MAP kinase-like clone from a pea cDNA library. The pea clone, called D5, shared approximately 50% amino acid identity with MAP kinases from yeasts and vertebrates and about 41% identity with plant cdc2 kinases. An expression protein encoded by D5 was recognized by an antiserum specific to human MAP kinases (ERKs). Messenger RNA corresponding to D5 was present at similar levels in all tissues examined, without regard to whether cell division or elongation were occurring in those tissues.     

管氏肿腿蜂的胚胎发育观察

管氏肿腿蜂Scleroderma guani Xiao et Wu的卵在24℃和RH60%~70%条件下发育约140h孵化。根据胚胎外形的发育特点,可将整个发育过程可分5个阶段:早期发育阶段、胚胎伸长期、原躯原头分化阶段、器官形成阶段和胚胎成熟期。胚层形成趋于简单化,未形成解剖学上比较完整的呼吸、排泄及循环等系统。口道形成后,胚胎体积逐渐增加,这表明胚胎在发育过程中吸收了寄主的营养物质。     

Molecular cloning, expression and evolutionary analysis of the avian tyrosine kinase JAK1

The Janus protein tyrosine kinases (JAK) constitute a protein family that plays a pivotal role in signalling of a large number of cytokine receptors. The cDNA of the chicken homologue of JAK1 was cloned and its nucleotide sequence determined. Chicken JAK1 protein comprises 1150 amino acids as deduced from its cDNA sequence with a calculated molecular mass of 133 kDa. The overall structure of JAK proteins exemplified by the JAK homology domains JH1–JH7 is also preserved in chicken JAK1. Additionally, phylogenetic analysis demonstrates that chicken JAK1 is more closely related to mammalian JAK1 than to those of fish, exhibiting 80%, 79% and 63% identity in amino acid sequence to human, mouse and zebrafish JAK1, respectively. JAK1 proteins were found to be most conserved in the kinase (JH1) and pseudokinase (JH2) domains. This data is supported by Southern hybridization studies of ZOO blots. Chicken JAK1 shows a ubiquitous expression pattern and is transcribed as a 5.5 kb mRNA in various tissues and cell types. JAK1 expression was particularly high in lymphoid cells.     

管氏肿腿蜂对锈色粒肩天牛的防治试验

利用管氏肿腿蜂进行了防治锈色粒肩天牛幼虫的试验,结果表明:锈色粒肩天牛幼虫的寄生死亡率可达40%~70%,而且幼虫的寄生死亡率随着放蜂量的增加而提高,按虫蜂比1∶1、1∶5和1∶10分别放蜂,寄生死亡率依次为35.4%、48.3%和68.9%;最佳放蜂时间为8月中旬,此时放蜂的校正寄生率为55.67%,明显地高于7月份和9月份。