四个达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的建立及其生物学特性

【目的】建立达摩凤蝶 Papilio demoleus Linnaeus新孵幼虫细胞系,并对其生物学特性进行研究。【方法】使用改良配方的Grace培养基并辅以20%胎牛血清,通过原代和传代培养建立达摩凤蝶新孵幼虫细胞系。通过显微观察、细胞活力分析、核型分析和分子鉴定,获得4个新建细胞系的生物学特性数据。使用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组分泌型碱性磷酸酶杆状病毒(AcMNPV-SEAP)。使用有限稀释法测定达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-SEAP的半数组织培养感染剂量(TCID₅₀), 比较达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-SEAP的敏感性。【结果】建立了4个贴壁生长的达摩凤蝶新孵幼虫细胞系(RIRI-PaDe-1, RIRI-PaDe-2, RIRI-PaDe-3及RIRI-PaDe-4),且均传至60代以上。形态学方面,细胞系RIRI-PaDe-1和RIRI-PaDe-4较为相近,均由圆形、梭形以及多边形细胞组成,细胞系RIRI-PaDe-2主要为圆形细胞,而RIRI-PaDe-3主要为类似表皮细胞和纤维状细胞。细胞增殖动力学方面,4个细胞系的群体倍增时间分别为69.77, 67.42, 81.48及65.43 h。核型分析显示4个细胞系染色体数量均呈正态分布,其中RIRI-PaDe-2, RIRI-PaDe-3以及RIRI-PaDe-4的染色体数目分布区间比较接近,在45~97条之间,RIRI-PaDe-1的染色体条数相比偏少,在36~90条之间。通过比对4个达摩凤蝶细胞系和虫卵的细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因序列,证明4个新建细胞系来源于达摩凤蝶组织。比较4个细胞系对AcMNPV-SEAP敏感性发现RIRI-PaDe-3对此病毒较为敏感,可作为重组杆状病毒表达的宿主。【结论】虽然4个新建达摩凤蝶细胞系的来源相同,具有相同的遗传背景,但其生物学特征仍有明显差异,具有进一步研究的价值。     

粉纹夜蛾新细胞克隆株Tn5B-40的研究(英文)

从Tn5B1-4细胞系中克隆并筛选出了新克隆株Tn5B-40,测定分析结果表明,该克隆株对病毒(AcNPV)的敏感性和生长特性与原始细胞无显著差异,但在重组蛋白表达方面,无论对β-半乳糖苷酶还是碱性磷酸酶都明显地高于野生型细胞系,其中β-半乳糖苷酶在第6天的表达为原始细胞株的2倍,碱性磷酸酶的表达在第9天最高为原始细胞株的1.4倍。因此,该细胞是一株高产病毒和高表达重组蛋白的新克隆株。     

基于对虾白斑综合症病毒极早期启动子的新型杆状病毒表达载体的构建与分析

摘要：【目的】构建携带有受杆状病毒多角体启动子控制的疱疹性口腔炎病毒糖蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV G)和受白斑综合症病毒极早期基因(immediately-early gene 1,ie1)启动子控制的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)两个表达阅读框的新型重组病毒vAc-G-EGFP,分析其在无脊椎动物和脊椎动物细胞系中表达报道基因的能力。【方法】 利用Bac-To-Bac 系统构建重组杆状病毒,利用病毒感染或转导实验介导报道基因在待测细胞系中的表达,用荧光显微镜和免疫印迹技术分析报道基因在待测细胞系中的实时表达情况。 【结果】成功构建了分别含VSV G 和 ie1启动子两个阅读框的重组杆状病毒vAc-G-EGFP,发现vAc-G-EGFP可以在无脊椎和脊椎动物细胞系中有效表达报道基因EGFP,免疫印迹实验显示,在不同时间点EGFP于这两类细胞中的表达存在差异。【结论】 基于白斑综合症病毒ie1启动子并携带有VSV G表达框的单一杆状病毒载体可以实现同时在不同种类细胞系中有效表达外源基因。本文构建的新型杆状病毒表达载体有希望普遍应用于基础和应用生物学研究。     

鸡痘病毒NX10株TK基因在病毒复制中不是完全非必需的

【目的】禽痘病毒(FPV)是痘病毒科禽痘病毒属的成员。FPV因其基因组庞大,含有大量复制非必需区,目前作为活病毒载体在禽类和哺乳动物中广泛使用。重组位点的选择是禽痘病毒载体构建的先决条件,外源基因的插入不影响病毒复制是筛选插入位点的前提。因此,鉴定可供外源基因插入的复制非必需位点将为重组病毒的构建提供更多选择。本研究拟鉴定FPV NX10株胸苷激酶(TK)基因在病毒复制中的必要性。【方法】以TK基因作为靶基因,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记构建转移载体,FPV NX10株为亲本病毒,通过同源重组筛选重组病毒r FPV-ΔTK-EGFP。通过在CEF细胞培养物中添加5-溴脱氧尿苷(BUd R)验证TK基因在FPV复制中的作用。【结果】构建了转移载体p UC19-TK AB-EGFP。在转染后重组病毒克隆纯化过程中,蚀斑克隆中绿色荧光病变所占的比例逐渐增加,但在荧光蚀斑的边缘能观察到不带荧光病变的存在。对第9-15轮随机选取的蚀斑克隆的Western blot分析表明,重组病毒中插入的EGFP基因均能够正确表达,但PCR结果显示在重组病毒中始终存在野生型病毒。在细胞培养液中添加BUd R后,重组病毒不能继续生长。【结论】FPV NX10毒株TK基因在该病毒的复制中不是完全非必需的。     

GII型诺如病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达与定位研究

【目的】利用杆状病毒表达系统表达诺如病毒(GenegroupⅡ)VP2蛋白,分析其亚细胞定位,为深入研究VP2蛋白的功能奠定基础。【方法】设计可扩增完整ORF3基因片段的引物P1和P2,在下游引物中引入6×His标签的编码序列,从质粒pMD-ORF3中克隆了含有6×His编码序列的ORF3基因,与pFastBac1载体连接,构建重组质粒pFB-ORF3,转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒基因组Bac-ORF3,脂质体介导转染sf9昆虫细胞获得表达VP2蛋白的重组杆状病毒Ac-VP2,感染sf9细胞后,收集病变细胞,采用抗6×His标签的单克隆抗体作为一抗进行Western blot与间接免疫荧光实验鉴定。【结果】Western blot实验证实Ac-VP2感染的sf9细胞在约29 kD处出现特异性条带;间接免疫荧光实验证实Ac-VP2感染的sf9细胞出现特异性绿色荧光,并且VP2主要定位于sf9的细胞核与细胞膜。【结论】诺如病毒VP2蛋白在Ac-VP2感染的sf9细胞中获得成功表达,并且主要定位于sf9细胞的细胞核与细胞膜。     

结核分枝杆菌同源重组基因敲除系统的构建和应用

【目的】结核分枝杆菌同源重组效率很低,突变株的构建需要半年之久。本研究的目的在于构建一种用于在结核分枝杆菌中进行基因快速敲除、且易于筛选的高效同源重组系统。【方法】野生型结核分枝杆菌转化含有SacB反向选择标记、且能诱导表达两种同源重组酶gp60和gp61的质粒pSL002。然后分别将靶基因的两个同源臂克隆入到含有hyg(潮霉素)抗性基因和gfp(绿色荧光蛋白)基因的重组质粒pSL001中,再将靶基因同源臂-loxP-hyg-gfp-loxP片段从pSL001切下,转化含有pSL002的野生型结核分枝杆菌,一步得到双交换突变株。再将含有SacB反向选择标记、且表达Cre重组酶的质粒pSL003转化入结核分枝杆菌双交换突变株中,切除两个loxP之间的hyg抗性基因和gfp基因,得到无痕缺失突变株。最后利用含有2%蔗糖的琼脂糖平板去除含有SacB反向选择标记的质粒pSL002和pSL003。【结果】在结核分枝杆菌中成功构建了高效同源重组系统,利用该系统构建了rv1364c、pstP跨膜区、pstP胞外区三个突变株,得到双交换突变株的效率为25%-62.5%,从双交换突变株得到无痕缺失突变株的效率为100%。通过gfp作为荧光标记基因,利用NightSea BlueStar蓝光手电筒和滤光眼镜,可以对平板上的基因缺失株直接进行快速判定。【结论】该同源重组系统利用gp60和gp61重组酶,在时间上将在结核分枝杆菌中无痕缺失突变株的构建从6个月缩短到3个月。这是目前为止在结核分枝杆菌中构建突变株最快且效率最高的方法,为加速分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工具。     

重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达

【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β (PDGFRβ)链膜外区与人IgG Fc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97 kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过Protein A亲和层析,获得了纯度达75％以上,表达量为1 μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c 3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。     

Expression of three reporter genes in four cell lines developed from <Emphasis Type="Italic">Papilio demoleus</Emphasis> Linnaeus (Lepidoptera: Papilionidae)

This paper used recombinant baculoviruses that carried three reporter genes, green fluorescent protein (GFP), β-galactosidase, and secreted alkaline phosphatase (SEAP), to infect four new cell lines from Papilio demoleus Linnaeus larvae (named RIRI-PaDe-1, RIRI-PaDe-2, RIRI-PaDe-3, and RIRI-PaDe-4). The expression levels of the three recombinant proteins were detected at 24, 48, 72, 96, 120, and 144 h after infection and compared with Sf9 and High Five cells to evaluate the characteristics of these four cell lines as host cells. The inoculation densities of the tested cell lines were 2?×?10⁴ cells/well (96-well plate) and 1?×?10⁵ cells/well (24-well plate), and adding a volume of virus stock resulted in an MOI of 5.0. The results showed that the four cell lines could be infected by recombinant baculovirus and that cell lysis occurred 96 h after infection. In the four tested cell lines, only a small number of RIRI-PaDe-1 and RIRI-PaDe-3 cells expressed recombinant GFP and showed green fluorescence. The expression was much lower than that of Sf9 and High Five. Comparing the intracellular and extracellular activity of β-galactosidase indicated that the P. demoleus cell system was more suitable for the expression of secreted proteins, and its extracellular β-galactosidase level was close to that of Sf9, but the expression level of SEAP was far lower than those of Sf9 and High Five.     

灵活操控果蝇翅芽中wingless基因表达水平的策略

【目的】灵活操控靶基因的表达水平对于研究基因的功能十分重要。Gal4/UAS系统已被广泛应用于调控基因表达,可研究果蝇Drosophila等模式生物复杂的生物学问题。受采用载体的特性及插入位点的影响,Gal4或UAS转基因品系在构建好之后,其调控靶基因的能力基本是确定的。本研究旨在在现有Gal4/UAS系统的基础上,开发一种新的策略,实现在果蝇翅芽中灵活操控wingless(wg)基因的表达水平。【方法】用遗传学手段将黑腹果蝇Drosophila melanogaster品系的UAS-wg和UAS-wg-RNAi转基因重组到同一黑腹果蝇品系中。将该重组黑腹果蝇品系与dpp-Gal4黑腹果蝇品系杂交,同时驱动UAS-wg和UAS-wg-RNAi在果蝇幼虫翅芽中共表达。杂交子代幼虫分别放置在不同的温度(18, 25和30℃)下培养。将幼虫翅芽解剖并进行免疫组化染色,测量染色的荧光强度,分析翅芽中wg的表达水平。【结果】在低温(18℃)下,UAS-wg在基因表达调控中起主要作用,wg表现为超表达,但其超表达的效率可被UAS-wg-RNAi有效地削弱。相反,在高温(30℃)下,UAS-wg-RNAi起主导作用,wg的表达受到抑制。并且通过转换温度,可实现wg在翅芽发育的不同阶段在超表达和抑制之间相互转化,从而灵活地操控wg基因在翅芽中的表达水平。【结论】该方法可以灵活操控果蝇翅芽中wg基因的表达水平,对于调控转基因的表达有重要的意义。     

柑橘凤蝶蛹发声器的显微结构及防御作用(英文)

【目的】动物界存在多种用于对抗捕食者的防御机制。一些鳞翅目昆虫的蛹在受到机械刺激时会发出蠕动的声音。【方法】在扫描电镜下对柑橘凤蝶Papilio xuthus蛹的发声器形态特征进行观察,并使用Audacity软件对捕获的声音进行特征分析。【结果】柑橘凤蝶蛹在腹部第4-5节和第5-6节之间的节间膜上存在发声器,有规律地发出嘶嘶声。发声器由多层甲壳素构成的刮器和板组成,刮器和板上有 50~90个突起。当蛹的腹部被寄生蜂触角刺激30 s以上时,刮器和板会迅速相互摩擦,腹部反复摆动发出声音。蛹发出的声音是由一系列每2 000~3 000 ms发生3次的短脉冲组成的。频带很宽,主要分布在5~20kHz范围内。新鲜蛹和越冬蛹的活性不同,声强也不同。【结论】本研究首先描述了柑橘蝴蝶蛹发声器的结构,结果支持了一些蝴蝶蛹对寄生生物进化出一种特殊的防御机制(声学防御)的假说。此外,通过比较两种生境的柑橘凤蝶蛹的声波特征,我们提出了同一物种在不同地理区域可以产生方言的假说。 关键词:     

苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达

【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶（serine protease, SP）基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆苜蓿夜蛾幼虫中肠丝氨酸蛋白酶cDNA全序列,用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行表达。重组蛋白经纯化后,利用梯度透析法进行复性,以BApNA为底物,进行活性测定。【结果】克隆获得的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP（GenBank登录号：JX866720）,该基因全长880 bp,开放阅读框长762 bp,编码254个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.9 kDa和9.49。由HvSP推导的氨基酸与鳞翅目昆虫SP氨基酸序列的一致性在52%~95%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera SP（GenBank登录号：CAA72962）的氨基酸序列一致性最高,达95%。成功构建重组载体pET21b-HvSP进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。在Glycine-NaOH缓冲液中,当pH为10.0时,复性的重组蛋白活性达到最高,为35.74 U/mL。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得了一个新的丝氨酸蛋白酶基因,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性。该结果为进一步研究丝氨酸蛋白酶在鳞翅目昆虫体内的生理功能奠定了基础。     

A genetic system for rhesus monkey rhadinovirus: use of recombinant virus to quantitate antibody-mediated neutralization

Rhesus monkey rhadinovirus (RRV), a simian gamma-2 herpesvirus closely related to the Kaposi sarcoma-associated herpesvirus, replicates lytically in cultured rhesus monkey fibroblasts and establishes persistence in B cells. Overlapping cosmid clones were generated that encompass the entire 130-kilobase-pair genome of RRV strain 26-95, including the terminal repeat regions required for its replication. Cloned RRV that was produced by cotransfection of overlapping cosmids spanning the entire RRV26-95 genome replicated with growth kinetics and to titers similar to those of the parental, uncloned, wild-type RRV26-95. Expression cassettes for secreted-engineered alkaline phosphatase (SEAP) and green fluorescent protein (GFP) were inserted upstream of the R1 gene, and the cosmid-based system for RRV genome reconstitution was used to generate replication-competent, recombinant RRV that expressed either the SEAP or GFP reporter gene. Using the SEAP and GFP recombinant RRVs, assays were developed to monitor RRV infection, neutralization, and replication. Heat-inactivated sera from rhesus monkeys that were naturally or experimentally infected with RRV were assayed for their ability to neutralize RRV-SEAP and RRV-GFP infectivity using rhesus monkey fibroblasts. Sera from RRV-positive monkeys, but not RRV-negative monkeys, were consistently able to neutralize RRV infectivity when assayed by the production of SEAP activity or by the ability to express GFP. The neutralizing activity was present in the immunoglobulin fraction. Of the 17 rhesus monkeys tested, sera from rhesus monkey 26-95, i.e., the monkey that yielded the RRV 26-95 isolate, had the highest titer of neutralizing activity against RRV26-95. This cosmid-based genetic system and the reporter virus neutralization assay will facilitate study of the contribution of individual RRV glycoproteins to entry into different cell types, particularly fibroblasts and B cells.     

二斑叶螨不同抗性品系最佳内参基因的筛选及CYP392E亚家族基因的表达分析

【目的】 筛选二斑叶螨Tetranychus urticae敏感品系（SS）、 抗阿维菌素品系(Av-R)和抗螺虫乙酯品系（Sp-R）中合适的内参基因, 研究二斑叶螨不同抗性品系CYP392E亚家族基因表达水平的变化。【方法】采用实时荧光定量PCR （quantitative real time PCR, qRT-PCR）技术, 对二斑叶螨α-tubulin, β-actin, ELFn, GAPDH, 5.8S rRNA基因和SDHA共6个看家基因的表达稳定性进行分析以期筛选出合适的内参基因, 并在此基础上进一步分析二斑叶螨不同品系P450酶系CYP392E亚家族基因的表达量差异。【结果】在二斑叶螨SS, Av-R和Sp-R品系中稳定性最高的内参基因为ELFn。以ELFn为内参基因, CYP392E7基因相对表达量在二斑叶螨Av-R品系中显著高于SS品系(P<0.05), 为后者的2.18倍, 而在Sp-R品系和SS品系中差异不显著; 其余基因的相对表达量在2个抗性品系中均没有增加, Av-R品系的CYP392E4, CYP392E9和CYP392E10基因以及Sp-R品系的CYP392E1和CYP392E9基因相对表达量甚至显著下调, 分别为SS品系的48%, 74%, 65%, 63%和73%。【结论】在二斑叶螨SS, Av-R和Sp-R品系中ELFn为理想的内参基因, Av-R品系CYP392E4, CYP392E7, CYP392E9和CYP392E10基因相对表达量的显著变化可能与二斑叶螨对阿维菌素的抗性形成有关, Sp-R品系CYP392E1和CYP392E9基因也可能与二斑叶螨对螺虫乙酯的抗性形成有一定联系。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸-丁酯(解离常数Ki=14.6 μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2 μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9 μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。     

A new Trichoplusia ni cell line for membrane protein expression using a baculovirus expression vector system

A new cell line, MSU-TnT4 (TnT4), was established from Trichoplusia ni embryos for use with baculovirus expression vectors and evaluated for its potential for membrane protein production. To evaluate membrane protein synthesis, recombinant baculoviruses were constructed to express the human neurotensin receptor 1 as an enhanced green fluorescent protein (GFP) fusion. TnT4 cells had a doubling time of 21 h and expressed the membrane-GFP fusion protein at approximately twice the level as Sf21 cells from the p10 promoter, as evaluated by GFP intensity. Expression of secreted alkaline phosphatase (SEAP) was similar to that of Sf21 cells. Expression of membrane-GFP fusion proteins in recombinant baculoviruses provides a rapid method for evaluating the potential of new cell lines for the production of membrane proteins using a baculovirus expression vector system (BEVS).