棉铃虫转录因子c-Myc基因在滞育和非滞育蛹脑中的表达分析及多克隆抗体制备

【目的】c-Myc是近年来研究较多的转录因子,也是受Wnt/β-catenin信号通路调节的重要靶标。本研究旨在克隆棉铃虫 Helicoverpa armigera c-Myc基因,从核酸水平初步调查 c-myc 在滞育和非滞育蛹脑中的表达情况,同时制备其蛋白的多克隆抗体。【方法】通过RACE方法克隆棉铃虫 c-myc 基因的cDNA,运用RT-PCR方法比较滞育和非滞育蛹脑中Har-c-myc基因的表达情况。根据获取的序列构建原核表达载体,在大肠杆菌 Escherichia coli 中进行表达,纯化后免疫新西兰兔,制备了多克隆抗体。【结果】克隆了棉铃虫 c-myc 基因,核酸水平的研究表明滞育蛹脑中 c-myc 表达水平明显低于非滞育蛹脑。成功地在大肠杆菌中表达了c-Myc部分肽段并通过镍柱纯化获得了较纯的重组蛋白。制备的c-Myc抗体效价达到了1:125 000。【结论】滞育蛹脑中 Har-c-myc 的表达下调。获得了抗棉铃虫c-Myc的多克隆抗体。本研究的成果为后续进一步深入研究棉铃虫Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

棉铃虫Wnt-1基因克隆、多克隆抗体制备及在滞育和非滞育蛹脑中的表达检测

【目的】Wnt1蛋白是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员。本研究旨在克隆棉铃虫Helicoverpa armigera Wnt1基因,制备多克隆抗体,进而从蛋白水平初步研究该蛋白在滞育和非滞育蛹脑中的表达情况。【方法】通过RACE的方法克隆棉铃虫Wnt1基因。根据获取的序列构建Wnt1的真核表达载体并调查其亚细胞定位,同时构建原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达、纯化后免疫兔子,制备多克隆抗体。最后用Western blot的方法检测Wnt1蛋白在两种发育状态蛹脑中的表达情况。【结果】成功克隆了棉铃虫Wnt1基因(Gen Bank登录号为KJ206240)。Wnt1定位在细胞质,通过镍柱纯化获得了较纯的重组蛋白。制备的Wnt1抗体效价高达1∶625 000。Western blot结果表明滞育蛹脑中Wnt1蛋白水平明显低于非滞育蛹脑。【结论】获得了高效价的棉铃虫Wnt1多克隆抗体。我们的结果表明滞育蛹脑中Wnt/β-catenin通路很有可能受到抑制。本研究结果为进一步深入研究棉铃虫Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

棉铃虫β-catenin的多克隆抗体制备及在蛹脑中的表达研究

β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员。本研究构建β-catenin的原核表达载体,成功地在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达。镍柱纯化重组蛋白后免疫兔子,制备了抗棉铃虫β-catenin的多克隆抗体。ELISA和Western blot的方法检测抗体效价和抗体特异性,结果表明抗体的效价较高,特异性较好。最后应用该抗体调查了滞育和发育蛹脑中β-catenin的表达情况,从蛋白水平证实了发育蛹脑中β-catenin高于滞育蛹脑。本研究为后续研究棉铃虫β-catenin的功能以及Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

果蝇Hsp83多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备和鉴定抗Hsp83蛋白的多克隆抗体。方法利用PCR技术从果蝇cDNA中获得hsp83基因片段,构建重组质粒;将其转化到BL21(DE3)菌株中诱导蛋白表达,利用Ni-NTA亲和法纯化重组蛋白;再将纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体;利用免疫印迹法(Western blot)和免疫荧光染色法检测多克隆抗体的特异性。结果构建的pET28ahsp83质粒在大肠杆菌中成功表达了Hsp83融合蛋白,蛋白纯化后作为抗原免疫小鼠,获得了抗Hsp83的多克隆抗体。免疫印迹法和免疫荧光染色法检测显示,抗果蝇Hsp83多克隆抗体具有较高的特异性,并能检测出内源性Hsp83蛋白。果蝇卵巢免疫荧光染色显示,Hsp83蛋白定位在卵巢细胞的细胞质中。结论成功制备了小鼠抗Hsp83蛋白的特异性抗体,此工作为深入研究Hsp83蛋白的功能奠定了基础。     

棉铃虫类肌钙蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

利用蛋白免疫法制备鼠抗棉铃虫类肌钙蛋白(Helicoverpa armigera Calponin,Ha Cal)的多克隆抗体并进行初步应用。通过原核表达棉铃虫类肌钙蛋白,镍柱纯化获得目的蛋白,经足垫加皮下注射免疫小鼠,4次免疫后用ELISA检测法确定鼠抗Ha Cal蛋白多克隆抗体的效价。通过Western blot和免疫组化检测该多克隆抗体免疫特异性。蛋白免疫法制备的鼠抗Ha Cal多克隆抗体滴度高于1∶819 200。Western-blot和免疫组化显示该抗体能特异性识别棉铃虫体内的天然Ha Cal蛋白。利用蛋白免疫法制备获得了效价高且特异性强的鼠抗棉铃虫Ha Cal多克隆抗体,旨为进一步研究棉铃虫Ha Cal蛋白表达特性及其抗药性功能提供重要的实验工具。     

热激蛋白90与中红侧沟茧蜂的发育关系

根据热激蛋白90(the heat shock proteins90,Hsp90)基因序列的保守性,设计引物,采用PCR结合RACE扩增的方法克隆得到中红侧沟茧蜂Microplitis mediatorHaliday Hsp90cDNA全序列,并用半定量RT-PCR的方法研究Hsp90与中红侧沟茧蜂发育及滞育间的关系。结果表明,滞育条件和非滞育条件下,热激和冷激都能诱导Hsp90的表达;不论在滞育还是非滞育条件下,Hsp90表达量均在2龄初期最高,随发育时间的增加逐渐降低,成虫期表达量又显著升高;滞育褐茧在4℃保存初期,Hsp90呈现高表达且随保存时间的增加而降低。     

棉铃虫激活增强子结合蛋白AP-4基因的原核表达、多克隆抗体制备、表达谱分析及功能鉴定

【目的】激活增强子结合蛋白4(activating enhancer binding protein 4, AP-4)是近年来备受关注的一类功能广泛的转录因子,参与Wnt/β-catenin信号通路的调控。本研究旨在研究棉铃虫Helicoverpa armigera HaAP-4基因的原核表达并制备多克隆抗体,明确HaAP-4基因的时空表达谱,初步探究HaAP-4对棉铃虫胆固醇载体蛋白2(sterol carrier protein-2, SCP-2)基因(HaSCP-2)表达的调控作用。【方法】通过PCR扩增棉铃虫HaAP-4基因片段,将其克隆至pET-28a原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,经IPTG诱导表达,采用镍柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。运用RT-qPCR检测HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)以及5龄幼虫和预蛹不同组织(中肠、脂肪体、头和表皮)中的表达水平。设计并合成HaAP-4 siRNA,转染棉铃虫Ha细胞,通过RT-qPCR检测和分析使用HaAP-4 siRNA进行RNA干扰后Ha细胞中HaAP-4和HaSCP-2基因 mRNA的表达情况。【结果】成功构建pET-28a-HaAP-4重组表达质粒,在大肠杆菌细胞中获得高效表达的可溶性蛋白,目的蛋白大小约为55 kD,经纯化获得了纯度较高的重组蛋白,免疫新西兰兔成功制备了多克隆抗体,通过Western blotting检测显示抗体具有较好的特异性,ELISA分析表明抗体效价较高。发育阶段特异性表达结果显示,HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中在卵期、5龄幼虫期和预蛹期的表达量较高。组织表达结果表明,HaAP-4基因在5龄幼虫和预蛹不同组织中均有表达,且在中肠和头部具有高表达,而在表皮和脂肪体中表达量较低。RNA干扰实验发现,HaAP-4基因的敲降对HaSCP-2基因转录有显著影响,HaSCP-2基因mRNA表达水平下降了约55%。【结论】利用pET-28a原核表达系统能有效地在体外表达可溶性的HaAP-4,并制备了较好的多克隆抗体。RNAi实验结果提示,在中肠内高表达的HaAP-4基因能促进HaSCP-2基因的转录表达,在棉铃虫脂质生理代谢过程中发挥作用。本研究为进一步深入阐明棉铃虫HaAP-4的潜在功能打下了基础。     

中华蜜蜂热休克蛋白70的克隆、表达及中蜂囊状幼虫病毒感染后表达差异分析

[目的]本研究旨在明确中华蜜蜂Apis cerana cerana热休克蛋白70 (Heat shock protein 70,HSP70)与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的关系.[方法]首先根据NCBI上已公布的中华蜜蜂HSP70的全基因(NO.MH122655.1)序列,设计特异性引物,提取3日龄中华蜜蜂幼虫总RNA,通过RT-PCR方法获得HSP70基因,并通过生物信息学软件进行分析;其次将其克隆到原核表达载体pET-32a中,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达,并制备重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体;最后利用制备多克隆抗体作为一抗,通过Western-blot方法检测CSBV感染中华蜜蜂前后HSP70在幼虫体内的变化.[结果]成功获取中华蜜蜂HSP70蛋白的全基因,其核苷酸序列全长为1833 bp,生物信息学分析后,发现其编码蛋白存在7个抗原表位.利用原核表达系统,成功获得大小约87 ku的重组蛋白HSP70,免疫小鼠后获得多克隆抗体,经Western-blot分析能与标签蛋白发生特异性反应;对感染CSBV前后蜜蜂体内HSP70蛋白检测发现感染后HSP70表达水平显著提高.[结论]通过原核表达系统,成功表达中华蜜蜂HSP70基因和HSP70多克隆抗体,并证实CSBV感染后影响中华蜜蜂体内HSP70蛋白表达量的改变,为深入研究HSP70功能提供了帮助.     

植物热激蛋白70基因家族及其生物学功能研究进展

植物热激蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)是热激蛋白家族中保守、普遍表达的家族,有两个主要功能区:N端核酸结合区和C端底物结合区。通常Hsp70具有分子伴侣功能,参与新生蛋白的折叠、转运、重折叠变性蛋白、协助降解变性蛋白;Hsp70不仅受高温胁迫诱导,且受其它多种胁迫诱导;同时,Hsp70参与植物正常发育过程。Hsp70基因分布广泛,序列高度保守,在植物基因组中以基因家族形式存在,最近广泛用于遗传多样性和系统发育研究。文章对植物中Hsp70的基因家族、结构、表达调控机制和生物学功能进行了综述。     

白血病小鼠模型的建立与应用进展

白血病又被称为"血癌",其发病的根本特征是白血病细胞在骨髓及其他造血组织中呈恶性、无限制地增生,浸润全身各组织和脏器,产生不同症状,使患者易发生严重的感染或继发性的败血症、引起出血、肠功能衰竭、高尿酸血症等,严重威胁到患者的生命。因此白血病治疗的研究至关重要。利用实验动物进行各种疾病、药物疗效实验的研究,是医药领域发展的一个重要方面。对于白血病的研究,小鼠在生物学、遗传学、造血系统等方面与人类相似,因此是较为理想的动物白血病模型。本文对近五年来国内外研究常用的小鼠白血病模型进行综述。     

Hartley豚鼠耳朵成纤维细胞分离培养与鉴定分析

本文旨在建立快速获取豚鼠耳朵成纤维细胞的方法,为豚鼠体细胞重编程技术提供起始细胞。首先采用0.05%Trypsin-EDTA和Collagenase IV两种消化酶对脱毛后的耳朵组织碎块进行消化;然后对获取的细胞进行体外培养和形态学观察,支原体检测,Vimentin蛋白免疫荧光鉴定,测定细胞生长曲线计算细胞倍增时间;用绿色荧光蛋白的逆转录病毒感染后用流式细胞仪检测感染效率,核型鉴定检测病毒对核型的影响。分离的豚鼠耳朵成纤维细胞为贴壁生长细胞,消化后2~3h即大部分贴壁并基本完全伸展,细胞呈梭形或多角形,胞浆饱满,立体感强,细胞核清晰形态良好,支原体检测阴性。细胞表达成纤维细胞特异性蛋白Vimentin。生长曲线为S形,符合体外培养细胞正常生长增殖规律,细胞倍增时间为24.85h。逆转录病毒感染效率达75.6%,病毒感染后染色体2n=64的细胞占90%,遗传稳定核型正常。本研究提供的体细胞获取方法操作简单,效率高,获取的细胞状态良好,细胞增殖速度快,细胞感染率高,是一种非常合适的豚鼠耳朵成纤维细胞分离手段,为后续进一步研究豚鼠体细胞重编程提供了技术基础。     

铜胁迫对甘蔗生长及抗氧化酶活性的影响

甘蔗是重要的糖能兼用植物,同时也是潜在的重金属土壤修复植物。为了探明甘蔗对铜胁迫的生理响应,该研究采用营养液培养的方法分析了铜胁迫对甘蔗生长、叶片相对电导率、叶绿素含量及根系抗氧化酶活性等的影响。结果表明:甘蔗地上部分生物、叶绿素含量随铜浓度增加而下降,地上部分铜含量和叶片的相对电导率则随铜浓度增加而提高。根系的丙二醛(MDA)含量在胁迫24h开始发生显著的变化,在400μmol·L^-1铜处理下比对照显著增加了25.5%,随着胁迫时间的延长,丙二醛含量增加幅度上升。到胁迫72h,100μmol·L^-1铜处理的MDA含量也显著的提高。根系SOD、POD和CAT酶活性在胁迫24h开始发生显著的变化,但不同酶活性变化存在差异。SOD酶活性除了在胁迫的72h随铜浓度增加而提高,其他时间表现为在100μmol·L^-1铜处理下活性下降,随着铜浓度继续增加SOD酶活性提高,到400μmol·L^-1铜处理SOD酶活性又出现下降。POD酶活性在处理的24、48和72h表现为随浓度增加先提高后下降的趋势,但在处理7d时随铜浓度增加而提高。CAT酶活性随着浓度的升高和胁迫时间的延长而下降,到了胁迫的第7天,三个铜处理下CAT酶活性分别下降了89.98%、96.88%和98.50%。由此可见,铜胁迫严重影响甘蔗的生长,较短时间的处理就已经引起了甘蔗根系的氧化胁迫,根系中SOD、POD和CAT酶活性的变化在甘蔗对抗铜引起的氧化胁迫中起到重要作用。     

Spatial and temporal patterns of carbon storage from 1992 to 2002 in forest ecosystems in Guangdong, Southern China

Aims

The overall goal of this study was to examine the spatial and temporal patterns of C storage from 1992 to 2002 in forest ecosystems in Guangdong, China.

Methods

We used 2237, 2103, and 1978 plot data from three continuous forest inventory in 1992, 1997, and 2002, respectively, four TM images and one soil survey data in Guangdong to examine the spatial and temporal patterns of C storage in forest ecosystems during 1992–2002. The uncertainty analysis of forest C storage in Guangdong in 1992 and 2002 was also conducted to provide the range of estimations.

Results

The forest coverage percent in Guangdong increased from 37.1 % in 1992 to 57.2 % in 2002 while the total forest C storage in Guangdong increased from 144.73?±?6.20 Tg in 1992 to 215.03?±?8.48 Tg in 2002. The order of average forest biomass C storage increase during 1992–2002 among the four regions is Western Guangdong (GW)?>?Eastern Guangdong (GE)?>?the Pearl River Delta (PRE)?>?Northern Guangdong (GN). The factors including tree species and altitude and slope aspect can explain 58–67 % variation of Veg C storage multiple regression model in Guangdong. However, the multiple regression model for SOC storage can only explain about 18–39 % variation of SOC storage in Guangdong. Total ecosystem C is mainly determined by SOC storage.

Conclusions

The total forest C storage in Guangdong increased about 49 % from 1992 to 2002 partially due to the increasing forest coverage percent over the period. The spatial distribution of forest C storage in Guangdong was uneven and this pattern reflects differences in forest management and economic and social development. Future forest management should focus on the selection of tree species, management of forest stand structures and implementation of sustainable practices so that Veg C sequestration potentials can be maximized.     

光学相干层析术高分辨率活体成像泼尼松龙诱导的骨质疏松斑马鱼模型

本研究利用光学相干层析术OCT对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型进行活体成像,并结合电镜能谱技术定量分析斑马鱼模型骨质的钙磷元素含量及分布情况,共同探讨OCT方法在基于斑马鱼模型开展的骨质疏松研究中的使用价值。选取40条3月龄野生型斑马鱼暴露于50μmol/L泼尼松龙溶液和含0. 5%DMSO的溶液中(对照组),28. 5℃下培养,分别于第5、10、20天取出浸药组和对照组进行OCT活体成像,比较两者光散射特征。在每个时间点的成像之后,将浸药组的5条斑马鱼处死,然后取颅骨进行元素含量电镜扫描能谱分析。本研究利用50μmol/L泼尼松龙溶液培养斑马鱼至第20天,成功构建了斑马鱼骨质疏松模型。与对照组相比,模型组活体OCT成像显示骨组织光散射减弱,光子量明显减少,呈不均匀分布。能谱元素检查结果说明颅骨内所含钙、磷比例明显下降,证实骨质疏松发生,骨量减少。OCT成像方法在对斑马鱼骨质疏松模型进行活体、实时、无创等研究方面具有重要价值,本试验也为骨质疏松疾病的研究和药物筛选等方面提供了新的有效的方法。     

拟南芥肌醇半乳糖苷合成酶与棉子糖合成酶的体外催化活性比较

[目的]基因克隆及原核表达纯化后比较拟南芥的2个肌醇半乳糖苷合成酶及2个棉子糖合成酶的体外催化活性,为微生物法或酶法合成棉子糖尊定基础。[方法]RT-PCR克隆拟南芥的肌醇半乳糖苷合成酶(GolS1及GolS3)与棉子糖合成酶(RafS1及RafS5)的基因,分别构建原核表达菌株,诱导表达纯化获得酶,电泳检测及蛋白定量后进行体外酶催化反应,HPLC分析产物。[结果]克隆到GolS1与GolS3及RafS1与RafS5的基因,原核表纯化获得纯酶,以反应体系中目标产物生成速率衡量,GolS1与GolS3催化速率分别为0.51和0.28mmol/(mg·min),RafS1与RafS5的催化速率分别为0.45和0.21mmol/(mg·min)。[结论]拟南芥的肌醇半乳糖苷合成酶(GolS1及GolS3)与棉子糖合成酶(RafS1及RafS5)基因经异源表达后具有良好酶活,其中GolS1酶活是GolS3的1.82倍,RafS1酶活是RafS5的2.14倍。     

常见SPF级小鼠和大鼠肠道菌群多样性研究

目的研究常见SPF级小鼠和大鼠的肠道菌群多样性。方法分别采集广东地区三家实验动物生产单位的C57BL/6、ICR、BALB/c小鼠和Wistar、SD大鼠的盲肠内容物样品,用细菌16S rDNA通用引物扩增V4-V5区域,采用Illumina Miseq 2×300 bp测序平台进行测序,使用生物信息学方法进行微生物群落分析、Alpha多样性分析与Beta多样性分析。结果对序列去杂优化后OTU聚类分析,稀释性曲线说明本次测序的数据量合理;实验小鼠和大鼠肠道菌群共分成八个门,其中拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)占据主要地位,属水平上主要是拟杆菌属(Bacteroides)、Hungatella、副杆状菌属(Parabacteroides)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)等;样品间差异性分析显示相同设施来源动物的菌群组成相似性较高;Alpha分析结果显示来源于同种设施的动物物种丰富度相近;Beta分析显示相同设施动物的肠道菌群差异较小,但品系对肠道菌群差异性有所影响。结论不同来源设施的饲养环境是动物肠道菌群多样性的主要影响因素,不同品系对肠道菌群多样性有一定影响。     

星天牛寄主选择研究

为了明确华南地区星天牛主要寄主植物种类,本文筛选了21种有代表性的植物,对星天牛进行了室内、室外寄主选择试验。结果表明,星天牛在不同植物上的取食量和刻槽数量差异极显著,偏好在砂糖橘、苦楝、金桔和柠檬上取食,在砂糖橘、柠檬、金桔和小叶紫薇上刻槽产卵,取食对象和刻槽产卵对象不一致。研究证实,星天牛能在华南地区砂糖橘、玫瑰和柠檬三种植物上完成生活史,是星天牛的寄主植物。     

广东土壤有机碳储量及空间分布特征

根据广东省第2次土壤普查资料,采用GIS技术估算广东省土壤有机碳储量及空问分布规律,结果表明,广东省陆地土壤有机碳储量约为17．52×10^8t．砖红壤、红壤和赤红壤的土壤有机碳密度分别为8．83、10．31和9．15kg·m^-2,略低于全国的平均水平,三者占广东省土壤面积的67．91％;广东省黄壤和水稻土的有机碳密度分别为12．08和12．17kg·m^-2,高于全国平均水平;广东省平均土壤碳密度为10．44kg·m^-2．土壤有机碳密度总的分布规律是东南沿海地区高于粤北山区,其中粤北和粤中土壤有机碳密度为5～10kg·m^-2,粤东的沿海地区土壤有机碳密度为10～15kg·m^-2,二者合计占全省土壤面积的89．24％;土壤有机碳密度主要在5～15kg·m^-2范围内变动．     

褐飞虱应对水稻抗虫物质麦黄酮刺激的唾液蛋白组学响应

为研究褐飞虱响应麦黄酮刺激的分子机理,应用差异蛋白质组学方法分析褐飞虱唾液腺响应麦黄酮刺激处理的蛋白质组变化趋势。结果表明,麦黄酮处理褐飞虱6 h差异蛋白数量90个,其中上调蛋白62个,下调蛋白28个;处理褐飞虱24 h差异蛋白数量27个,其中上调蛋白10个,下调蛋白17个,6 h的差异蛋白数量显著大于24 h。麦黄酮处理可以引起褐飞虱唾液腺丝氨酸蛋白酶及其同系物产生显著变化。通过对差异蛋白进行GO功能分析和KEGG通路分析,发现麦黄酮处理褐飞虱引起褐飞虱唾液腺蛋白变化主要集中在应激蛋白和代谢这两大类上,分别占了所有差异蛋白的50%以上,麦黄酮处理引起褐飞虱唾液响应蛋白主要参与了氨基酸代谢、唾液分泌系统、能量代谢、碳水化合物代谢等通路。