圈卷产色链霉菌lon基因的克隆及酶切分析

圈卷产色链霉菌是从我国东北土壤中筛选的一株Nkkomycin产生菌。在固体基本培养基上具有典型的链霉菌发育分化特征。经诱变得到不产孢子的白色突变株和不能形成气生菌丝的光秃型突变株。部分白色突变株和全部光秃型突变株在形态分化受阻的同时,也失去了产生Nikkomycin的能力。表明在圈卷产色链霉菌中,参与形态分化的基因与抗生素生物合成基因可能密切相关。     

天蓝色链霉菌孢子形成的关键基因——whiG的诱导表达

与链霉菌分化有关的whiG结构基因已亚克隆到链霉菌表达载体pAK203的tipA启动子下游.该启动子能被硫链丝菌素诱导.whiG基因的诱导表达不仅可使天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71恢复产生孢子的能力,而且也能使天蓝色链霉菌野生型菌株J1501和变铅青链霉菌TK54的孢子形成更为丰满.Western杂交也进一步证实了诱导表达后whiG基因产物——σ~(whiG)产量的增加.这为依赖于σ~(whiG)RNA多聚酶的发育调控启动子体外转录的研究提供了有利条件.     

抗生素和干扰素

924355能产生曲张链菌素复合物的链霉菌种〔英万Vesse-linova,N.…了Folia Mierobiol一1901,56 (6)。一535~541〔译自DBA,1992,11犷11),92一06133〕 研究了链霉菌菌株1000的形态学、培养和生理生化特性及其抗生素的产生。在菌丝体和培养滤液中均产生抗生素一1011和一1012,4天后抗生素的生物合成达最大值(4 109/1)。菌株1。。o的变种1011能产生10oomg/1抗生素一1021,将之与亲本菌株10。。的生产水平(41mg/l)进行比较。经鉴定抗生素一1011为曲张链菌素。在相同培养条件下,2株链霉菌的产物组分有不同。菌株100。和壮观链霉菌(5.。户ec‘ab￡…     

固氮作用

881112固氮兰藻突变株对氨基酸的光合成[英〕/Ker})y,N.W.…了Appl.Mierobiol.B ioteChnol一1987,25(6)一5寸7一552〔译自CBA,1987,(6),2626〕 已分离到对6一氟色氨酸或乙硫氨酸具抗性的固氮兰藻多变鱼腥藻(A淞6ae邢姐r‘a-bilis)突变株。这种藻的许多株系在无6-氟色氨酸或乙硫氨酸时,能将氨基酸释放人培养基中。突变株的固氮酶活性高于其亲本。_将突变株周定于藻酸钙上,可持续光形成氨基酸。(戴顺志)88飞飞1巴花生根瘤菌NC92菌株共生突变株的分离和鉴定:结瘤与固氮寄主专一性缺失、突变株〔英〕Wilson,K.J.…了J.B“cte-r 1 01一工…     

圈卷产色链霉菌san7324和san7324L基因阻断对形态分化和尼可霉素产生的影响

【目的】圈卷产色链霉菌全局性调控基因wblA阻断突变后,尼可霉素不再产生。RNA-seq和转录分析表明san7324基因在野生型菌株中可以正常转录,而在wblA阻断突变株(ΔwblA)中不能转录,为此本文旨在揭示san7324与尼可霉素产生的关系。【方法】利用同源双交换策略对san7324进行基因阻断,而后通过基因遗传回补及对尼可霉素生物合成相关基因的转录分析等方法研究san7324的功能。【结果】在相同培养条件下,阻断突变株Δsan7324与野生型菌株相比失去了合成尼可霉素的能力。我们通过同源比对发现圈卷产色链霉菌中还存在一个与san7324同源的基因san7324L,该基因的阻断导致尼可霉素产量降低。当san7324和san7324L两个基因同时被阻断后,得到的突变株Δsan7324-san7324L生长稀疏而且不能正常发育分化形成灰色表型的孢子或孢子链,只能形成白色表型的气生菌丝,同时也丧失了合成尼可霉素的能力。当这两个基因(san7324-san7324L)回补双突变株后,则恢复了野生型的表型(能形成孢子链并恢复尼可霉素的产生)。进一步的研究初步表明san7324和san7324L的阻断主要影响了尼可霉素生物合成基因簇中途径特异性调控基因sanG的转录水平,从而影响圈卷产色链霉菌的发育分化和尼可霉素的产生。【结论】该结果为链霉菌形态分化与生理代谢关系的研究提供了更多的证据,同时为多效调控基因wblA作用机制的阐明奠定了基础。     

圈卷产色链霉菌分化基因sawB的结构与功能

以Sau3AI部分酶切野生型圈卷产色链霉菌7100(Streptomyces ansochromogenes 7100)染色体DNA,回收3～6 kb的DNA片段,插入到链霉菌表达载体pIJ702的BglⅡ位点,转化圈卷产色链霉菌白色突变株W19,得到了近3 000个转化子,从中筛选到了两个具有硫链丝菌素抗性和野生型灰色表型的转化子.进行了质粒提取和酶切分析,两个重组质粒分别命名为pNL-1和pNL-2(分别含有约5.2和5.8 kb的外源片段).通过亚克隆及突变株互补实验,将互补W19的基因定位在了1.25 kb的Pst Ⅰ-Apa Ⅰ片段上.DNA序列分析结果表明,该DNA片段中含有一个完整的可读框(ORF1),编码一个由295个氨基酸组成的蛋白质,该基因命名为sawB.利用Blast程序在蛋白数据库中比较发现,SawB与天蓝色链霉菌的一个转录调控蛋白WhiH具有81%的一致性.利用基因破坏策略研究了sawB的功能,结果发现,野生型菌株的sawB基因破坏后,丧失了孢子形成能力,由灰色表型转变为白色表型.显微镜下观察sawB突变株的气生菌丝长而直,顶部略有波浪形卷曲,螺旋程度有所下降.由此可知,sawB是与圈卷产色链霉菌形态分化有关的一个重要基因,它与菌丝螺旋及孢子形成直接相关.sawB的异源表达分析表明,sawB可互补天蓝色链霉菌whiH突变株C119,使之恢复到野生型表型,产生紧密螺旋及丰富的灰色孢子.     

产去甲基金霉素突变株的选育II．金霉素链霉菌635突变株的选育

金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)38-2-14突变株叫,用紫外线处理和紫外线及异氰酸苯酯复合处理,以菌落产生赤褐色色素,作为挑选高产去甲基金霉素和去甲基四环素突变株的指标,选出金霉素链霉菌635突变株。在改变种子养培基成份的基础上,缩短了母瓶种子培养时间,去甲基金霉素和去甲基四环素的摇瓶单位达2925徽克／毫升,为今后工业生产创造了条件。     

圈卷产色链霉菌分化相关基因——saw1的结构和功能

用双脱氧链终止法进行了分化基因——saw1的双链测序.结果表明在1500bp的DNA片段中有一个完整的开读框架(ORF),其编码区是在419bp至1252bp处.其产物与已知的天蓝色链霉菌whiG的氨基酸序列有89%的同源性.当把1500bp的saw1DNA片段插入到链霉菌表达质粒载体pIJ702后,构建的重组质粒转化天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71,可使C71形成孢子和灰色色素.用基因破坏的策略进一步研究了该基因的生物学功能,结果表明saw1在圈卷产色链霉菌气生菌丝到孢子形成的发育转变中有重要作用,是分化中控制孢子发育起始的一个重要基因.     

从金霉素链霉菌38选育产去甲基金霉素的突变株

用紫外线和乙烯亚胺处理四环素生产菌株金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)38的孢子,从棕红色的突变菌落中得到三株突变株：金霉素链霉菌38—2、38—14和38—42。在沉没培养条件下,于产生金霉素的同时,它们都能产生一定量的去甲基金霉素。该菌株经诱变因子处理后,能提高棕红色变异菌落的出现率。本实验的结果表明用紫外线照射,棕红色突变菌落的出现率比用乙烯亚胺处理的显著提高。     

一个枯草杆菌启动子(P_(28-1))对链霉菌分化的影响

亚克隆1.1kb的枯草杆菌启动子P_(28-1)到pUC19上,再亚克隆到以儿茶酚加氧酶为报告基因的链霉菌启动子探测质粒pIJ4083上,构建的重组质粒命名为pIJ4498.用pIJ4498转化天蓝色链霉菌J1501的原生质体,得到了相对于灰色野生型的白色转化子,而用载体pIJ4083转化J1501后得到的转化子是正常的深灰色菌落.经限制性内切酶验证了重组质粒的结构,测定了质粒的稳定性.当pIJ4498转化天蓝色链霉菌的WhiG突变株(C71)后,未观察到任何表型的变化.通过超声波破碎细胞得到的J1501/pIJ4498菌体的蛋白提取液,可使无色的儿茶酚氧化成黄色的2-羟粘糠酸半醛(HMS).而对照株J1501/pIJ4083及C71/pIJ4498菌株的蛋白提取液不能使儿茶酚氧化成黄色的HMS产物.结果表明枯草杆菌的启动子P_(28-1)被天蓝色链霉菌J1501的σ~(whiG) RNA聚合酶所识别,在启动儿茶酚加氧酶报告基因表达的同时,影响了天蓝色链霉菌J1501分化中的孢子形成.     

基因标记、转化、表达与检测

931207丫0 Iypoeladium inflatum,ubsp.bla,tosporum菌株的原生质体特征[俄]/Sotnikova,1.v.…J Antibiot.Khimioter一2992,37(2)。-6~11[译自DBA,一992,11(20),。2一11139〕 将菌株招(原有菌株)及菌株84了(高活性突变株)培养于含葡萄糖和酵母裂解物的培养基中。在此培养基中,菌株847形成酵母菌状。菌株43菌丝体经二硫苏糖醉预处理及Hol沁”二at‘a复合酶处理1 .5~2小时,获得原生质体。菌株847不需要二硫苏馆醉预处理,但需要H.,。协川‘a复合酶,Driselase(来自Ir,e劣lao‘e移。)和几丁质酶(来自灰色链霉菌)的混合液处理18小时。电子显…     

一个枯草杆菌启动子(P_(28-1))对链霉菌分化的影响

亚克隆1.1kb的枯草杆菌启动子P_(28-1)到pUC19上,再亚克隆到以儿茶酚加氧酶为报告基因的链霉菌启动子探测质粒pIJ4083上,构建的重组质粒命名为pIJ4498.用pIJ4498转化天蓝色链霉菌J1501的原生质体,得到了相对于灰色野生型的白色转化子,而用载体pIJ4083转化J1501后得到的转化子是正常的深灰色菌落.经限制性内切酶验证了重组质粒的结构,测定了质粒的稳定性.当pIJ4498转化天蓝色链霉菌的WhiG突变株(C71)后,未观察到任何表型的变化.通过超声波破碎细胞得到的J1501/pIJ4498菌体的蛋白提取液,可使无色的儿茶酚氧化成黄色的2-羟粘糠酸半醛(HMS).而对照株J1501/pIJ4083及C71/pIJ4498菌株的蛋白提取液不能使儿茶酚氧化成黄色的HMS产物.结果表明枯草杆菌的启动子P_(28-1)被天蓝色链霉菌J1501的σ^(whiG) RNA聚合酶所识别,在启动儿茶酚加氧酶报告基因表达的同时,影响了天蓝色链霉菌J1501分化中的孢子形成.     

其因诱变、重组、克隆

931176应用电侧联仅砚辅助显徽术检测土雄中的单个遗传工程菌〔英]/Sileoek,D.J.…广Appl.Env-iron。Mierobiol。一1992,55(s)。一2444~2魂‘s〔译自DBA,1902,11(20),。2一11141〕 将铜绿假单胞菌噬菌体phi一PL527的HCM启动子(来自质拉pQF26一HcM)连接到启动子探测载体质拉pQF70上。pQF70含有哈维弧菌(V云-br‘0 ha,公。夕落)的荧光酶lux AB基因。转化大肠杆菌JM83,挑选出那些能从n一癸醛产光的阳性转化株。从转化株中纯化出质粒pGF7。/44,用于转化丁香假单胞菌菜豆色栽培种。通过紫外光下荧光法鉴定出转化子,也可以在培养皿翻…     

农业其它

921944通过胚珠胚培并获得的属间杂种生产形态学和细胞遗传学〔英〕/Ahmad,F.”·了Theor.Appl.Genet一1991,51(6)一533~539〔译自DBA,1991,10(22),91一13002〕 将小麦(全r￡‘云c“仍a召t云。祝哪)ev.Fukuho与无融合生殖种E乙鲜饥。。scab,。s(syn.A夕ro夕-一83一歹,00 scab,。州)(Zn=6x=42)DZss3、D 2911、J6Cioi和J6Cios。杂交生产属间杂种。17。,朵,l’麦小花授粉,将4组杂交获得的1739个可能的受精胚珠离体培养。由此产生了9个(0 .52%)小型的、发育不良的、无结构胚,所有这些均来自授粉亲本J6Clo59。5个胚直接萌发形成5株小植…     

抗生素和干扰素

920494氮素同化作用对调节抗生素生产的影响〔俄〕/Chi-peva,V.…产Antibiot.Khimioter一1991,36(3)一5~s〔译自DBA,1992,20(22),91-06742〕 研究了在发酵吸水链霉菌(尽加。川。。,。e。甸卯os““州“哪)生产抗生素期间,氮素同化作用途径中酶的活力,这些酶包括谷氨酸脱氢酶(GD-H)、谷氨酞胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(G-OGAT)和丙氨酸脱氢酶(ADH)。将吸水链霉菌155置于含各种N源的培养基(2 09/1葡萄糖、3 .59/IKH:PO‘、0.69/IMgSO‘·了H:O和zml微量元素溶液)中,于28℃、240印m搅拌下培养。没有观察到GDH活性,高浓度的钱和丙氨…     

医药上的应用

抗生素和干扰素931958在始旋链,菌中诱导产生原始.案〔英万Paquet,V.…/Bioteehnol.Lett一1992,14(11)。-1065~1070〔译自DBA,1903,12(i),。3-00090] 利用若干内酩检测了始旋链霉菌非生产突变株 (C16/4)和高产突几变株(Prn)中原始霉素 (PM)生产的调节作用。将Prn置于含复合培养基(pHe.s)的21发酵罐内,于27℃、450~1000rpm搅拌和41/min通气条件下培养。再于含合成培养基的201发酵罐内搅拌(5。。印m)培养Prll (pH6.s、27℃、通气51/min),以生产诱导因子。温育48小时后PM产生达最大。具长侧链的内醋(0 .25产g/ml诱导浓度)均对PM生产有…     

抗生素和干扰素

921721土.素生物合成途径基因的遗传操作〔会,英〕//Butler,M.J.…了Dev。Ind.Mierobiol。-1990,31一41~50〔译自DBA,1991,10(21),91一12139」 一种基因能在掩裂链霉菌(战,“,to,缪“es州哪。s,s)的土霉素生物合成途径中编码末端生物合成酶,利用逆向遗传方法证实了该基因位于早期途径的相同基因簇中。随后又证实了所有生物合成途径基因均位于染色体DNAI片段中,并赋予转化菌株产生土霉素的能力,该染色体DNA也可在其它链霉菌中表达。一种尝试是通过提高这些生物合成基因的剂量来提高土霉素的产量。上述方法需了解控制生物合成基因表达…     

医药其它

922175用皿组变铅青链霉菌生产可溶性CO4衍生物的发酵过程〔会,英〕/Gerber, R.G.“·了Abst:.Pap.Am。Chem.Soe。一1091,202 Meet.,Pt.1。一BIOTs6〔译自pBA,1991,10(23),,1-13493〕 研究了利用重组变铅青链霉菌(S汁即切饥夕-cesl‘”“aos)生产可溶性CD4(sCD4)衍生物。在一个10升规模的发酵罐里,改进发酵过程使胞外产物累积量比初始摇瓶里产生的增加10倍。此发酵过程的优化主要是研究pH、溶解氧浓度,培养基组成对胞外产物累积及其稳定性的影响。培养基研究揭示,在培养基里加入一种蛋白水解物可提高产物的累积,缺少葡萄糖降低了…     

食品上的应用

921561谷氮酸棒杆菌产赖氮酸报乙酸敏感突变株对葡萄箱的利用〔英〕/Costa一Ferreira,M.…/Appl.B ioehem.Bioteehnol一1992,27(3)一251~257〔译自DBA,1991,10(18),91一10571〕 在用亚硝基脏诱变后,由谷氨酸棒杆菌(C。-,梦介ebaete,‘”m 91”￡a仍‘c”仍)ATCC 21513分离出氟乙酸敏感突变株。突变株和亲株在含1009/I葡萄糖一水合物、0.了g/1 KH:PO‘、49/1 KZHP-O‘·3H:O、0 .39/1 MgSO‘·7H:O、连09/l (NH‘):50‘、209/l胰蛋白酶、209/l碳酸钙、smg/1硫胺素和60那g/l生物素的培养基中(PH7.0)于50℃摇瓶(220rpm)培养48hr…     

天蓝色链霉菌中长链3-酮脂酰ACP合成酶的功能

【背景】链霉菌属于放线菌科,在土壤环境中广泛分布。链霉菌具有复杂的形态分化和多样性的次生代谢网络,能产生大量具有生物活性的次级代谢产物,被广泛深入研究。【目的】天蓝色链霉菌是链霉菌的模式菌株,其脂肪酸合成代谢与次级代谢联系紧密,但目前脂肪酸合成代谢途径还不清楚,其长链3-酮脂酰ACP合成酶还未见报道。【方法】利用大肠杆菌FabF序列进行同源比对,发现天蓝色链霉菌A3(2)的基因组中,SCO2390(ScoFabF1)、SCO1266(ScoFabF2)、SCO0548(ScoFabF3)和SCO5886 (ScoRedR)具有较高的相似性,并具有保守的Cys-His-His催化活性中心,可能具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性。采用PCR扩增方法分别获得以上基因,连入表达载体pBAD24M后分别互补大肠杆菌fabB(ts)突变株和fabB(ts)fabF双突变株,并检测转化子的生长情况。以上基因与pET-28b连接后,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并利用Ni-NTA纯化获得蛋白,体外测定其催化活性。将以上基因分别互补大肠杆菌fabF突变株后,GC-MS测定互补株的脂肪酸组成。【结果】4个同源基因中,只有ScofabF1能恢复fabB(ts)fabF双突变株42°C时在添加油酸条件下的生长,其他3个基因均不能恢复生长。而这4个基因都不能恢复fabB(ts)突变株42°C时生长。体外活性测定ScoFabF1具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性,其他3个蛋白都不具有该活性。仅ScofabF1能显著提高大肠杆菌fabF突变株的顺-11-十八碳烯酸(C18:1)比例,其他3个基因都不具有该功能。【结论】天蓝色链霉菌中ScofabF1编码长链3-酮脂酰ACP合成酶II,在脂肪酸利用过程中发挥重要作用。天蓝色链霉菌中没有发现编码长链3-酮脂酰ACP合成酶I的基因,其可能通过其他途径合成少量的不饱和脂肪酸。以上研究结果为进一步研究天蓝色链霉菌中脂肪酸合成机制奠定了基础。