聚β-羟基丁酸酯解聚酶相关性质的研究

从不同环境和地域的活性污染泥中分离筛选出3种可降解聚β－羟基丁酸酯（PHB）的菌株,编号分别为DS9701、DS9710和DS9713。对其所产生的PHB解聚酶的相关性质进行了研究。3种菌株产所产生的PHB解聚酶均是胞外酶,同时又都是诱导酶。不同蓖株分泌PHB解聚酶的规律不同,但酶活力达到高的时间均为96h。3种粗酶液的表观最适反应温度为40℃－45℃,对粗酶液的最适反应pH也进行了表征。     

紫外线诱变选育高产PHB解聚酶的菌株*

以降解聚-β羟基丁酸酯(PHB)的青霉(Penicilliumsp.)DS9713a为出发菌株,通过紫外线(UV)诱变分生孢子,采用透明圈初筛和摇瓶复筛,获得酶活高于原始菌株的突变株5株,其中DS9713a-CS01突变株的PHB解聚酶活力高于对照97.42%,并对其酶学性质进行了初步研究。     

聚3-羟基丁酸酯（PHB）生物降解过程的研究

利用DS9701菌株对聚3-羟基丁酸酯(PHB)膜进行降解,对降解到不同程度的PHB膜采用扫描电子显微镜观察其表面形态结构的变化,并对其降解产物进行分析测定.结果表明,PHB的生物降解首先发生在PHB表面的非晶部分,随后结晶部分开始降解,并且降解首先发生在球晶的中心部分.DS9701菌株所产生的PHB解聚酶主要降解PHB的第二个酯键,降解产物为二聚体.     

木霉GXC产β-葡聚糖酶条件和酶学性质

研究了木霉GXC产 β 葡聚糖酶的条件。结果表明 ,最适产酶碳源为麸皮 ,氮源为硫酸铵 ;产酶的最适条件为 :初始pH为 4 0～ 5 0 ,30℃培养 44h。粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG 2 5、SephadexG 1 0 0和DEAE SephadexA 50柱层析得到纯β 葡聚糖酶 ,SDS PAGE凝胶电泳显示一条带 ,测得分子量为 35kD。该酶最适反应pH5 0 ,最适反应温度为 60℃ ,在 40℃以下、pH4 0～ 5 0酶活力相对稳定。 5 0mmol L以下的Ca²⁺、Zn²⁺和Fe²⁺,以及 1 0 0mmol L以下的Co²⁺对酶活力有激活作用 ;而Cu²⁺和Fe³⁺具有抑制作用。     

紫外线诱变选育高产PHB解聚酶的菌株

以降解聚-β羟基丁酸酯(PHB)的青霉(Penieillium sp．)DS9713a为出发菌株,通过紫外线(UV)诱变分生孢子,采用透明圈初筛和摇瓶复筛,获得酶活高于原始菌株的突变株5株,其中DS9713a-CS01突变株的PHB解聚酶活力高于对照97．42％,并对其酶学性质进行了初步研究。     

氮源流加对Alcaligenes eutrophus积累聚β-羟基丁酸的影响

以真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)为 聚β羟基丁酸(PHB)的生产菌株,在分析了PHB发酵过程参数变化的基础上,进一步探讨了PHB合成期不同的硫酸铵流加速率对PHB合成的影响。研究结果表明,在PHB合成阶段,培养基中氮源的完全缺乏,导致细胞合成PHB能力的下降;在PHB合成期,不同的氮源流加速率对PHB合成过程存在着显著的影响,当流加速率较小时,尽管最终胞内PHB含量很高,但细胞干重、PHB浓度和PHB生产强度都较低。当氮源流加速率过大时,会导致最终胞内PHB含量显著下降,使PHB浓度和PHB生产强度降低。当硫酸铵流加速率在05g/h左右时,可以得到较好的发酵效果。     

原生质体融合技术选育耐热性β-淀粉酶产生菌

从土壤中分离到两株产β-淀粉酶芽孢杆菌菌株,经紫外线、丫-射线,氯化锂、亚硝基胍等诱变和筛选,得到β-淀粉酶高产菌和耐热性β-淀粉酶产生菌各一株。将两菌进行原生质体融合,获得兼有两亲株遗传特性的融合子wg6。从菌落形态和产酶特性等证实此融合子系两亲株融台所得的杂交子代。W96菌株产酶能力介于两亲株之间,酶的热稳定性较高,60℃处理15min,酶活力仍达93．2％。此菌株还可产生少量茁霉多糖酶(一种支链淀粉酶)．与所产生的β-淀粉酶协同作用,使淀粉水解率达到80．6％,因而有较高的应用价值。     

海枣曲霉β-葡萄糖苷酶的提纯与性质

通过聚乙二醇6000一磷酸钾缓冲液双相分离,Sephadex G—100凝胶过滤、DEAE-Sephadcx A-50及SE-Se phadex C-50离子交换柱层析等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspe rgillutphoenlcis)麦麸培养物抽提液中提纯到凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。该酶的最适pH5．0,最适温度60℃,在pH 4．0--7．5之间及55℃以下稳定。Ag+及Hg2+对该酶有强烈的抑制作用。用SDS-凝胶电泳法及梯度凝胶电泳法测得该酶均分子量分别为118000及195000薄层凝胶等电聚焦法测得其等电点为pH 3.95。     

产低温脂肪酶菌株Psychrobacter sp.7342的筛选及粗酶性质研究

从南北极环境土样中筛选到1株产脂肪酶细菌7342,16SrDNA序列分析表明该菌株属于Psychrobacter sp..p-NPP法研究显示,菌株7342所产粗酶液的最适温度为30℃、最适pH值为8.0,对热较稳定;Co2+和Cs+对粗酶液有激活作用,而Na+、Sr2+等7种金属离子对其均有不同程度的抑制作用;粗酶液能在高浓度的SDS、Tween20等变性剂中表现出较好的稳定性.     

枯草芽孢杆菌中性内切β-甘露聚糖酶的纯化及性质

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BM9602产生的中性内切β甘露聚糖酶(endoβ1,4Dmannan mannanohydrolase,EC,3.2.1.78)经硫酸铵分级沉淀、DEAE纤维素(DE22)离子交换柱层析,得到电泳纯的样品,提纯了455倍,收率为59%。用SDSPAGE测得该酶的分子量为35kD。用PAGEIEF测得其等电点pI为45。酶反应的最适pH为5.8,最适温度为50℃。该酶在pH60～80,50℃以下稳定。金属离子Hg2+和Ag+对酶活性强烈抑制。酶对槐豆胶、羟丙基瓜胶、田菁胶和魔芋粉的Km值分别为38、149、113和24mg/mL,Vmax值分别为245、865、384和198μmol.min-1mg-1。酶水解甘露聚糖为甘露寡糖(不含单糖)。     

地衣芽孢杆菌β－甘露聚糖酶的纯化及酶学性质

地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＫ－２７菌株发酵产生的β－甘露聚糖酶（β－ｍａｎｎａｎａｓｅ）经硫酸铵盐析沉淀,两次ＤＥＡＥ纤维素和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００离子交换柱层析以及制备ＰＡＧＥ筹步骤,获得了凝胶电泳均一的样品。用ＳＤＳ－凝胶电泳测得纯化后的β－甘露聚糖酶分子量为２６ｋＤ,用凝胶聚焦电泳测得等电点ＰＩ为５．０。酶反应的最适ｐＨ为９．０,最后温度为６０℃,稳定ｐＨ为６．０—９．０,稳定温度为４０℃。金     

利用基因工程菌VG1(pTU14)产聚β-羟基丁酸酯的研究

本文对透明颤菌血红蛋白基因(vgb)和λ噬菌体裂解基 因(SＲＲz)在不同宿主大肠杆菌中的外源表达及其在聚β羟基丁酸酯(PHB)生产中的应用进行了研究。实验结果表明,同时携带vgb、SＲＲz和phbCAB三种基因的产PHB基因工程菌VG1(pTU14),经过82h的摇瓶补料分批培养,菌体浓度可以高达25.9g/L,PHB百分含量则可在52h时达到95%以上;此外,该菌株不仅可以实现摇瓶高密度发 酵培养和PHB产品的大量积累,还可以同时实现菌体细胞的可诱导裂解破壁,因此是一株具有潜在工业应用价值的多功能PHB生产菌株。     

极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究*

从深海的 3 8份水样和泥样中筛选到一株产蛋白酶的菌株DY A ,其最适生长温度为1 0℃ ,能适应较大范围的pH值和盐度。此菌株只在酵母膏存在的情况下产酶 ,不利用单一氮源 ,最适产酶条件为 :pH1 0 0 ,1 0℃ ,接种量 0 5 % ,2 0 0r/min摇床培养 48～ 72h。粗酶液的最适作用温度为 40℃ ,最适pH值为 1 0 ,在pH9～ 1 2内稳定 ,是一碱性蛋白酶。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β一半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GALl的穿梭表达质粒pYES2中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4-3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β一半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β一半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4-3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β一半乳糖苷酶在pep4-3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

枯草芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因(bglS) 在酵母菌中的克隆与表达

将大肠杆菌质粒pFG1中含枯草芽胞杆菌卢β-1,3—1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的2.7kb EcoRI片段克隆到大肠杆菌,酵母菌穿梭质粒上组建成杂种质粒YCSH,转化S.cerevisiae并得到表达。两种不同方向的插入子(YCSH 1和YCSH 5)在酵母菌中表达出的β-1,3-1,4葡聚糖酶活性相差2．3倍。根据酶作用底物专一性测定和酶反应的最适pH分析表明：YCSH中bglS基因产物与出发菌株B．Subtilis 1．88的基本酶学特性完全相同,但YCSH中bglS基因在酶母中的表达水平远比大肠杆菌中低     

一株霉菌产木聚糖酶固态发酵培养基的优化及酶学性质研究

对一株霉菌B45固态发酵产木聚糖酶的培养基组分进行优化,通过单因素实验观察了不同碳源、氮源、无机盐、水料比4种因素对产木聚糖酶的影响,确定了4种最佳的单因素成分。在单因素的基础上,再通过正交实验确定了所试因素的最佳组合,并对其粗酶的酶学性质进行了研究。结果表明,在培养基组分为玉米芯与麸皮的比例=7∶3,硫酸铵为1.5%,KH2PO4为0.8%,水料比为2.1∶1时,得到的酶活力最高,产酶量可达1 079.93 U/g。其粗酶液的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5,在pH5～pH6的范围内酶活性较稳定。但粗酶液的热稳定较差,在40℃条件下酶活力开始下降,当温度升至70℃时酶活力损失85%以上。     

荷叶离褶伞高产漆酶菌株选育及其漆酶酶学特性

应用原生质体紫外诱变,对一株产漆酶荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)菌株紫外诱变,用愈创木酚马铃薯葡萄糖固体平板变色法初筛,然后用ABTS[2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]测定漆酶活性进行复筛,获得1株漆酶高产诱变菌株HY1022-01;对HY1022-01所产漆酶粗酶液酶学特性进行研究,结果表明,HY1022-01所产漆酶最大酶活力比出发菌株提高30.32%,最适条件下酶活达991.67 U/mL,且产酶稳定;HY1022-1所产漆酶最适作用温度为35℃,在30~35℃较为稳定;最适反应pH值为3.0,pH在2.2~3.8较为稳定,ABTS的漆酶动力学常数为72.622μM。     

荷叶离褶伞高产漆酶菌株选育及其漆酶酶学特性北大核心CSCD

应用原生质体紫外诱变,对一株产漆酶荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes）菌株紫外诱变,用愈创木酚马铃薯葡萄糖固体平板变色法初筛,然后用ABTS[2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐]测定漆酶活性进行复筛,获得1株漆酶高产诱变菌株HY1022-01;对HY1022-01所产漆酶粗酶液酶学特性进行研究,结果表明,HY1022-01所产漆酶最大酶活力比出发菌株提高30.32%,最适条件下酶活达991.67 U/mL,且产酶稳定;HY1022-1所产漆酶最适作用温度为35℃,在30∽35℃较为稳定;最适反应pH值为3.0,pH在2.2∽3.8较为稳定,ABTS的漆酶动力学常数为72.622μM。     

诺卡氏菌形放线菌β甘露聚糖酶的纯化和性质

产β１ ,４Ｄ甘露聚糖酶的诺卡氏菌形放线菌（ Ｎｏｃａｒｄｉｏｆｏｒｍ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ） 菌株ＮＡ３５４０ ,发酵培养７２ｈ ,发酵液离心去菌体,上清经硫酸铵沉淀,９５ ％ 乙醇沉淀,ＣＭＳｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 柱层析、羟基磷灰石柱层析、ＤＥＡＥ纤维素离子交换及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００ 分子凝胶过滤柱等步骤,β甘露聚糖酶的比活提高了１３７ 倍,获得凝胶电泳均一的蛋白样品。经ＳＤＳＰＡＧＥ 和凝胶过滤法分别测定β甘露聚糖酶分子量为４１ｋＤ和４０ｋＤ,证明该酶为单聚体;用等电聚焦电泳测得其等电点为４－８ ;经氨基酸组成分析,发现蛋白中有较高含量的Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｌａ 及Ｇｌｕ 残基。该酶的最适反应温度为７５ ℃,在不超过６０ ℃时酶活较稳定;酶反应的最适ｐＨ 为８－０ ,ｐＨ 稳定范围为６－５～１１－０ 。重金属离子Ｈｇ^２＋ 、Ｃｕ^２＋ 、Ｐｂ^２＋ 、Ｆｅ^3＋ 、Ｃｏ^２＋ 、Ｚｎ^２＋ 能强烈抑制该酶活性,而Ｍｎ^２＋ 、Ｆｅ^２＋ 、Ａｇ^＋ 对该酶有部分的抑制作用,低浓度的Ｎａ^＋ 、Ｋ^＋ 、Ｌｉ^＋ 对该酶基本没有影响。