单分子测序技术及应用研究进展

从DNA双螺旋结构的发现开始,生命科学研究进入分子水平,在20世纪70年代出现的测序技术为破译遗传密码作出了巨大贡献.近几年出现的单分子测序技术,可以在单个分子水平读取核苷酸序列,也被称为第三代测序技术,主要代表有HeliScope、Nanopore和PacBio等.与传统的第一代和第二代测序技术相比,第三代测序能够产生更长的碱基读长,能直接对RNA进行测序,无需逆转录,测序速度极快,同时其中某些技术所涉及的设备可以小型化,可便携至野外现场测序.第三代测序技术在生命科学基础理论研究及生物医学临床实践中,具有广泛的应用.本文重点介绍了各种单分子测序技术的原理、优缺点,及其应用研究进展.     

第三代测序技术的主要特点及其在病毒基因组研究中的应用

随着基因测序技术的创新和应用,新的高通量测序技术不断涌现,以Pacific Biosciences(PacBio)公司的单分子实时测序(single molecule real time sequencing)为代表的第三代测序(third generation sequencing,TGS)技术开始逐渐应用于基因组研究,包括大型基因组拼装、基因结构变异和表观遗传研究等方面。本文主要对TGS技术的原理、特点和应用,特别是在病毒研究中的应用进行介绍,并与第二代测序(next generation sequencing,NGS)技术进行比较,为基因组测序技术的选择及其临床应用提供一定参考。     

单分子实时测序技术的原理与应用

单分子DNA测序技术是近10年发展起来的新一代测序技术,也称为第三代测序技术,包括单分子实时测序、真正单分子测序、单分子纳米孔测序等技术。文章介绍了单分子实时(Single-molecule real-time,SMRT)测序技术的基本原理、性能以及应用。与Sanger测序法和下一代测序技术相比,SMRT测序具有超长读长、测序周期短、无需模板扩增和直接检测表观修饰位点等特点,为研究人员提供了新选择。同时,SMRT测序的低准确率备受争议(约85%),其中约93%的错误是插入缺失,因此,其数据应用于基因组组装前需先对数据进行纠错处理。目前,SMRT测序在小型基因组从头测序和完整组装中已有良好应用,并且已经或将在表观遗传学、转录组学、大型基因组组装等领域发挥其优势,促进基因组学的研究。     

DNA测序技术的发展历史与最新进展

DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术。从1977年第一代测序技术的出现,经过30多年的发展,DNA测序技术取得重大进展,以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化,以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。介绍每一代测序技术的特点,并重点介绍了第二代测序技术及其应用。展望新的测序技术对于未来生物学研究及人们自身健康与人类疾病等方面研究的影响。     

实现“终极版”核苷酸测序仪的技术要素

20世纪70年代发明的第一代DNA测序技术,尽管测序通量有限,却成功地保证了“人类基因组计划”的实施;世纪之交出现的下一代(第二代) DNA测序技术经历了通量飞跃,为各种精准医学项目的实施提供了保障;目前的第三代技术,尽管通量居二代之后,但读长和单分子测序优势也让其有立足之本;第四代测序技术的基本标志是不经过cDNA (以RNA为模版合成的互补DNA),无PCR扩增,而直接测定单分子RNA序列,以及确定单分子RNA上的修饰核苷酸位点。从技术的角度看,第三、四代技术有一定技术要素共享(比如在单分子水平测定DNA序列),但是就测序对象而言,第四代应该属于“终极版”核苷酸测序仪：可以从单细胞出发,既能测定DNA序列,也可以测定RNA序列,也可以直接确定修饰核苷酸位点。因此,要实现这个“终极版”核苷酸测序仪,就要调动相关核心技术要素,而这些要素毫无疑问地会涉及物理、化学、工程学、生物学、半导体科学、计算机科学等领域的前沿技术,包括纳米科学、单分子光学、单分子拉曼光谱、单分子核磁共振、单分子酶学、人工智能等所谓的“硬科技”。其功能是从单细胞的裂解开始,经微纳结构实现组分分流后,直接导入RNA序列测定单元,定量分析细胞RNA分子的种类、数量、序列和修饰核苷酸位点的存在频率。本文系统介绍了第四代测序仪的可能技术要素,以及应用需求和新研究范式。     

表观遗传学研究方法进展

表观遗传调控是基因表达调控的重要组成部分,已成为当前研究的热点.目前其研究主要集中在DNA甲基化和组蛋白修饰.针对这两种表观修饰,其研究方法也取得了较太进展,一方面方法的是敏度和特异性都在不断提高;另一方面表现修饰的检测正在逐步从定性检测向定量分析方向发展,从个别位点向高通量检测发展.此外,新一代测序技术的应用特大大推动表观遗传研究的发展,包括单分子实时测序法、单分子纳米孔科序法等.综述目前常用的DNA甲基化、组蛋白修饰研究方法以及最新的单分子测序技术,并对它们在表观遗传修饰检测中的应用作了简要对比分析.     

基于第二代测序技术的基因资源挖掘

转录组研究一直是生命科学研究的一个重要方向,在第二代测序技术问世以前,已经产生了一些行之有效的转录组研究方法,但这些方法存在一定的局限性。第二代测序技术的出现不仅使转录组研究很快进入了高速发展期,同时也为遗传资源的挖掘提供了一套全新的技术平台。本文简要介绍了第二代测序技术的化学原理和特性,重点阐述了利用第二代测序技术进行转录组测序,从而在此基础上挖掘遗传资源的研究。     

第三代测序技术的研究进展与临床应用

Sanger测序法,又称第一代测序技术,作为测序金标准推动了人类基因组“工作框架图”的绘制,但通量低、成本高的缺点限制了其进一步大规模应用。第二代测序技术,又称下一代测序技术,因其通量高、成本低等优点使得基因测序在基础研究与临床诊疗中得到广泛应用,但短读长一直是其不可回避的技术短板。第三代测序技术的出现,因其具有长读长优势,为基因序列上复杂重复区域解析与高质量基因组组装提供了新的技术手段。近年来,第三代测序技术进一步发展与完善,同时在肿瘤、免疫、生殖等相关领域逐步体现出临床应用价值。本文将综述第三代测序技术的研究进展与临床应用。     

第三代测序技术及其应用

第二代测序技术发展到一定阶段以后其缺陷逐渐显现,而第三代测序技术的出现在一定程度上弥补了第二代测序技术在应用方面的缺点.就目前正在发展的5种第三代高通量测序技术的原理进行了阐述,并比较了这几种测序技术的优缺点,最后对三代测序技术在基因组测序,甲基化研究,RNA测序以及医学方面的应用作了简单介绍.     

DNA测序技术的进展和挑战

基因是人类的遗传信息的载体,其遗传和表达影响人类的繁衍及各种生命活动;个体基因组DNA序列突变往往会导致疾病的发生,获取个体的基因组DNA序列将有助于疾病的诊断.DNA测序技术潜在的医学应用前景使其近几年有了飞速的发展.本文将介绍各代DNA测序技术已经取得的进展,目前尚待克服的挑战及可能的解决办法,并着重分析最新的单分子测序技术的发展潜能及临床应用前景.     

The advantages of SMRT sequencing

Of the current next-generation sequencing technologies, SMRT sequencing is sometimes overlooked. However, attributes such as long reads, modified base detection and high accuracy make SMRT a useful technology and an ideal approach to the complete sequencing of small genomes.Pacific Biosciences'' single molecule, real-time sequencing technology, SMRT, is one of several next-generation sequencing technologies that are currently in use. In the past, it has been somewhat overlooked because of its lower throughput compared with methods such as Illumina and Ion Torrent, and because of persistent rumors that it is inaccurate. Here, we seek to dispel these misconceptions and show that SMRT is indeed a highly accurate method with many advantages when used to sequence small genomes, including the possibility of facile closure of bacterial genomes without additional experimentation. We also highlight its value in being able to detect modified bases in DNA.     

The advantages of SMRT sequencing

Of the current next-generation sequencing technologies, SMRT sequencing is sometimes overlooked. However, attributes such as long reads, modified base detection and high accuracy make SMRT a useful technology and an ideal approach to the complete sequencing of small genomes.Pacific Biosciences'' single molecule, real-time sequencing technology, SMRT, is one of several next-generation sequencing technologies that are currently in use. In the past, it has been somewhat overlooked because of its lower throughput compared with methods such as Illumina and Ion Torrent, and because of persistent rumors that it is inaccurate. Here, we seek to dispel these misconceptions and show that SMRT is indeed a highly accurate method with many advantages when used to sequence small genomes, including the possibility of facile closure of bacterial genomes without additional experimentation. We also highlight its value in being able to detect modified bases in DNA.     

Plant genome sequencing: applications for crop improvement

DNA sequencing technology is undergoing a revolution with the commercialization of second generation technologies capable of sequencing thousands of millions of nucleotide bases in each run. The data explosion resulting from this technology is likely to continue to increase with the further development of second generation sequencing and the introduction of third generation single‐molecule sequencing methods over the coming years. The question is no longer whether we can sequence crop genomes which are often large and complex, but how soon can we sequence them? Even cereal genomes such as wheat and barley which were once considered intractable are coming under the spotlight of the new sequencing technologies and an array of new projects and approaches are being established. The increasing availability of DNA sequence information enables the discovery of genes and molecular markers associated with diverse agronomic traits creating new opportunities for crop improvement. However, the challenge remains to convert this mass of data into knowledge that can be applied in crop breeding programs.     

零模波导原理、制备及其在单分子荧光检测中的应用

单分子荧光检测作为一种能够表征分子个体性质及行为的分析方法,有助于揭示利用传统荧光检测方法无法得到的信息,在近年来受到人们的广泛关注。利用传统光学检测设备进行单分子荧光检测时,由于受到衍射极限的限制,同时为了保证在观测体积内只有单个荧光分子,仅能采用无限稀释溶液的方法实现单分子荧光检测。虽然这种方法可以满足单分子检测的要求,但是由于大部分酶分子正常工作时底物的生理浓度都非常高,底物浓度的大幅度降低会对酶分子的反应机制等方面造成影响。零模波导作为一种新型的单分子检测器件,通过纳米微孔结构突破了光学衍射极限的限制将观测体积降至仄升量级（10-21L）,使得在生理浓度范围内检测单分子荧光成为可能,在单分子荧光检测领域得到了广泛应用。因此,就零模波导的原理、制备工艺及其在单分子DNA测序、生物膜、生物大分子之间的相互作用及单分子反应动力学方面的具体应用进行综述。     

单个肿瘤细胞测序研究进展

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,遗传物质受损导致特定细胞失去对正常生长调控,引起其克隆性异常增生而形成的恶性赘生物。随着单细胞分离技术及单细胞测序技术日益成熟,单个肿瘤细胞全基因组测序已成为肿瘤研究的一个崭新的领域。该文就对单个肿瘤细胞的获取及单个肿瘤细胞测序研究进展进行综述。     

DNA测序技术概述

DNA测序技术作为现代生命科学研究的核心技术之一,自上世纪70年代中期DNA发明以来发展迅速。我们简要综述现有的几代DNA测序技术的原理及其发展历程,并对未来可能出现的第三代测序进行预测。     

第三代测序基本原理

文章阐述了以单分子实时测序和纳米孔技术为标志第三代测序的基本原理,介绍了Helicos的Heliscope单分子测序仪、Pacific Bioscience的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术。与其他测序技术进行了简单的对比以并提出一些单分子测序仍需面对的问题以及对未来单分子测序的展望。