一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法

目的 :利用Fugene 6基因转染试剂建立一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法 ,并建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)报告基因的人胚胎干细胞系 ,为人胚胎干细胞研究提供一个非常有用的细胞模型。方法 :通过Fugene 6基因转染试剂成功地将EGFP基因转入无饲养层培养的人胚胎干细胞中 ,嘌呤霉素筛选得到稳定表达EGFP的克隆 ;利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测EGFP在人胚胎干细胞中的表达情况。结果 :EGFP瞬时转染效率为 30 %～ 40 % ,稳定转染效率约 1/10^4～5,且稳定转染的人胚胎干细胞均表达EGFP。结论 :Fugene 6是一种良好的基因转染试剂 ,它可以有效地将外源基因转入人胚胎干细胞中 ,为人胚胎干细胞的转基因研究提供新的实验手段。     

从人胚胎干细胞畸胎瘤中有效获取间充质干细胞和神经前体细胞

通过人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)体外分化方法和畸胎瘤形成可以分化获得多种成体细胞．但目前尚不清楚是否可以从hESCs畸胎瘤中分离某些特异性细胞．通过体外筛选方法,有效地从hESCs畸胎瘤中分离出神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)．这种hESCs畸胎瘤来源的NPCs和MSCs与体内神经前体细胞和间充质干细胞有着相似的分子标记和特性,并具有进一步的分化潜能——分别可以诱导成为神经元、神经胶质细胞、脂肪细胞和骨骼细胞等．根据人胚胎干细胞畸胎瘤中含有不同分化阶段的外胚层、中胚层和内胚层的组织或细胞,认为人胚胎干细胞畸胎瘤可以作为另一个细胞来源以获取多种(包括人胚胎干细胞体外分化难以得到的)各种前体/干细胞和终末分化细胞．     

利用逆转录病毒载体建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系

目的:建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系。方法:利用包装细胞获得重组的逆转录病毒,感染人类胚胎干细胞,为干扰组ShSMAD2、载体组VECTOR和野生型组WT;经荧光筛选获得阳性克隆;Realtime-PCR检测SMAD2 mRNA的表达。结果:带GFP荧光标记的SMAD2特异性shRNA逆转录病毒感染人类胚胎干细胞后,获得稳定干扰SMAD2表达的人胚胎干细胞系。经检测shSMAD2组SMAD2 mRNA表达较VECTOR和WT组明显降低,VECTOR和WT组之间无明显差异。结论:通过SMAD2特异性shRNA逆转录病毒载体构建了稳定干扰SMAD2的人类胚胎干细胞。     

胚胎干细胞体外分化为造血干细胞

造血干细胞移植已成为治疗白血病、再生障碍性贫血、重症免疫缺陷征、地中海贫血、急性放射病、某些恶性实体瘤和淋巴瘤等造血及免疫系统功能障碍性疾病的成熟技术和重要手段,另外这一技术还被尝试用于治疗艾滋病,已取得积极的效果。但是由于移植需要配型相同的供体,并且过程复杂,使得造血干细胞移植因缺少配型相同的供体来源以及费用昂贵而不能被广泛应用。胚胎干细胞是一种能够在体外保持未分化状态并且能进行无限增殖的细胞,在适合条件下能够分化为体内各种类型的细胞,研究胚胎干细胞分化为造血干细胞,不仅可作为研究动物的早期造血发生的模型,而且可以增加造血干细胞的来源,还可以通过基因剔除、治疗性克隆等方法来解决移植排斥的问题,从而为造血干细胞移植的发展扫除了障碍,因此有着重要的研究价值和应用前景。现对胚胎干细胞体外分化为造血干细胞的诱导方法,诱导过程中的调控机制,并对胚胎干细胞分化为造血干细胞的存在问题和发展前景进行讨论。     

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.     

人胚胎干细胞向神经上皮祖细胞的诱导分化

人胚胎干细胞具有自我更新和多向分化潜能,是研究早期胚胎发育和细胞替代治疗的重要细胞来源.采用一种与小鼠成纤维细胞共培养的方法进行人胚胎干细胞的神经诱导,可产生高纯度的神经上皮祖细胞,其神经上皮特异性基因的表达有一定的时空性;诱导生成的神经上皮祖细胞具有增殖潜能并可分化为神经元和星型胶质细胞,是潜在的神经干细胞.人胚胎干细胞来源的神经上皮祖细胞为研究神经发育和神经诱导提供了新材料,也为神经系统疾病的细胞替代治疗提供了新的细胞来源.     

人胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞

采用单层贴壁分化的方法在无血清条件下诱导同源饲养层培养的人胚胎干细胞定向分化,得到了高比例的神经前体细胞(97.5±0.83)%(P<0.05)。这些神经前体细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。在长期的传代培养中发现,随着培养时间的延长,nestin阳性的神经前体细胞比例下降,同时发育能力也发生了变化。在传代培养的早期,神经前体细胞发育为神经元的比例很高,几乎没有胶质细胞分化出来。随着培养时间的延长,胶质细胞的比例逐渐上升。这与体内神经系统的发育过程非常相似。进一步研究发现具有bHLH(basic helix-loop-helix)结构域的转录因子neurogenein2(Ngn2)和Olig2可能在这一变化中起重要作用。因此,人胚胎干细胞来源的神经前体细胞能够模拟体内神经发育的模式,为在体外研究人的神经发育和再生医学奠定了基础。     

胚胎干细胞起源的探讨

目前胚胎干细胞(ESCs)建系的取材来源包括桑椹胚的卵裂球、囊胚的内细胞团(ICM)、上胚层细胞和原始生殖细胞(PGCs),甚至从新生鼠睾丸细胞也分离得到类ES样细胞系。这就提出了一个问题,什么是ESCs最接近的体内细胞来源。传统观念常常把ESCs等同于ICM细胞,也有学者认为ESCs更象上胚层细胞,而在已知的分子标记基因方面,ESCs所具有的特征更接近体内早期生殖细胞。不清楚ESCs最接近的体内细胞来源,可能是制约许多品系小鼠和大多哺乳类动物建系成功率提高的原因之一。ESCs系与EG细胞系的分离条件不同表明,加强对ESCs多能性维持基因调控研究具有重要意义。本文从ESCs的经典概念及其发展,早期胚胎细胞和生殖细胞发育规律,早期胚胎细胞、早期生殖细胞和ESCs的关系等方面进行综合分析,认为ESCs可能有多种接近的体内细胞来源。进一步应通过对ESCs建系不同的取材细胞和不同品系的ESCs间进行比较研究,以便弄清ESCs的来源和转化机制,为提高不同物种ESCs建系效率提供理论支持。     

人胚胎干细胞培养体系的研究进展

人胚胎干细胞具有广泛的研究前景,建立一个理想的人胚胎干细胞培养系统是利用它的前提.较详细地对目前关于人胚胎干细胞培养体系的研究进展、一些细胞因子对人胚胎干细胞的作用和影响以及体外长期培养对人胚胎干细胞核型的影响进行了综述.     

人类及小鼠胚胎干细胞的不同多能性状态

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是来源于早期胚胎的全能性细胞,在合适条件下具有分化为任何一类成体细胞的潜力。在小鼠中,根据细胞来源的胚胎发育时间,ESCs可以被分为原始态多能性(na(?)ve pluripotency)和始发态多能性(primed pluripotency)两种状态。这两种状态的细胞在发育上相互联系,具有不同的形态、信号依赖、发育性质、基因表达及表观遗传学性质,并且在特定的条件下可以相互转化。人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)的发育潜能曾一度被认为低于小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs),直到人类原始态胚胎干细胞的发现证明了hESCs可以表现出与mESCs相似的性质。这对于人类胚胎发育的研究及ESCs在临床治疗上的实际应用都具有重要的意义。     

Experimental Subjectification:The Pursuit of Human Embryonic Stem Cells in India

Drawing on Foucault's notion of subject formation or subjectification, this article shows how a process of experimental subjectification, a wilful submission and participation in seemingly experimental treatments, produces both empowering and life-affirming experiences as well as a critique of established scientific norms and practices. The article examines processes of experimental subjectification in the narratives of patients pursuing clinical application of human embryonic stem cells in India to treat chronic spinal cord injury and in the narrative of the director of the clinic providing the treatment. The article addresses how the clinic's director and patients from around the globe continue to successfully pursue embryonic stem cell therapies, despite intense media speculation and scientific scrutiny labelling the clinic as a maverick experimental site.     

人肝癌血清对人体胚胎干细胞文库的筛选及方法改进

用人肝癌血清从人体胚胎干细胞cDNA表达文库中筛选肝癌相关抗原,并对SEREX条件方法的改良作进一步的探索。将已构建好的人胚胎干细胞cDNA表达文库进行滴度计算。利用38例原发性肝癌病人血清,结合SEREX技术,应用Western blot方法,对表达文库中的相关抗原做血清学免疫筛选。同时,对SEREX技术贴膜条件及假阳性的排除方法进行改良。cDNA表达文库滴度为3.8×10~8pfu/ml,筛选出阳性克隆有31个。从人胚胎干细胞cDNA表达文库中能筛查到部分有效的肝癌肿瘤相关抗原,为后续工作提供宝贵资料。     

人孤雌胚胎干细胞在人包皮成纤维细胞饲养层上的生长状态

人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESCs)体外培养常需饲养层的支持以保持干细胞特性.通过原代培养获得人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,hFFs)并将其制备成饲养层,使hPESCs在hFFs上进行体外培养及传代.倒置显微镜下观察hPESCs的生长状态,采用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)检测、核型分析和体内分化实验研究hPESCs的生物学特性及分化潜能,以探索hFFs能否长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.经原代培养成功获得了hFFs,通过形态学观察和免疫细胞化学染色鉴定符合成纤维细胞的生物学特性;在hFFs上生长的hPESCs克隆形态规则,不易分化;已成功在体外培养20余代,hPESCs仍能够保持基本生物学特性和正常核型,在裸鼠体内可形成含有3个胚层组织成分的畸胎瘤.作为人源性饲养层,hFFs可长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.     

无饲养层培养人胚胎干细胞方法的建立

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hES细胞)是当前医学研究的热点之一．然而hES细胞培养条件苛刻,通常需要采用鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEFs)饲养层来维持其未分化状态,成为目前hES细胞研究的瓶颈之一、本实验成功地将hES细胞接种在细胞外基质包被的六孔板上培养,传代20次后细胞仍然保持良好的未分化状态,各种hES细胞生物学特性(如表面标志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-8l,OCT-4,碱性磷酸酶及体内外分化潜能等)均无改变;其冻存、复苏效果与生长在饲养层上的hES细胞无明显差异．因此,该无饲养层培养体系可以用于培养hES细胞,并为hES细胞转基因研究及大规模培养打下良好的基础．     

小鼠胚胎干细胞建系技术研究进展

目前,对小鼠胚胎干细胞的研究较为深入,并已成为研究细胞分化及信号转导、新基因发现及功能鉴定、器官发生、人类疾病和药物开发等的有效手段。胚胎干细胞建系是一项基础性工作。虽然技术日趋成熟,有些品系小鼠的胚胎干细胞建系已是常规技术,但不同品系小鼠胚胎干细胞的建系效率仍有很大差异,建系途径和方法各有特点,一个品系胚胎干细胞的建系方法不一定都适用于其他品系。本文从小鼠胚胎干细胞建系的途径、分离操作技术、培养体系等方面进行综述,并就与之相关的有些问题提出思考和对策。     

提高人胚胎干细胞建系率的优选培养体系与方法

目的:建立一种从废弃胚胎中提高囊胚形成率和质量的培养体系,寻找多种促进内细胞团(ICM)数目增多、贴壁、增值的方法,提高人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)建系效率,建立人胚胎干细胞库。方法:将179枚IVFDay3废弃的胚胎放入优选培养体系中培养(G2.5培养液中添加10%人血清蛋白,人白细胞抑制生长因子(hLIF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))。到Day7将形成的囊胚全部用机械法分离ICM,接种于丝裂霉素C灭活处理的原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上,培养8-9天,每4-5天传代1次。结果:优选培养体系的囊胚形成率为29.1%(52/179),其中A级囊胚形成率为11.2%(20/179),50个ICM贴壁生长,20个出现克隆形态,成功建立11株hESC(FY-hES-11至FY-hES-21)。11株hESC均具有共同的多能性生物学特性。结论:优选培养体系可以明显提高囊胚形成的质量,促进ICM的增值,纯熟的机械切割法可以避免损伤ICM并提高其贴壁率,原代灭活的MEF饲养层可以明显促进细胞增殖。     

一种新的人胚胎干细胞无饲养层培养方法的建立

目的:以转染碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胎肝基质细胞株(FLSC)培养人胚胎干细胞(hESC),寻找更加安全、有效的体外培养扩增方法。方法:通过ELISA方法定量检测转基因的人FLSC条件培养基中bFGF的分泌量;以商业化的mTeSR1无血清无饲养层培养基、常规小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基,以及转染bFGF的人FLSC条件培养基(bFGF/FLSC-CM)分别培养扩增H9细胞。通过观察hESC形态、免疫荧光染色、流式细胞检测及RT-PCR,检测hESC全能性标志物的表达。结果:ELISA方法检测bFGF/FLSC-CM中bFGF因子的分泌量为(770.09±17.28)pg/mL,而MEF-CM中bFGF因子的分泌量为(55.59±0.61)pg/mL,两者存在显著差异(P0.01);在3种培养体系下,免疫荧光检测hESC全能性标志Oct-4、Tra-1-81抗体的表达均呈阳性,流式检测细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)抗体阳性细胞的比例均在99%左右;RT-PCR检测到hESC特异的转录因子Oct-4、Nanog、Sox-2的表达。结论:以转染bFGF的人FLSC条件培养基可以有效扩增hESC,可为临床应用提供一种安全、高效、低成本的无饲养层培养方法。     

胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的分子调控机制

胚胎干细胞在不同的诱导条件下具有多向分化的潜能,多种胞内外信号途径参与其分化过程的调控。现就胚胎干细胞向血管内皮细胞分化的诱导条件及分子机制做一综述,并阐明不同阶段的内皮前体细胞所表达的不同分子标志,同时提出胚胎干细胞在再生医学中的应用前景。     

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 10⁵ hESCs are needed to form a 16 cm³ teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.