中国仓鼠卵巢细胞及其表达载体的改造

哺乳动物细胞因其表达的外源蛋白最接近天然构象,已成为生产重组蛋白药物的理想系统。其中,中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是目前最为常用的表达系统,但这种系统也存在很多缺点,如大规模培养中表达量低、生产成本高、细胞无限度增殖及细胞凋亡等。目前,通过优化培养基配方和培养条件很难从根本上解决上述问题,必须从整个表达系统着手进行改造,其中CHO细胞本身和表达载体的改造最为关键。     

定点整合人Bcl-2基因的CHO/dhfr-细胞株的建立

构建重组载体质粒pMCEfrt—Bcl-2,利用FIp—In^TM定点重组系统,在CHO—dhfr^-细胞内定点整合人Bcl-2基因,通过Western印迹检测重组细胞Bcl-2蛋白的表达。通过流式细胞仪和DNA Ladder检测在高NH4C1条件下细胞的凋亡情况;用台盼蓝染色检测在无血清IMDM培养基中细胞的活细胞数目和活细胞比例。结果获得了稳定表达Bcl-2基因的细胞株CHO—Bcl-2,该细胞株能高水平表达Bcl-2蛋白。在无血清培养过程中,CHO—Bcl-2细胞比对照细胞保持高约15％的活细胞比例,细胞总数高25％。CHO-Bcl-2在高NH4^＋（50mmol／L）培养条件下具有较低的凋亡水平。建立了能够高表达Bcl-2基因并具有一定的抗凋亡能力的重组CHO／dhfr^-细胞株。     

电转染哺乳类动物细胞DG44-CHO的方法探讨

目的：建立并验证DG44-CHO细胞快速、无血清培养体系的转染方法。方法：将绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1电转入DG44-CHO细胞,用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达量;将不同重组蛋白表达质粒C1—28／GL1／pCMV163、C1-28／GL2／pCMV163和TmHL／pCMV163分别电转入DGd4-CHO细胞,ELISA检测其培养上清中相应重组蛋白的表达。结果：280V电压电击20ms、质粒用量为20pg时,转染细胞中绿色荧光蛋白的表达量最高;同样在该条件下,培养上清中重组蛋白浓度最高。结论：上述电转染条件具有一定的适用性。     

改造中国仓鼠卵巢细胞

原核细胞、酵母细胞以及昆虫细胞相比,中国仓鼠卵巢细胞（CHO）作为宿主细胞表达的外源蛋白最接近其天然构象,因而CHO细胞表达系统是生物工程制药最为理想的表达系统。但这种系统也存在诸多缺点。如在大规模培养中CHO细胞会面临着对无血清培养基的适应性差、细胞无限度增殖以及细胞凋亡等很多难题。所以除了在培养基、培养条件和表达载体方面下功夫优化该系统外,对CHO细胞本身进行改造已成为优化CHO表达系统的另一热点。      

悬浮培养CHO 细胞生产重组人促红细胞生成素条件的优化*

目的:通过对贴壁培养CHO细胞筛选驯化,得到高表达的细胞后进行悬浮培养生产重组人促红细胞生成素(rHuEPO)。方法:利用96孔板和24孔板对CHO细胞进行筛选,得到高表达细胞株后进行驯化,使其适合悬浮培养,经过摇瓶扩增后接种到生物反应器中无血清培养,每天监测葡萄糖含量,测rHuEPO表达量。结果:悬浮培养CHO细胞生产rHuEPO,生产周期短,表达量比贴壁培养高出很多,操作方便,减少污染,易于放大,并建立了适合悬浮培养的CHO细胞株,为工业化悬浮培养CHO细胞生产rHuEPO提供了技术基础。结论:经过工艺优化后利用无血清悬浮培养生产促红细胞生成素平均表达量较贴壁培养高,生产周期短,有利于降低生产成本。     

重组人bFGF的原核表达及功能分析

为研究重组人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor, bFGF)的原核表达及纯化条件,并分析其功能,该研究根据bFGF基因序列,优化密码子,构建pE T-28a原核表达载体,经IPTG诱导, SDS-PAGE电泳分析验证,采用Ni柱进行分离纯化目的蛋白bFGF。培养NIH3T3细胞、HEK293细胞及CHO细胞,并进行CCK-8实验检测蛋白活性。结果显示,成功构建原核表达载体。经电泳分析,在1 mmol/L IPTG诱导条件下,成功表达目的蛋白bFGF,表达量约占菌体蛋白量32%,蛋白纯度约为96%。活性检测结果显示, ED_(50)分别为5.97 ng/mL、4.21 ng/mL、6.71 ng/mL,可以有效促进NIH3T3细胞、HEK293细胞及CHO细胞增殖。该研究得出,经原核表达系统成功表达人bFGF蛋白且其活性较高。     

抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体工程细胞的驯化、抗体表达及鉴定

目的:通过对稳定表达抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体的CHO细胞进行驯化,检测其抗体的表达情况,并对所表达抗体的生物学活性进行初步鉴定。方法:将本课题组前期筛选得到的稳定高表达细胞株1-D9进行无血清驯化,使其适合悬浮培养后接种到摇瓶,通过调整不同的培养条件,每天检测细胞的活率和抗体表达量,并对表达的抗体进行生物学活性鉴定。结果:通过驯化得到了适合悬浮培养的CHO细胞株,其抗体表达量高,生产周期短;并优化了其悬浮培养条件,表达的抗体经鉴定其生物学活性稳定。结论:优化了抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体表达条件,为下一步工业化生产提供了实验依据。     

重组中华仓鼠卵巢细胞培养过程控制的研究进展

中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cells,CHO)是科研及生产中用于蛋白表达的常用体系。与大肠杆菌相比,CHO获得高表达的细胞株所需时间更长,蛋白产量更低。因此,大规模培养细胞所需的成本较高,培养条件也不易掌握。但该体系产生的蛋白纯度高,因而被广泛用于工业生产中。本文对CHO细胞的培养方式、pH值测定、渗透压、溶氧及培养液成分的选择等多方面条件进行综述,为优化中华仓鼠卵巢细胞培养的策略及具体方法提供理论依据。     

产HBsAg CHO细胞无血清培养研究

在分析CHO C2 8细胞对培养基中氨基酸利用的基础上 ,对DMEM培养基进行初步优化。再采用统计学正交分析方法 ,在初步优化的DMEM培养基中添加胰岛素、转铁蛋白等促细胞生长因子 ,建立了一种适于CHO C2 8细胞持续用无血清培养基———CHO C2 8 SFM。经转瓶维持实验 ,在CHO C2 8 SFM中维持培养的细胞 ,其乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)表达水平达到用含 5 %FBS培养液维持的 70 %～ 80 % ,但纯化收率提高 1 0 %以上 ,可用于大规模生产。     

CHO细胞表达系统研究进展

CHO细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统。随着无血清悬浮培养技术、基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展,CHO细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统,并被广泛应用于抗体、重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中。近年来,针对CHO细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足,研究者们通过利用基因工程技术手段,结合重组蛋白表达机制的研究成果,为优化和应用CHO细胞表达系统做出了不懈努力。从培养基的优化、高产重组CHO细胞株的构建、大规模培养三个方面综述了CHO细胞表达系统的最近研究进展,以期为CHO细胞表达系统的研究与应用提供参考。     

生物反应器规模化培养重组CHO-C28细胞表达HBsAg的研究

应用新型聚酯纤维盘片,采用连续灌注培养方式,分别试验了细胞接种量、pH、DO、罐流速度等因素对CHO-C28细胞生长分泌HBsAg的影响,初步建立了5L生物反应器生产重组乙型肝炎疫苗的生产工艺。经3次试验培养,每次培养60d,较适宜的培养条件确定为:pH6.80-7.10,DO 20%-30%,温度36-37℃,灌流速度138ml/h,接种浓度1.9×106cell/ml。收获液的HBsAg平均滴度是1∶256,最高滴度可达1∶512,纯化后的HBsAg产率为0.912mg/L。最后对反应器培养工艺与现行的转瓶培养工艺进行了比较,生物反应器培养具有可控制培养条件、不易污染和可使HBsAg产率提高等优点。     

不同时间采集的小牛血清对CHO-C28细胞培养及表达的影响

通过研究小牛血清对CHO-C28细胞培养及HBsAg表达的影响,探讨小牛血清的不同采集时间对血清质量的影响。采集出生后4、8、12h(未进食)小牛的血清,对CHO-C28细胞进行传代、换液培养,并检测乙肝表面抗原(HBsAg)表达量。结果可见:①在细胞传代4次时,4h采集的血清细胞生长状态良好,8h采集的血清细胞出现明显的衰老,12h采集的血清细胞大面积死亡;②在细胞维持换液方面,4h采集的血清可维持细胞换液25次以上,8h采集的血清可勉强维持20次,12h采集的血清维持细胞换液10次时已大部分死亡;③乙肝表面抗原(HBsAg)表达量的检测结果,同批培养上清,4h采集的血清培养细胞表达量最高。可见,小牛出生后采集血清时间越早越好。     

乙肝基因疫苗在BALB/c小鼠体内的效力评价

采用ＨＢｓＡｇ高表达细胞株（ＣＨＯ－Ｃ２８）试制的乙肝基因疫苗,对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进行免疫,四周后进行了血清效力评价。并同时与血源乙肝疫苗进行了比较。结果表明,乙肝基因疫苗能达到与乙肝血源疫苗相同的免疫效果。     

新型佐剂DC-Chol对不同来源HBsAg促细胞免疫比较研究

目的： 筛选治疗性乙肝疫苗的候选抗原。方法： 分别用国产CHO乙肝表面抗原和酵母乙肝表面抗原结合DC-Chol脂质体佐剂免疫BALB/c小鼠,1周后检测其脾细胞产生的IL-2和IFN-γ的水平。ELISPOT法评价铝佐剂和DC-Chol脂质体佐剂结合HBsAg促小鼠细胞免疫反应水平。结果： 酵母乙肝表面抗原结合DC-Chol脂质体所诱导的IL-2和IFN-γ的水平分别为CHO乙肝表面抗原结合DC-Chol脂质体的20倍和119倍。酵母乙肝表面抗原结合DC-Chol脂质体所诱导的IL-4和IFN-γ的斑点数分别为酵母乙肝表面抗原结合铝佐剂的2.8倍和46.3倍。结论： 就DC-Chol脂质体佐剂而言,酵母表达的乙肝表面抗原细胞免疫原性强,是适合用于治疗性乙肝疫苗的候选疫苗。     

重组CHO细胞HBsAg 纯化工艺的优化

目的：优化重组CHO细胞HBsAg纯化工艺。方法：由乙肝病毒S基因转化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养收液,经初步提纯、密度梯度离心、凝胶过滤层析可得到HBsAg纯品。结果：通过凝胶过滤层析收取HBsAg活性峰,控制HBsAg活性峰的收量,并把HBsAg活性峰的下降段再收集起来重新层析,改进后可使HBsAg的总回收率达到60％以上,而且牛血清蛋白残余量达到10mg/ml以下,HBsAg纯度97％以上。结论：重组CHO细胞HBsAg纯化工艺改进后,使HBsAg在产量及质量上均有明显提高。     

HveA (Herpesvirus Entry Mediator A), a Coreceptor for Herpes Simplex Virus Entry, also Participates in Virus-Induced Cell Fusion

The purpose of this study was to determine whether a cell surface protein that can serve as coreceptor for herpes simplex virus type 1 (HSV-1) entry, herpesvirus entry mediator (previously designated HVEM but renamed HveA), also mediates HSV-1-induced cell-cell fusion. We found that transfection of DNA from KOS-804, a previously described HSV-1 syncytial (Syn) strain whose Syn mutation was mapped to an amino acid substitution in gK, induced numerous large syncytia on HveA-expressing Chinese hamster ovary cells (CHO-HVEM12) but not on control cells (CHO-C8). Antibodies specific for gD as well as for HveA were effective inhibitors of KOS-804-induced fusion, consistent with previously described direct interactions between gD and HveA. Since mutations in gD determine the ability of HSV-1 to utilize HveA for entry, we examined whether the form of virally expressed gD also influenced the ability of HveA to mediate fusion. We produced a recombinant virus carrying the KOS-804 Syn mutation and the KOS-Rid1 gD mutation, which significantly reduces viral entry via HveA, and designated it KOS-SR1. KOS-SR1 DNA had a markedly reduced ability to induce syncytia on CHO-HVEM12 cells and a somewhat enhanced ability to induce syncytia on CHO-C8 cells. These results support previous findings concerning the relative abilities of KOS and KOS-Rid1 to infect CHO-HVEM12 and CHO-C8 cells. Thus, HveA mediates cell-cell fusion as well as viral entry and both activities of HveA are contingent upon the form of gD expressed by the virus.     

Actin paracrystal induction by forskolin and by db-cAMP in CHO cells

Forskolin, a hypotensive diterpine, is assumed to be a potent activator of adenylate cyclase leading to increased levels of cAMP. When this drug is used at 10(-5) M on CHO-C14 cells in culture, it induces within 15 min actin paracrystals in all cells. At this time the paracrystals are mostly situated close to the cell periphery. Electron microscopy (EM) shows structures typical of actin paracrystals. Scanning electron microscopy (SEM) reveals a reduction in surface microvilli and blebs. Identical results can be obtained by adding 1 mM db-cAMP to the culture medium directly. The paracrystals are observed within 15 min and thus represent one of the earliest ultrastructural changes so far described for reverse transformation of CHO cells by db-cAMP. The microtubular and vimentin profiles appear unchanged by forskolin treatment of CHO-K1 cells. Out of currently unknown reasons forskolin does not induce the actin transformation in several other commonly used cell lines.     

Fermentation of recombinant yeast producing hepatitis B surface antigen

Summary Fermentations were performed to determine parameters affecting the expression of hepatitis B surface antigen (HBsAg) in the yeastSaccharomyces cerevisiae containing the HBsAg gene. These studies emphasized inereasing both the relative abundance (HBsAg: cell mass) and total production of HBsAg. Specific activity was increased 70-fold when cells were grown in shake flasks containing nonselective rather than selective medium. The addition of adenine, ammonium sulfate or glucose to the complex medium reduced the production of antigen. Results similar to those achieved in shake flasks were obtained when the growth was performed in fermenters. A nutrient addition system was employed to increase the production of cells and HBsAg. The addition of glucose to the culture medium increased cell mass 6-fold but decreased the production of antigen. This imbalance was corrected by supplementing the glucose with complex nutrients.     

乙型肝炎病毒表面抗原在骨髓细胞中的存在及其与乙型肝炎病毒血清复制指标的关联

选择16例血清HBsAg阳性患者为实验组,19例血清HBsAg阴性患者为对照组,每一患者同时采取血清和骨髓涂片,用免疫细胞化学方法(PAP)检测骨髓涂片细胞中的HBsAg。结果,实验组3例骨髓细胞HBsAg阳性者,其血清中HBsAg滴度都很高,而且HBeAg均呈阳性。而在抗HBe阳性或HBeAg/HBeAb阴性者中均无骨髓细胞HBsAg阳性者。在5例血清HBV-DNA多聚酶阳性者中,骨髓细胞中HBsAg阳性者2例;6例多聚酶阴性者中,骨髓细胞中HBsAg阳性者仅1例。 本研究结果证明,HBV可在肝外组织细胞中测出,骨髓细胞HBsAg阳性的出现有集中于HBV高水平复制感染者中的倾向,同时更常见于HBV感染的较早时期。