基因芯片的制备方法

合成后点样的DNA微阵列分析cDNA微阵列和寡核苷酸芯片,点样方法主要是通过物理吸附或共价结合的方式将探针固定于载体上。本文归纳了近年来国内外文献报道的基因芯片的制备方法,展望了基因芯片的应用前景。     

用氨基修饰的载玻片制作cDNA微阵列

cDNA微阵列已在基因差异表达、寻找新基因等研究方面获得广泛应用,但有关cDNA微阵列的制作,目前多采用多聚赖氨酸修饰的载玻片为探针固定载体,固定效果较差.用氨基硅烷处理的载玻片为载体制作cDNA微阵列,然后考察其固定效率、检测灵敏度、稳定性、实用性等指标.结果表明,用氨基硅烷处理的载玻片具有比多聚赖氨酸更令人满意的核酸固定效率、检测灵敏度,且稳定实用.因此,用氨基硅烷修饰的载玻片为探针固定载体制作cDNA微阵列较为理想.     

蛋白芯片载体表面修饰对探针固定影响的研究

采用3-氨基丙基-三甲氧基硅烷((3-aminopropyl)trimethoxysilane,APTES)、戊二醛(glutaraldehyde,GA)、多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)修饰芯片载体表面,对3种不同修饰方法制备的蛋白质芯片进行对比研究。将Cy3标记羊抗鼠IgG固定在修饰后片基上,选择蛋白探针的固定率作为检测指标;将小鼠IgG作为探针固定在芯片上,靶蛋白为Cy3标记羊抗鼠IgG,通过生物芯片扫描仪检测反应后荧光强度,选择蛋白探针的反应性作为检测指标,探讨制备蛋白质芯片较佳的表面修饰方法。结果显示,戊二醛修饰玻片对蛋白固定较好,有较高的反应活性,检测限较宽,但背景噪声较高。     

蛋白质微阵列检测抗原-抗体相互作用

为了制备蛋白质微阵列和研究芯片表面抗原-抗体的相互作用,研究了如何在玻片表面固化蛋白质和用荧光染料（Cy3,Cy5）对蛋白质进行标记.结果表明,在醛基修饰的玻璃表面,通过共价偶联的方法将抗原或抗体固定到芯片表面,能使二者保持其特异性结合能力.同时,荧光标记后的抗原或抗体仍然具有特异性结合能力.蛋白质微阵列是通过机械手在玻片表面排阵制作的.芯片上的荧光信号获取采用了激光共焦荧光扫描系统.用不同浓度的抗原探针阵列,对其相应的抗体靶分子的特异性结合进行了分析和研究.此外,还通过在玻片表面固定兔IgG和固定鼠IgG,对羊抗兔和羊抗鼠抗体与其相应抗原的特异性相互作用进行了检测.     

DNA微阵列基片的化学处理

对于合成后点样的DNA微阵列 ,基片的表面化学处理非常重要。它直接影响到样品与基片的结合效率 ,进而影响杂交结果。基片表面的各种化学修饰方法多种多样 ,物理吸附主要以赖氨酸包被为主。共价结合通常使用同源偶联分子或异源偶联分子 ,还可以在基片表面组装线状、分支状连接分子或包被琼脂糖。着重介绍了DNA微阵列的制备 ,即样品如何固定到玻璃基片上。总结了不同类型基片表面的化学修饰方法以及DNA与基片的化学结合。     

文摘

30 0 12用于寡核苷酸芯片制备载体的醛基载玻片的制备方法优化及性质研究〔中〕/邹宗亮… //生物工程学报 .- 2 0 0 1,17(5 ) .- 4 98～ 5 0 2优化了醛基载玻片的制备方法 ,探讨了醛基修饰载玻片固定寡核苷酸探针的性质。研究发现氨基硅烷试剂的浓度是影响载玻片荧光背景的主要     

凝胶基片的制备与应用研究

在Bind-Silane^R处理的玻片上交联聚丙烯酰胺凝胶层(15mm×15mm×20μm),戊二醛活化。与末端氨基修饰的寡核苷酸片段共价结合制成芯片。这种芯片能够区分液相中序列不同的Cy3标记的目标核酸。与平面基片相比,凝胶基片具有背景低、固定探针量高、杂交时间短的优点。将细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、ANG、I-309和VEGF的单克隆抗体加样于凝胶基片上制成蛋白质芯片,对乳腺癌患者和正常人的血清进行检测,发现乳腺癌患者细胞因子IL-4、IL-5、I-309和VEGF的表达量高于正常人的表达量,对临床诊断具有重要的参考意义。     

介质表面修饰对蛋白质芯片固定率和反应性的影响

评价最常用的二种玻璃表面修饰方法对蛋白质芯片质量的影响．选择蛋白质的固定效率、反应性作为检测指标,对戊二醛修饰法和多聚赖氨酸修饰法进行比较,由机械手将探针蛋白质分别固定在两种玻片上,靶蛋白用荧光染料Cy3标记,两种修饰方法的芯片均可使蛋白质保持较好的固定效率和反应活性．由共价键偶联的醛基修饰玻片制备的蛋白质芯片不仅有更高的反应活性,而且图象佳,但背景偏高、用醛基修饰的玻片制备蛋白质芯片是较理想的选择、     

蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制备的条件优化

目的:建立一种以琼脂糖修饰的玻片为载体的蛋白质微阵列制备的优化方法,比较琼脂糖修饰玻片和醛基修饰玻片及氨基修饰玻片对蛋白质固定效率的优劣。方法:将羊IgG固定在载体表面,经过洗涤、封闭,再加入Cy3标记的兔抗羊IgG,孵育,洗涤后用共聚焦激光扫描仪获取图像,检测各点的荧光强度,根据荧光强度确定最佳琼脂糖浓度,最佳NaIO4浓度,最佳固定时间以及封闭时间等实验条件。结果:琼脂糖浓度为1.2％、NaIO4浓度为20mmol／L、固定时间为1h、孵育时间为45min时,蛋白质在载体上的固定效率和反应活性最高。在固定的抗体浓度相同的情况下,琼脂糖修饰玻片荧光强度是醛基修饰玻片的2.6倍,是氨基修饰玻片的9倍。结论:确立了蛋白质微阵列生产用琼脂糖修饰玻片制备的优化条件,用该优化条件制备的琼脂糖玻片更适合用于蛋白质微阵列载体。     

cDNA芯片表面核酸固定化的优化

cDNA芯片技术表面核酸固定化影响因素众多,其中涉及选择载体、固定于玻片的DNA片段浓度、玻片DNA片段的固定方法、玻片预处理方法、DNA片段的变性、溶解DNA片段的点样液等等.针对这些因素进行了优化筛选实验,以便于提高cDNA芯片技术检测基因表达的效率.     

用于寡核苷酸芯片制备载体的醛基载玻片的制备方法优化及性质研究

优化了醛基载玻片的制备方法 ,探讨了醛基修饰载玻片固定寡核苷酸探针的性质。研究发现氨基硅烷试剂的浓度是影响载玻片荧光背景的主要因素 ;2 %氨基化试剂处理 16min、戊二醛处理 30min可以得到荧光背景较低、固定效果较好的醛基载玻片。寡核苷酸固定过程中 ,末端氨基修饰没有明显的特异性 ,但是可以提高被固定探针的杂交容量。在较低的浓度 (小于 10 μmol L)时 ,探针的浓度与杂交信号趋近线性关系 ,浓度为 2 0 μmol L时杂交信号达到饱和     

核酸探针与酶免疫反应板定向结合的方法

为了制备一种可供寡核苷酸探针定向结合的酶免疫反应板, 利用部分水解的尼龙包被酶免疫反应板,通过尼龙所含的氨基基团与寡核苷酸探针所含的5′磷酸基团,在水溶性碳二亚胺的催化下,与酶免疫反应板发生5′端特异性定向共价结合, 并对肺炎支原体的PCR扩增产物进行了重复检测,结果重复性好,方法稳定.利用该方法制备的酶免疫反应板可用于核酸探针的临床检测.     

基因芯片技术筛选家蝇抗菌肽相关基因

用生物学软件对GenBank中部分昆虫抗菌肽基因编码区保守域设计探针, 用直接点样法将探针点印在特制玻片上构建寡核苷酸(Oligonucleotide, oligo)探针微阵列; 提取诱导后24 h的家蝇三龄幼虫脂肪体总RNA, 逆转录成cDNA并标记上荧光标记物Cy3, 与构建的oligo探针微阵列杂交, 经洗片、扫描处理后进行数据分析。结果在两次重复实验中均检测到有效杂交信号的基因点有15个(不包括阳性对照基因), 为进一步发现其新基因提供了依据。     

植物病毒检测芯片的杂交条件优化

利用芯片点样仪将5种侵染马铃薯的病毒/类病毒(苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒-卫星病毒、马铃薯病毒Y、马铃薯块茎纺锤状类病毒)的保守区寡核苷酸(Oligonucleotide,oligo)探针和PCR探针点样于玻片,并以植物18S rRNA作为内参照制成基因芯片。研究探针浓度、杂交时间、杂交温度以及点样液对芯片杂交的影响,并验证优化后病毒检测芯片的特异性。结果表明,寡核苷酸探针浓度介于5-20 ?mol/L之间对杂交信号强度影响不大,PCR探针浓度与杂交信号强度间呈线性关系;在45℃杂交4 h时,芯片的杂交信号最强,且该条件下进行杂交对两种探针芯片的影响趋势一致;点样液中以DMSO的杂交效果最好。经过整体条件优化后的两种探针芯片在杂交检测上具有较高的特异性,适于检测植物病毒。     

cDNA文库法在HCV-1b检测芯片研制中的应用

制备丙型肝炎病毒(HCV) 1b亚型诊断芯片并进行初步验证评价.采用cDNA文库法制备探针,用限制性内切酶Sau3AⅠ消化HCV 1b全长cDNA ,所得的酶切片段72℃补平加A ,AT克隆,PCR初步鉴定,并测序.将筛选出的片段打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片并进行杂交验证分析.运用cDNA文库法,得到2 2个大小相对一致(2 5 0～75 0bp)的基因片段.序列分析表明,均属于HCV 1b基因,可以作为诊断芯片探针;样品标记采用限制性显示(restrictiondisplay ,RD)技术,标记后进行杂交.杂交结果显示,样品和诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳.批内和批间精密度CV值分别为5 4 %和6 8% ,表明用cDNA文库法收集片段是一种快速、简便制备芯片探针的实用方法.     

DNA微阵列(或芯片)技术原理及应用

DNA微阵列或芯片(DNA microarray or chip)技术是近年发展起来的又一新的分子生物学研究工具.它是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针,或将液相合成的探针由微阵列器或机器人点样于尼龙膜或硅片上,再与放射性同位素或荧光物标记的DNA或cDNA杂交,用于分析DNA突变及多态性、DNA测序、监测同一组织细胞在不同状态下或同一状态下多种组织细胞基因表达水平的差异、发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域.     

三种寡核苷酸芯片片基的比较

将荧光标记的寡核苷酸打印在Corning、多聚赖氨酸包被的DAKO玻片和多聚赖氨酸处理的一种显微镜载玻片上,并按常规方法进行洗脱,通过GenePix4100A扫描并以Genepix6．0软件分析点的大小、荧光强度和背景荧光强度来衡量3种片基的均一性和固定效率,并通过不同浓度梯度的60bp寡核苷酸探针的杂交实验来衡量片基对杂交效率的影响．结果显示,3种片基的均一性都较好,而多聚赖氨酸包被的DAKO和Cornning芯片的固定效率和杂交效率优于国产芯片．     

聚丙烯酰胺凝胶固定核酸方法及其应用

固相核酸已被广泛用于DNA/cDNA微阵列、固相PCR及其它核酸与生物分子检测的传感技术中.和硬质玻璃载片相比,三维聚丙烯酰胺凝胶作为固定核酸的载体具有结合核酸容量高、利于反应的类似液相环境和较少的空间效应等优点.综述了丙烯酰胺凝胶作为固定核酸载体的发展历史.着重介绍了丙烯酰胺修饰核酸直接聚合固定的方法以及在DNA芯片、焦测序、固相PCR(克隆)、及全基因组测序等核酸分析中的应用.     

抗体和寡核苷酸双标记纳米金生物探针的制备及性能分析

基于纳米金粒子与抗体静电吸附作用,与硫醇修饰的寡核苷酸共价结合,建立一种新的双标记纳米金生物探针的制备方法.通过透射电镜（TEM）、紫外光谱、斑点免疫金渗滤法、免疫金银染色光镜观察法、荧光标记法等检测探针表征,及表面抗体活性情况和寡核苷酸的覆盖率,同时采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测寡核苷酸的存在.结果表明,纳米金粒子同时连接抗体和寡核苷酸后生物性能良好,且每个纳米金粒子（10±3）nm表面可覆盖寡核苷酸(92±20)条,双标记纳米金生物探针的制备具有简捷、稳定的特点.可作为一种新型探针应用于超微量蛋白质检测.     

应用限制性显示技术制备HCV cDNA诊断基因芯片的初步研究

制备丙型肝炎病毒 (HCV)检测芯片并进行验证、初步检测质量评价。采用限制性显示 (Restrictiondisplay ,RD)技术制备芯片探针 ,从载体pCV_J4L6S中切出HCV全长cDNA ,Sau3AⅠ酶消化 ,所得的限制性片段进行RD_PCR扩增 ,经聚丙烯酰胺电泳 (PAGE)结合银染法进行分离。切胶回收后作 3次PCR ,得到较纯净的HCVcDNA限制性片段。扩增后的产物克隆至pMD18_T载体进行快速鉴定。将筛选出的限制性片段打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片进行杂交验证分析 ,对芯片检测进行优化、初步的质量评估。运用RD技术 ,得到 2 4个 2 0 0～ 80 0bp、大小均一的基因片段 ,序列分析表明 ,均属于HCV特异基因 ,可以作为诊断芯片探针 ;杂交、测序结果显示 ,芯片检测的敏感性、特异性、准确度、重复性、线性等指标均佳。利用RD技术制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法 ;制备的诊断芯片可以用于检测HCVRNA ,具有敏感、检测结果较为可靠的优点。