玻璃表面cDNA微阵列的制备与优化

对DNA进行荧光标记,确定简单、实用和有效的固定化方法和筛选出合适的杂交条件,是制备DNA阵列的几个关键步骤。在PCR的过程对cDNA进行标记,不同的掺入比例可以得到不同的标记效率,Cye dye-dCTP/dCTP的比例在1：3－1：4较好。将DNA固定到玻璃表面,poly-1-lysine方法是一种不需要对DNA进行修饰的有效方法,其中UV照射的能量以600mJ效果最好;水合（rehydrate）温浴过程的温度以65℃最佳,在固化过程中所用探针的浓度0.2-0.5mg/ml对杂交信号影响不多,也就是芯片表面固定的探讨DNA应选在此范围内,杂交信号与所用的靶DNA的浓度成正相关,且有一定的范围内呈正比例关系。     

cDNA微阵列制作的优化

为了优化筛检cDNA微阵列中靶基因的最适长度、浓度及点样溶液的种类,设计持家基因betaactin和GAPDHRT PCR3对引物,产物长度在189～1078bp之间,以乙肝病毒DNA片段为阴性对照,扩增纯化后分别溶于3×SSC、50%DMSO及0.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH=9.0)中,调整浓度分别为0.5μg/μL、1.0μg/μL和1.5μg/μL,比较上述不同条件的杂交结果。结果表明,杂交具有较好的特异性,阴性对照(乙肝病毒)和空白对照(点样溶液)均未见杂交信号;3种长度的同一靶基因杂交信号强度无明显差别(betaactinP=0.378;GAPDHP=0.866);3种点样溶液中以50%DMSO杂交信号最好,较强且均匀一致(P=0.0001),其余2种差异不显著(P=0.142);3种浓度靶基因杂交信号差异不显著(P=0.648),浓度高者信号略强。短片段靶基因(200bp左右)可获得与长片段靶基因(1000bp以上)一样较好的杂交信号,点样溶液以50%DMSO效果最好,靶基因浓度为0.5μg/μL时即可得到较好的杂交结果。     

一种基于寡核苷酸微阵列芯片的多重可扩增探针杂交技术

多重可扩增探针杂交技术(multiplex amplifiable probe hybridization,MAPH)是近年来发展起来的一种用于基因组中DNA拷贝数检测的新技术。并发展了一种基于寡核苷酸微阵列芯片的MAPH技术。该方法根据所检测的DNA序列,制备若干具有通用引物的FCR产物作为可扩增探针组,与固定在尼龙膜上待测的基因组DNA杂交。用磁珠回收特异性杂交的探针,经生物素标记的通用引物扩增后,与相应的寡核苷酸微阵列芯片杂交。该特异性的寡核苷酸微阵列芯片包括10个抗肌营养不良基因的外显子探针和阴性、阳性探针。杂交清冼后,链霉亲和素-Cy3染色用芯片扫描仪得到杂交的荧光图像。分析荧光信号的强度差异给出特定基因片段拷贝数的变化。该方法用微阵列技术代替MAPH中的电泳检测技术,可大幅度增加检测的通量。选择了一个正常男性、一个正常女性和一个肌营养不良症患者的基因组DNA来进行验证。结果表明,该方法能够同时给出抗肌营养不良基因多个外显子中的基因片段拷贝数差异信息。     

安捷伦科技推出微阵列芯片新品

<正>安捷伦科技公司近日推出了一款高通量寡核苷酸微阵列芯片——GenetiSure预筛选试剂盒,该款产品应用于筛选第三天和第五天胚胎中单细胞中的非整倍体以及其他5~10 Mb范围内的基因组畸变。该款试剂盒可将从DNA提取到数据分析之间的运行时间缩短至八小时以内。此外,该款试剂盒包含的微阵列芯片可同时分析多达     

基因芯片技术与微生物学

基因芯片技术作为生物芯片技术一个发展最完备的分支,近十年来,已经成为国内外研究的一个热点,基因芯片可以分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片,cDNA芯片有多种制备方法,在基因表达相关研究方面具有重大价值;寡核苷酸芯片以美国Affymetrix公司的GeneChip为代表,主要应用于杂交测序,单核苷酸多态性分析和突变检测。本文分别对这两种芯片的制备,样品处理,杂交和信号检测分析技术作一综述。对近年来基因芯片技术在微生物学领域的应用进行了介绍。     

cDNA芯片阳性对照的制备及在芯片敏感性分析中的应用

cDNA芯片是一种高通量基因表达谱分析技术,在生理病理条件下细胞基因表达谱分析,新基因发现和功能研究等方面具有广阔应用前景。CDNA芯片阳性对照的选取以及CDNA芯片检测敏感性是芯片成功应用的关键问题之一。以在系统发育上与人类基因同源性小的荧火虫荧光素酶基因材料,制备了用于人类和其他动物基因表达谱CDNA芯片的通用型阳性对照探针和相应的mRNA参照物,经反转录对mRNA参照物进行Cy3荧光标记并与DNA芯片杂交后发现,mRNA参照物能特异性地与荧光酶基因cDNA片断杂交,而与人β-肌动蛋白基因,人G3PDH基因以及λDNA/HINDⅢ无杂交反应。把mRNA参照物以不同比例加入HepG2总RNA中,以反转录荧光标记后与CDNA芯片杂交,结果发现当总RNA中的MRNA含量为1/10^4稀释（即mRNA分子个数约为10^8个）时,CDNA芯片基本检测不出mRNA标记产物的杂交信号。而且,cDNA芯片检测的信号强度与芯片上固定的探针浓度密切相关,当探针浓度为2g/L时,杂交信号最强,随着探针浓度下降芯片的杂交信号趋于减弱。CDNA芯片通用型阳性参照物的制备以及应用于CDNA芯片检测敏感性研究为CDNA芯片应用于人和其他动物基因表达谱高通量分析和新基因功能研究提供了技术基础和理论依据。     

cDNA微阵列制作的优化

为了优化筛检cDNA微阵列中靶基因的最适长度、浓度及点样溶液的种类,设计持家基因beta actin和GAPDH RT-PCR 3对引物,产物长度在189～1 078 bp之间,以乙肝病毒DNA片段为阴性对照,扩增纯化后分别溶于3×SSC、50%DMSO及0.5mol/L碳酸盐缓冲液（pH=9.0）中,调整浓度分别为0.5μg/μL、1.0μg/μL和1.5μg/μL,比较上述不同条件的杂交结果。结果表明,杂交具有较好的特异性,阴性对照（乙肝病毒）和空白对照（点样溶液）均未见杂交信号;3种长度的同一靶基因杂交信号强度无明显差别（beta actin P=0.378;GAPDH P=0.866）;3种点样溶液中以50%DMSO杂交信号最好,较强且均匀一致(P=0.0001),其余2种差异不显著(P=0.142);3种浓度靶基因杂交信号差异不显著(P=0.648),浓度高者信号略强。短片段靶基因（200 bp左右）可获得与长片段靶基因（1 000 bp以上）一样较好的杂交信号,点样溶液以50%DMSO效果最好,靶基因浓度为0.5μg/μL时即可得到较好的杂交结果。 Abstract:To optimize and screen the most suitable target gene length,concentration and printing solution in cDNA microarray,housekeeping genes,such as beta actin and GAPDH,were selected as targets and hepatitis B virus gene as negative control.The RT-PCR primers that spanned at least one intron and whose products were at between 189 bp and 1 078 bp were designed with primer premier 5.0,so did the hepatitis B virus gene PCR primer.After polymerase chain reaction,the products were purified with ethanol and dissolved in 3×SSC,50% DMSO and 0.5mol/L carbonate buffer（pH=9.0）respectively.The concentrations of target genes were adjusted at 0.5μg/μL,1.0μg/μL and 1.5μg/μL.The hybridization signals had a good specificity.No signal showed in either negative control (HBV) or blank control (printing solution only).There was no significant difference in target gene lengths.The P value of beta actin (189 bp,491 bp,974 bp) and GAPDH (227 bp,552 bp,1 078 bp) was 0.378 and 0.866 respectively.There was no significant difference among concentrations（P=0.648）,too.However,the higher the concentration was,the stronger the signals would be.Among the three kinds of printing solution,50% DMSO was the best（P=0.0001）,while the other two had no difference by multi-comparison(P=0.142).The target gene at length between 200 bp and 1 000 bp has got the same hybridization signals.50%DMSO printing solution and the target gene concentration of 0.5μg/μl are suitable for good hybridization.     

应用cDNA微阵列研究肿瘤基因表达谱

随着研究水平的深入 ,对基因在发育过程中、生理反应中和疾病发展中表达上的时空差别 ,基因蛋白质产物的亚细胞定位和细胞分子间的相互作用等研究领域的开拓 ,所涉及到的基因的广泛性用传统方法研究已很难达到要求 ,因此一些新的研究方法应运而生 ,基因表达谱的研究即为其中之一。基因表达谱 ( ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ)是指细胞中所有基因表达的格局 ,具体说来就是指细胞中产生所有ｍＲＮＡ的总和。对于所有的ｍＲＮＡ来说 ,通常采用的研究方法是将其逆转录成ｃＤＮＡ ,通过构建ｃＤＮＡ文库 ,再进行分析研究。原先采用…     

用氨基修饰的载玻片制作cDNA微阵列

cDNA微阵列已在基因差异表达、寻找新基因等研究方面获得广泛应用,但有关cDNA微阵列的制作,目前多采用多聚赖氨酸修饰的载玻片为探针固定载体,固定效果较差.用氨基硅烷处理的载玻片为载体制作cDNA微阵列,然后考察其固定效率、检测灵敏度、稳定性、实用性等指标.结果表明,用氨基硅烷处理的载玻片具有比多聚赖氨酸更令人满意的核酸固定效率、检测灵敏度,且稳定实用.因此,用氨基硅烷修饰的载玻片为探针固定载体制作cDNA微阵列较为理想.     

cDNA芯片的重复性研究

cDNA芯片正在成为基因表达研究的常用方法,用此法通过一次杂交即可获得大量基因的表达信息[1,2]。目前,一些专业的生物芯片公司已推出部分cDNA芯片产品供研究者应用,然而,由于价格昂贵及受到其他一些条件的限制,国内众多研究者很难对芯片结果进行多次杂交验证,因此cDNA芯片的重复性就成为他们关心的问题,本实验对cDNA芯片用于基因表达研究的重复性进行了研究。１材料与方法１．１探针和cDNA芯片的制作按文献[3]中的方法合成R15Hp35T细胞的探针10μl,以荧光素Cy5-dCTP进行标记。同时制作含有61个基因的cDNA芯片,共10片。…     

cDNA微阵列在功能基因组学研究中的应用

cDNA微阵列是当前功能基因组学研究中的一种强有力的工具。由于微阵列能检测全基因组水平上的基因表达,它能帮助人们把研究对象作为一个整体进行研究。这正是以往孤立地研究特定基因的研究方式所不能比拟的。本文简要介绍了cDNA微阵列技术的发展渊源和大致的操作流程,侧重于原理和策略,突出了它与传统方法在思路上的不同之处,同时也分析了它目前的瓶颈和局限。最后,展望了其进一步发展的方向。     

cDNA微阵列技术在植物功能基因组学研究中的应用

cDNA微阵列 (cDNAMicroarrays)技术是近年发展起来的分子生物学研究新型工具 ,以分子杂交为基本原理 ,在检测植物基因表达水平、研究基因表达图谱、特异基因检测以及发现新基因和分离差异表达基因等方面有着独特的优势 ,已成为植物功能基因组学研究的重要手段。     

用于寡核苷酸芯片制备载体的醛基载玻片的制备方法优化及性质研究

优化了醛基载玻片的制备方法 ,探讨了醛基修饰载玻片固定寡核苷酸探针的性质。研究发现氨基硅烷试剂的浓度是影响载玻片荧光背景的主要因素 ;2 %氨基化试剂处理 16min、戊二醛处理 30min可以得到荧光背景较低、固定效果较好的醛基载玻片。寡核苷酸固定过程中 ,末端氨基修饰没有明显的特异性 ,但是可以提高被固定探针的杂交容量。在较低的浓度 (小于 10 μmol L)时 ,探针的浓度与杂交信号趋近线性关系 ,浓度为 2 0 μmol L时杂交信号达到饱和     

小鼠细胞因子相关基因表达检测寡核苷酸芯片的制备及分析

生物芯片技术用于基因表达谱研究是近年来发展起来的一项新技术 ,该方法本质上是基于对一玻璃片或膜表面上固定的ｃＤＮＡ或寡核苷酸的分子杂交 ,这一新技术可同时测定成千上万个基因的作用方式 ,几周获得的信息用其它方法可能要几年才能得到 ,是以定量方式同时监测大量基因相对表达的强有力的新方法[1 ,2 ] 。国内外目前主要采用ｃＤＮＡ芯片进行基因表达的检测 ,芯片制备所用的ＤＮＡ探针一般为已知基因ｃＤＮＡ克隆的ＰＣＲ扩增产物或ＥＳＴ的扩增产物[3～ 8] 。对基因的表达检测来说 ,ｃＤＮＡ芯片技术是一条非常适用的检测方法 ,但在有…     

寡核苷酸芯片在微生物检测中的应用

近几年来发展起来的基因组研究技术———基因芯片技术为微生物检测提供了一种强有力的手段。目前国内外已广泛地开展了利用寡核苷酸芯片对多种微生物 (主要是病毒和细菌 ,少量有真菌 )进行相关检测的研究 ,并在对微生物病原体检测、种类鉴定、功能基因检测、基因分型、突变检测、基因组监测等方面获得了成功。由于寡核苷酸探针具有可根据研究需要任意设计、特异性高等特点 ,寡核苷酸芯片在微生物检测中有着巨大的应用价值 ,具有广阔的应用前景。     

基因芯片的制备方法

合成后点样的DNA微阵列分析cDNA微阵列和寡核苷酸芯片,点样方法主要是通过物理吸附或共价结合的方式将探针固定于载体上。本文归纳了近年来国内外文献报道的基因芯片的制备方法,展望了基因芯片的应用前景。     

cDNA微阵列技术研究NaHCO3胁迫下星星草基因表达谱

为研究NaHCO3胁迫下星星草基因的表达,分别将荧光染料Cy5-dCTP和Cy3-dCTP用反转录方法标记在处理和对照星星草cDNA上制成探针,并与载有星星草基因的cDNA芯片进行杂交。通过对芯片的杂交信号强度分析来研究基因的表达情况。分析结果显示,共有25个基因在NaHCO3胁迫处理前后差异表达,其中17个基因在NaHCO3胁迫下表达下调,8个基因在NaHCO3胁迫下表达上调。生物信息学分析表明这些基因的功能涉及了信号传导与转录调控、细胞防御、细胞代谢等多个方面。从而获得了NaHCO3胁迫下星星草的基因表达谱,定量地阐述了NaHCO3胁迫和非胁迫条件下星星草基因的差异表达情况。     

黄热病病毒检测微阵列的研究制备

目的:制备黄热病病毒寡核苷酸检测微阵列.方法:根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出寡核苷酸探针用于制备基因芯片,克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因DNA经限制性显示技术扩增并标记,完成杂交后对芯片进行扫描和数据分析.结论:微阵列检测技术为检测黄热病病毒提供了一种早期、快速、可靠的方法,具有应用于临床检测的前景.     

检测绵羊BMPR-IB基因多态性寡核苷酸芯片的制备

FecB基因是控制中国美利奴羊排卵率和产羔数的主效基因,由于A746G的点突变而导致绵羊表型的变化。本研究的目的在于根据FecB基因的多态性,制备寡核苷酸芯片检测绵羊FecB基因的单核苷酸多态性（SNP）,设计六条特异性的探针,用基因芯片点样仪将探针点样到醛基修饰的载玻片上,采集绵羊的血液样本,在芯片反应舱中,检测FecB基因A746G点突变,设计对应的软件进行判读,分析检测结果,与PCR-RFLP检测结果完全符合,证明制备的寡核苷酸芯片可以并行、准确而高效地检测FecB基因的多态性,能够作为分子标记辅助选育多胎绵羊的一种合适的检测技术。     

cDNA微阵列技术:一种有效的差别表达基因克隆新方法

cDNA微阵列技术是以Northen印记杂交为基础,采用大规模集成电路点样技术的一种DNA杂交微阵列技术,是基因分离鉴定的最有效的方法之一。本通过对其原理和工艺流程的简单介绍,旨在对它在差别表达基因克隆中的应用作一小结。