猪瘟病毒的重组分析

以21株猪瘟病毒的编码序列作为研究对象,通过对基因树的比较和四重体分析,研究猪瘟病毒毒株间可能的重组关系。分析结果表明,ALD(D49532)与GPE-(D49533)问可能有一重组片段E0、E1和E2,而持续感染毒株CSFV39(AF407339)中的NS5A-NS5B可能来源于Shimen强毒株(AF092448),这说明不同猪瘟病毒极有可能在自然环境或减毒疫苗的应用过程中由于混合感染而发生遗传物质的交换,从而适应宿主环境的改变,并产生特殊的表型。     

猪瘟病毒C株共感染口蹄疫病毒影响口蹄疫病毒复制

【背景】猪瘟(Classical Swine Fever)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的猪高度接触性传染病,致死率极高。在临床中存在着CSFV与猪其他病原菌共感染的情况,例如CSFV与口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)的共感染。【目的】利用CSFV与FMDV共感染猪源宿主细胞,研究CSFV与FMDV共感染对FMDV病毒复制的影响。【方法】构建体外共感染细胞模型,在正常PK-15细胞上进行CSFV共感染FMDV实验,通过观察细胞病变效应(Cytopathic Effect,CPE)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western Blot、间接免疫荧光检测CSFV和FMDV共感染及FMDV单独感染情况下FMDV复制水平的差异。利用RT-qPCR筛选鉴定能够影响FMDV复制的CSFV蛋白。【结果】CSFVC株共感染FMDV能够抑制FMDV的复制,而且灭活的CSFV同样抑制FMDV的复制。通过筛选鉴定出CSFV的C蛋白能够抑制FMDV复制。【结论】研究发现CSFV C株共感染FMDV能够抑制FMDV复制,而其C蛋白具有抑制FMDV复制的能力。     

猪瘟病毒衣壳蛋白靶向核酸酶表达系统的建立及鉴定

根据猪瘟病毒衣壳蛋白(C)基因序列设计一对引物,RT-PCR扩增获得编码猪瘟病毒衣壳蛋白的C基因,将其插入到含有葡萄球菌核酸酶(SN)基因的真核表达载体pcDNA-SN中,筛选获得重组质粒pcDNA-C-SN。脂质体转染猪肾细胞(PK-15),并经G418稳定筛选,通过RT-PCR、免疫印迹和间接免疫荧光鉴定表达的融合蛋白,体外DNA消化试验检测核酸酶活性。结果表明融合蛋白C-SN在PK-15细胞中获得了稳定表达,能够被兔抗猪瘟病毒衣壳蛋白多抗所识别,并具有良好的核酸酶活性,能够对DNA进行切割。同时,稳定表达融合蛋白C-SN的PK-15细胞系中能够有效抑制猪瘟野毒的增殖,使其感染性降低102～103倍。这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于抵抗猪瘟病毒感染奠定了基础。     

猪瘟病毒基因表达谱芯片的可靠性研究

通过同种组织RNA自身比较实验及不同组织RNA的差异分析实验对猪瘟病毒(classic swine fever virus, CSFV)cDNA芯片实验的重复性进行检验.利用相关系数(correlationcoefficient, R)、变异系数(coefficientofvariation, CV)和假阳性率(falsepositiverate, FPR)分析猪瘟病毒cDNA芯片数据的可靠程度,对cDNA芯片实验数据作了整体的评估.结果证实,该芯片系统得到的猪瘟病毒cDNA表达谱数据相关系数一般大于0.9,假阳性率控制在2 %以内.另外,通过比较猪瘟病毒芯片制备中点样浓度、mRNA和总RNA以及不同标记过程对实验的影响,来分析猪瘟病毒芯片数据的系统误差来源,得出结果:重复两次实验,可以克服绝大部分实验系统引入的假阳性.     

非洲猪瘟病毒多基因家族研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性、致死性动物传染病.由于ASFV基因组庞大,变异能力强,免疫逃逸机制复杂,至今无有效药物和疫苗.近年来,对多基因家族的研究取得了很大的进展,可变区多基因家族拷贝数变化是导致ASFV变异的主要原因,且陆续发现多基因家族在决定细胞宿主范围、影响病毒毒力强弱、抑制Ⅰ型干扰素信号通路、抑制干扰素抗病毒效应和促进病毒蜱源感染中具有重要作用.本文对当前的ASFV多基因家族研究进展进行总结,阐述其在基因变异和病毒感染中的作用,以期为非洲猪瘟免疫逃逸机制的探索和疫苗的研发提供理论依据.     

猪瘟病毒与宿主天然免疫系统的相互作用

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起的一种高度接触性传染病,临床上以出血综合征与免疫抑制为主要特征。它在多个国家流行,给中国乃至世界养猪业造成巨大的经济损失。研究表明,猪瘟病毒感染能够诱导宿主的天然免疫应答,也能通过影响天然免疫效应分子的表达来抑制宿主的天然免疫功能。本文将对猪瘟病毒感染与天然免疫应答及其免疫抑制的现象与机理进行综述。     

猪瘟病毒的分子生物学研究进展

猪瘟病毒（Oassicalswinefevervirus,CSFV;或称Hogcholeravirus,HCV）,属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Peshvirus）［’1。CSFV与同属的牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiavims,BVDV）及羊边界病病毒（Botherdiseasevirus,BDV）在结构上有很高的相似性,在血清学上有交叉反应l‘］。感染猪可引起高热、皮肤变色、大量内出血等及神经系统症状［’］,死亡率很高。猪瘟病毒是世界上损害养猪业的重要病原之一l‘］。猪瘟病毒是有囊膜,直径40～60urn的正链RNA病毒［‘·’］．在蔗糖中浮力密度为l．12g／ml,沉降系数S…     

我国痘苗病毒疫苗株(天坛)25kb核苷酸序列及其与非疫苗株(WR)差异的比较

本文就我国痘苗病毒疫苗株(天坛株TT)基因组的Hind Ⅲ-L、J、I、N、M片段及部分K、F、A片段,共24765bp的核苷酸序列,采用Sanger的双脱氧末端链终止法进行了测定。其中L片段全长4123bp,J片段全长5010bp,I片段全长6498bp,M片段全长2221bP,N片段全长1567bp。总体上AT较为丰富(65.6％),其中A、T、C、G各占32.9％,32.7％,17.4％,17.0％。 TT诛的核苷酸序列与已发表的非疫苗株(WR株)基因组中相同区段的核苷酸序列进行了对比。结果表明,在所分析的序列中,两株病毒在核苷酸水平上有0.42％的差异;其中2/3为同-Py(T或C)或Pu(A或G)间的转换,而且位于病毒基因组中央区域的核苷酸序列的变异小于侧翼区,核苷酸的变异基本上没有造成开放读码框架(ORF)数量和编码容量的改变。     

22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的序列分析

RT－PCR方法获得了13株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的拉增片段,并对其进行了测序,得到了251bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中224bp的片段进行了序列分析,并与已发表的Alfort、Brescia等毒株进行比较,结果13株猪瘟分离株所测片段均为猪瘟病毒E2基因的序列,与石门系强毒的序列相比所有毒株的碱基替换随机地分布于整个序列,无碱基缺失和碱基插入。其中变化较大的区域位于序列的3′端。2 2株HCV E2基因部分编码序列的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为78.1%-100%、78.4%-100%,其中13株猪瘟病毒流行毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为:78.1%-100%、78.4%-100%,4株70－80年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为：79.0%-88.3%、81.1%-87.8%,9株90年代分离的毒株的核苷酸及氨基酸同源性范围分别为：90.3%-100%、83.8%-100％;说明猪病毒流行株的变异呈现一定的多样性。     

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的非洲猪瘟病毒微滴数字PCR检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒核酸的2段保守序列(VP72和K205基因)设计合成了3对引物和探针,摸索其反应条件,优化方法,比较方法的线性、特异性、灵敏性和重复性。结果发现,这3对引物和探针的非洲猪瘟病毒方法检出限均小于6拷贝数/反应,在10～106拷贝数/反应之间均呈良好的线性关系,定量范围内的检测变异系数均低于15%,且不与猪常见的2种病毒发生交叉反应,适用于猪肉及其制品中非洲猪瘟病毒的检测,有利于在源头、食品加工、食品销售等各个环节加强对生鲜猪肉及各类猪肉制品中非洲猪瘟病毒的检测,切实降低潜在风险。     

双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建

以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库.以管家基因α-tublin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达2 10倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到pGEM-T载体,PCR检测显示差减片段在250bp～2 000bp之间.该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进一步鉴定和克隆差异表达基因打下了坚实基础.     

猪瘟病毒的遗传多样性与进化

猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种严重危害全球养猪业的烈性传染病,是被OIE列为必须通报的动物疫病之一。基于病毒基因组片段核苷酸序列的系统进化分析,将猪瘟病毒分为3个基因型(基因1~3型)和11个基因亚型(1.1~1.4、2.1~2.3和3.1~3.4)。不同基因型或基因亚型病毒株的流行与进化受到了时空、宿主动物和猪瘟防控策略的制约。欧洲流行的猪瘟病毒株从20世纪70年代由基因1型转变为基因2型,其中该地区野猪群中流行的毒株属于基因2.2和2.3亚型,拉丁美洲国家流行的猪瘟病毒株一直为基因1型,韩国和我国台湾流行的毒株在20世纪末由基因3型转换为基因2.1亚型。随着鉴定的基因2.1亚型毒株的增加,该亚型可进一步划分为3个亚亚型(2.1a~2.1c),这3个亚亚型的毒株在我国都有流行,其中2.1b是我国流行的优势毒株。研究表现突变是促进猪瘟病毒进化的主要动力,同时,同源重组和准种在猪瘟病毒进化过程中也扮演了一定角色。综上所述,对猪瘟病毒流行毒株进行遗传与进化分析可以追踪病毒的来源和掌握该病毒的流行现状以及进化规律,为有效防控猪瘟的发生与流行提供理论指导。     

双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建

以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库.以管家基因α-tublin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达2 10倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到pGEM-T载体,PCR检测显示差减片段在250bp～2 000bp之间.该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进一步鉴定和克隆差异表达基因打下了坚实基础.     

六种检测猪瘟病毒方法的比较

【目的】本研究旨在比较6种检测猪瘟病毒方法的优缺点。【方法】应用病毒分离、胶体金免疫层析试纸条、抗原捕捉ELISA、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、TaqMan荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)和反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)等6种方法,分别对50份疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)进行检测。【结果】结果表明:RT-qPCR和RT-LAMP方法检出阳性样品数为13份,RT-PCR为11份,病毒分离为10份,抗原捕捉ELISA为9份,胶体金试纸条为8份;6种方法均检测为阳性8份,均为阴性37份。【结论】结果提示,在对猪瘟病毒进行检测时,RT-qPCR、RT-LAMP和RT-PCR由于其灵敏性高,可作为首选检测方法,但操作时需要避免假阳性的出现;病毒分离方法虽然操作繁琐,但结果准确,是确诊猪瘟必不可少的检测方法;抗原捕捉ELISA和胶体金试纸条检测时间较短,由于其敏感性较低所限,主要用于对畜群进行检测,不适合个体检测。     

猪瘟病毒糖蛋白E^rns中和表位的鉴定和比较

猪瘟病毒 (CSFV)囊膜结构糖蛋白Erns(gp4 8)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的第二抗原蛋白。E2和Erns与细胞表面受体的相互作用介导CSFV感染细胞的过程。Erns具有RNA酶活性 ,影响病毒自身复制并涉及对病毒的中和效应。采用抗CSFValfortT櫣ｂｉｎｇｅｎ毒株Ｅｒｎｓ糖蛋白的 1B5 ,b4_2 2和 2 4 16单克隆中和抗体 ,筛选噬菌体展示的 12肽随机肽库 ,进行Erns中和表位的鉴定和比较 ,获得分别针对 1B5、b4_2 2和 2 4 16单克隆抗体的 3个主要中和表 (拟 )位基序WxNxxP、DKNR (Q)G和A(T)CxYxKN ,分别定位于Erns的 35 1位～ 35 6位或 348位～ 35 0位、384位～ 386及 32 2位～ 32 3位、380位～ 386位氨基酸区域。分析表 (拟 )位基序与单克隆抗体的免疫反应性差异。b4_2 2和 2 4 16单克隆抗体识别基序存在共有序列KN ,识别Erns中的相似抗原区 ,但其侧翼序列及免疫印迹、免疫荧光抗体抑制试验结果均存在显著差异     

22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的序列分析*

利用RT PCR方法获得了 1 3株猪瘟病毒分离株、石门系强毒、中国C株及法国温度敏感株Thiverval株的E2基因部分编码序列的扩增片段 ,并对其进行了测序 ,得到了251bp的E2基因部分编码序列。利用DNAStar软件对其中224bp的片段进行了序列分析 ,并与已发表的Alfort、Brescia等毒株进行比较 ,结果 1 3株猪瘟分离株所测片段均为猪瘟病毒E2基因的序列 ,与石门系强毒的序列相比所有毒株的碱基替换随机地分布于整个序列 ,无碱基缺失和碱基插入。其中变化较大的区域位于序列的 3′端。     

猪瘟病毒的形态结构与形态发生

建立了猪瘟病毒(CSFV)弱毒疫苗Thiverval株(T株)与中 国兔化弱毒疫苗C株在MPK细胞中的感染模式。使用MPK细胞增殖CSFV,其病毒滴度明显提高,从而为应用电镜超薄切片技术研究猪瘟病毒的形态结构与形态发生提供了可能性。猪瘟病毒呈圆形颗粒,直径约为70nm。其内部是电子致密的核心,直径约为40nm,有时呈六角形;外有包膜包裹。在CSFV感染的MPK细胞质中,可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。此外,猪瘟病毒的感染能够引起某些宿主细胞超微结构上的变化。     

非洲猪瘟病毒编码蛋白功能研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪或野猪引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病,其特征是病程短、高热和出血性病变,急性感染死亡率高达100%,严重威胁全球养猪业但目前尚未开发出有效的疫苗和治疗方法。ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员,为大型双链DNA病毒,主要在巨噬细胞胞质中复制,其基因组约170?193 kb,含有150?167个开放阅读框,编码150?200种蛋白质。目前已知功能的病毒编码蛋白约有50个,大部分为病毒的结构蛋白,仍有一半以上的ASFV编码蛋白功能尚不清楚。除结构蛋白以外,病毒含有完整的酶和与病毒转录有关的因子,编码调节宿主细胞功能及与病毒免疫逃逸相关的蛋白等。本文综述了ASFV的结构蛋白、非结构蛋白以及参与免疫逃逸等相关蛋白功能的研究进展,以期为ASFV病毒蛋白研究及疫苗研发提供相关借鉴。     

猪瘟病毒感染性cDNA克隆的构建及其致病性

为了建立研究猪瘟病毒的技术平台,利用RT-PCR技术构建了猪瘟病毒中国石门株(Shimen)的全长有感染性cDNA克隆pT7SM。通过体外转录线性化的pT7SM并将转录的RNA转染至PK-15细胞中,获得了猪瘟病毒粒子。再用间接免疫荧光法测定了其生长曲线,通过电镜观察到重组病毒呈球形,具有囊膜结构。进一步把获得的猪瘟病毒粒子感染非免疫实验猪,结果子代病毒与石门株类似,对非免疫实验猪有强烈的致病性,证明该全长cDNA克隆可靠稳定,忠实地保留了石门株病毒的感染性和致病特征。由此为进一步探讨猪瘟病毒的致弱机制及病毒与机体相互作用的机制打下了良好的基础。     

猪瘟病毒与宿主细胞间的相互关系

猪瘟病毒(CSFV)是一种正链RNA病毒,在培养细胞中增殖力弱,滴度低,通常不使培养细胞产生病理变化;而感染猪导致的猪瘟发病迅速,死亡率高。本文综述了近年来在CSFV增殖过程、与宿主细胞间的相互作用方面的研究进展,并对CSFV与细胞凋亡间的关系进行了探讨。