在GPD1中整合表达蜜二糖酶基因改善酒精发酵水平*

依据同源重组的原理将来源于粟酒裂殖酵母的α-半乳糖苷酶基因m el整合到工业酿酒酵母染色体的甘油合成途径关键酶基因GPD1中,通过G418抗性筛选得到重组子。实验数据表明,重组子S.cerevisiaeMG1利用蜜二糖的能力显著提高,产甘油能力下降。引入外源基因后酵母性状与亲代相比没有显著差异,但生长时具自絮凝能力。MG1分别以玉米粉、小麦淀粉为原料进行浓醪酒精发酵,与亲代工业酿酒酵母比较,发酵液乙醇浓度得到提高,甘油含量降低,蜜二糖消耗殆尽。     

在GPD1中整合表达bglⅡ基因改善酒精发酵

依据同源重组的原理将来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因bglⅡ整合到工业酿酒酵母染色体上的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1中,通过G418抗性筛选得到重组子。实验数据表明,重组子Saccharomyces cerevisiaeCG1利用纤维二糖的能力显著提高,产甘油能力下降。引入外源基因后酵母性状与亲代相比没有显著差异,但生长时具自絮凝能力。当S·cerevisiaeCG1以玉米粉为原料进行浓醪酒精发酵,与亲代工业酿酒酵母比较,发酵液乙醇浓度得到提高,甘油含量降低,纤维二糖含量显著减少。     

在GPD1中整合表达bglⅡ基因改善酒精发酵*

依据同源重组的原理将来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因bglⅡ整合到工业酿酒酵母染色体上的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1中,通过G418抗性筛选得到重组子。实验数据表明,重组子Saccharomyces cerevisiae CG1利用纤维二糖的能力显著提高,产甘油能力下降。引入外源基因后酵母性状与亲代相比没有显著差异,但生长时具自絮凝能力。当S.cerevisiae CG1以玉米粉为原料进行浓醪酒精发酵,与亲代工业酿酒酵母比较,发酵液乙醇浓度得到提     

木酮糖激酶基因整合表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

【目的】以载体p406ADH1为构建骨架,构建一个酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株的整合表达载体。【方法】通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为筛选标记的G418抗性基因KanR,用于基因表达的ADH1终止子片段,酿酒酵母W5自身木酮糖激酶基因,18S rDNA介导的同源整合区,插入到骨架质粒p406ADH1中,得到多拷贝整合表达载体pCXS-RKTr。将该载体线性转化酿酒酵母后,对转化子中木酮糖激酶酶活进行测定,检测其表达情况。【结果】重组质粒在酿酒酵母体内实现了木酮糖激酶的高水平稳定表达,其酶活力是初始菌株的2.87倍。【结论】本实验构建了一个酿酒酵母工业菌株整合表达载体,并用此载体过表达了其自身的木酮糖激酶基因。该重组质粒载体的构建可以有效解决酿酒酵母中自身木酮糖激酶酶活较低的情况,这为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建和其它酵母重组质粒载体的构建奠定基础。     

克隆木糖还原酶XYL1基因的工程菌YT发酵玉米芯水解液的研究

克隆毕赤氏酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶基因XYL1,将其连接到适用于酿酒酵母工业菌株的多拷贝载体pYMIKP中,构建得到表达质粒pYMIKY-XYL1,转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6508.利用G418筛选转化子,得到含高拷贝木糖还原酶基因的酿酒酵母重组菌YT,以YT发酵玉米芯工业水解液生产木糖醇,研究其发酵特性和规律,为工业上生物转化法生产木糖醇提供参考.     

CUP1为筛选标记的酿酒酵母整合型多基因表达载体的构建

为了赋予工业酿酒酵母对淀粉和纤维素的降解活性,提高酿酒酵母对粗木薯粉进行酒精发酵时的酒精产率;另一方面,为了解决工业酿酒酵母不适于使用营养缺陷型筛选标记对转化子进行筛选的问题,以及避免引入抗药性标记基因带来的安全性问题,构建了以抗铜蛋白基因CUP1为筛选标记的酿酒酵母整合型多基因表达载体.以载体pYES2-PMF-rDNA为基础,以新的筛选标记基因CUP1替换原有的尿嘧啶Ura-基因,得到载体pYES2M.再顺序插入葡聚糖内切酶基因eg3、葡萄糖淀糖酶基因gal和β-葡萄糖苷酶基因bgl1,构建得到以CUP1为筛选标记的酵母整合型三价表达载体pYES2M-eg3-ga1 -bgl1,其中每个基因都具有独立而完整的表达盒,包括启动子、信号肽和终止子,从而实现多基因单表达载体一次转化.     

嗜热细菌木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母中的高效表达

采用PCR技术克隆得到嗜热细菌Clostridium thermohydrosulfuricum木糖异构酶(xylose isomerase XI)基因xylA,将该基因连接于酵母表达载体pMA91的磷酸甘油激酶(PGK)启动子下,得到重组质粒pBX1。通过LiAc完整细胞转化法将重组质粒转移至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158受体菌中,得到重组酵母转化子H612,酶活测定结果表明,成功地在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达。SDSPAGE电泳结果显示出明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD。由酿酒酵母重组子H612产生的木糖异构酶最高酶活条件与其在自然状态下的一致,均为85℃,pH70,在这一条件下酶的比活力为10U/mg蛋白,而在接近酵母最适生长温度的30℃和40℃时,其相对酶活分别下降37%和11%。研究结果显示在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达,为进一步在酿酒酵母菌中建立新的木糖代谢途径打下了基础。     

长枝木霉eg1基因的克隆及表达

从长枝木霉3.1029基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI基因,该基因全长1 566 bp,由3个外显子2个内含子组成,编码461个氨基酸,编码蛋白的N端为22aa组成的信号肽。采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1,构建成pYE-Leg1重组质粒;同时将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载体pYEα中,构建成pYEα-Leg1重组质粒;分别转化酿酒酵母。重组转化子经β-半乳糖诱导,检测表达产物的酶活,结果表明,pYE-Leg1转化子无明显胞外酶活;而pYEα-Leg1转化子在刚果红平板上可产生明显的水解圈,酶活检测显示pYEα载体可有效地将该基因在酿酒酵母中表达并分泌到胞外,发酵液中的酶活在培养96 h达到最高1.16 U/mL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为5.6。以上研究将为利用酿酒酵母生产胞外纤维素酶提供依据。     

MHF组蛋白折叠复合体组分编码基因MHF1过表达对重组酿酒酵母纤维素酶生产的影响

【背景】重组酿酒酵母可用于生产多种药用蛋白和工业酶等外源蛋白,但蛋白分泌水平低是限制其异源蛋白高效生产的重要因素。异源蛋白表达和分泌过程可能会对宿主细胞产生多种胁迫,因此,研究胁迫响应相关基因对重组酵母异源蛋白生产的影响具有重要意义。Mhf1p是MHF组蛋白折叠复合体的组分之一,与DNA损伤修复及维持基因组稳定性有关,但其对异源蛋白生产的作用尚不清楚。【目的】研究MHF1过表达对重组酿酒酵母蛋白生产的影响。【方法】在分泌表达纤维素酶的重组酿酒酵母菌株中利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术整合过表达MHF1,分析其对产酶的影响,并探讨影响产酶的分子机理。【结果】与出发菌株相比,过表达MHF1菌株的外切纤维素酶CBH酶活性提高了38%。对过表达MHF1的CBH生产菌株中蛋白合成和分泌途径相关基因转录水平进行检测,发现与对照菌株相比,CBH1基因和与分泌相关的SEC22、ERV29等基因在不同时间点呈现不同程度显著上调。【结论】MHF1过表达可促进酿酒酵母异源外切纤维素酶的生产,并影响外源酶基因和分泌途径基因的表达,可能通过对多基因的协同表达影响促进产酶。     

产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因（CgGPD）功能分析

【目的】从高产甘油生产菌株产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）基因组中克隆了NAD+依赖3-磷酸甘油脱氢酶编码基因（CgGPD）,但是该基因及其上游调控序列具体的功能还是未知的。本文研究了CgGPD基因及其上游调控序列的功能。【方法】本文以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及其渗透压敏感型突变株为宿主,构建3种不同的酵母表达载体导入酵母细胞,研究了不同酵母转化子在渗透压胁迫条件下CgGPD基因表达对细胞的耐高渗透压胁迫应答及其细胞的甘油合成能力的影响。【结果】实验结果表明无论是以来源于S. cerevisiae 的TPI启动子还是来源于CgGPD基因的启动子,过量表达CgGPD基因的转化子均能够显著加速葡萄糖消耗速度和提高甘油合成能力,在gpd1/gpd2突变株中表达CgGPD基因能够消除细胞对外界高渗透压的敏感性,同时转化子胞内甘油大量积累。【结论】CgGPD基因在野生型酵母S. cerevisiae W303-1A表达显著提高细胞的甘油合成能力,在gpd/1gpd2突变株中能够互补GPD1基因的功能,CgGPD基因表达受渗透压诱导 调控。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism