用P. pastoris的pAOX1表达系统表达木糖异构酶

目的:应用P. pastoris的pAOX1表达系统分泌表达重组木糖异构酶.方法:用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增木糖异构酶基因(xi).用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切将其基因克隆进P. pastoris表达载体.通过电转法将其木糖异构酶基因重组于P. pastoris基因组,筛选G418抗性700μg/ml的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-xi).在摇瓶中发酵用甲醇诱导表达重组木糖异构酶.用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,用糖酵解法对表达产物进行活性分析.结果:木糖异构酶基因在pAOX1的调控下,在P. pastoris中经甲醇诱导能分泌表达,摇瓶发酵2d表达量为35mg/L,表达产物具有代谢木糖的作用.结论:成功地克隆了大肠杆菌的木糖异构酶基因,并实现用pAOX1系统在P. pastoris中表达中木糖异构酶,为用P. pastoris规模化生产重组木糖异构酶奠定了基础.     

用毕赤酵母组成型分泌表达Canstatin-N

目的:用毕赤酵母的GAP启动子调控组成型表达Canstatin-N。方法:将canstatin-N基因重组于毕赤酵母表达载体pGAP9K的多克隆位点获得pGAP9K-can-N。用电转法将pGAP9K-can-N转化毕赤酵母GS115。筛选高G418抗性的克隆作为工程菌GS115(pGAP9K-can-N)。发酵GS115(pGAP9K-can-N)分泌表达Canstatin-N,用离子交换法纯化目标蛋白。结果:以葡萄糖为碳源,发酵48h分泌表达人血管能抑素蛋白56 mg/L。结论:用毕赤酵母的GAP启动子调控组成型表达的人血管能抑素蛋白具有诱发血管内皮细胞凋亡的生物活性。     

钙网蛋白-N58在毕赤酵母中的表达及活性分析

目的：利用毕赤酵母表达系统表达Calreticulin-N58蛋白。方法：利用重叠延伸PCR方法合成Calreticulin-N58基因,构建成分泌型的重组表达载体pPIC9K-CRT-N58。该重组表达载体经SacI线性化后,电激转化入毕赤酵母GSll5,经MD板和不同浓度G418筛选得到多拷贝重组菌株。经甲醇诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,在鸡胚中进行活性分析。结果：重组质粒pPIC9K-CRT-N58在毕赤酵母中经甲醇诱导能分泌表达CRT-N58蛋白,摇瓶表达量大约为60mg／L,纯化的目的蛋白有显著的血管生成抑制作用。结论：实验成功地在毕赤酵母表达系统中实现了Calreticulin-N58的分泌表达。为Calreticulin-N58蛋白的进一步药用研究奠定了基础。     

人可溶性gp190在酵母Pichia pastoris中的表达

人可溶性gPl90(sgp190)是白血病抑制因子(LIF)的可溶性受体,可能在LIF行使众多生物学功能中扮演着重要的角色。为获得这一蛋白以研究它在人体内的生物学活性,在酵母Pichia pastoris中实现了重组sgp190分泌表达。利用基因重组技术,将编码人可溶性gP190(LlF受体α亚基gP190胞外区)cDNA克隆到毕赤酵母Pichia pastoris分泌表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-sgp190。原生质体法转染Pichia pastoris GS115菌株,经过G418筛选,得到了高效分泌表达sgp190蛋白的毕赤酵母菌株GS115／pPIC9K-sgp190,sgp190蛋白占摇瓶培养表达上清中总蛋白质的26％。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约125kD,具有免疫活性。对sgp190体外活性分析表明它能够抑制LIF诱导滋养层细胞分泌hCG。     

工程菌P.pastoris GS115(pPIC9K-lac2)的构建及诱导表达漆酶的研究

用PCR法扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因lac2.构建表达质粒pPIC9K-lac2.通过电转法将lac2基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性和高表达漆酶的转化子作为工程菌GS115(pPIC9K-lac2).在发酵罐中发酵GS115(pPIC9K-lac2)表达重组蛋白.在50 L发酵罐中加入20 L无机盐发酵培养基.在发酵的第一阶段连续24 h补加50％甘油-0.8％ PTM4增殖P.pastoris,然后用甲醇-0.8％ PTM4诱导49 h.在发酵过程中,通过调节搅拌的频率和通气量,将溶氧维持于20％ ～30％,用氨水维持pH 5.0.放罐时生物量为A600=266.5,表达漆酶1097.5U/L发酵液.     

解脂耶氏酵母脂肪酶基因lip1的克隆、密码子优化及功能表达

摘要：【目的】克隆解脂耶氏酵母（Yarrawia lipolytica）脂肪酶基因lip1,并通过密码子优化,首次实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的诱导型和组成型表达。【方法】通过PCR扩增Y. lipolytica脂肪酶基因lip1,根据P. pastoris密码子偏爱性,运用重叠延伸PCR合成改造后基因MLip1,将其分别克隆至诱导型分泌载体pPIC9K和新构建的组成型分泌载体pGAP9K上,电转至P. pastoris GS115中,G418抗性筛选得到高拷贝转化重组子,摇瓶发酵     

Gassericin T基因的合成及其组成型表达载体的构建

目的:构建Gassericin T基因毕赤酵母(Pichia pastoris)组成型表达载体。方法:根据乳酸菌素Gassericin T的基因序列,把Gassericin T的结构基因gatA编码的氨基酸的密码子转换成P.pastoris偏爱的形式,设计了6条59nt的寡聚核苷酸引物,通过3次连续PCR反应,获得了250bp左右的gat A片段(简称gat基因)。应用PCR方法从P.pastoris染色体中扩增了GAP启动子,大小为500bp左右,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的pAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将合成的gat基因克隆到pGAP9K质粒的多克隆位点中。结果:获得的gat及gap基因与预期结果一致,序列无碱基突变,构建的表达载体pGAP9K-gat经PCR、酶切鉴定完全正确。结论:成功构建了Gassericin T基因P.pastoris组成型表达载体,为下一步高效表达Gassericin T蛋白,进一步研究其作用机理及应用价值打下基础。     

用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素

为探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕节酵母(P．pastortis)中组成型表达外源蛋白的可能性,应用PCR方法从P．pastoris染色体中扩增了GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将人血管抑制素(AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点,获得含As基因的重组质粒pGAP9K-AS。转化P．pastorisGSll5,对获得的高拷贝转化子P．pastorisGSll5(pGAP9K-AS)进行组成型表达,同时以诱导型转化子P．pastoris GSll5(pPIC9K-AS)作为对照。SDS-PAGE结果显示：组成型转化子于培养4d后AS的表达水平已达到高峰,分泌量为58mg／L;而诱导型转化子诱导4d后表达的AS仅是组成型表达的70％,诱导6d后达到高峰,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时(4d)的86％。CAM分析和抗癌实验结果显示：P．pastortis GS115(pGA．P9K-S)和P．pastoris GS115(pPIC9K-AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C57BL／6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长,其平均瘤重抑制率分别达到90．61％和90．54％。以上结果表明,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点,PGAP可以取代PAOX1在P．pastoris中表达AS及其他外源蛋白。     

高密度发酵P.pastoris诱导表达葡聚糖外切酶

目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统表达CBH Ⅱ酶.方法:PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因.将其克隆进P.pastoris表达载体pPIC9k,电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆为工程菌.重组CBH Ⅱ酶的生产是在50 L生物反应器中进行.连续24h补加甘油-PTM4增殖细胞,然后用甲醇诱导表达64h.结果:放罐时生物量为A600=180,重组CBHⅡ产量为80mg/L.表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性.结论:实现应用pAOX1表达系统在生物反应器中高密度发酵P.pastoris诱导表达CBH Ⅱ.该研究为重组CBH Ⅱ的规模化生产打下基础.     

人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株.方法根据表达系统的密码子偏好性优化CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1 800bp)和CP(100bp)基因,将HSA-CP融合基因双酶切后插入分泌表达栽体pPIC9K中,重组质粒pPIC9K-HSA-CP经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut 转化子.PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达.结果融合基因约为1 900bp,序列测定正确.SDS-PAGE分析表明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Western blot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和CP的杂合分子.结论实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用.