广东省10株乙型脑炎病毒的分子特征研究

了解广东省目前流行的乙型脑炎病毒的基因型别,以及新分离毒株与P3和SA14-14-2疫苗株E蛋白的氨基酸差异,推测疫苗株的可能保护效果。本研究对广东省2017年从蚊虫和蠓虫标本分离的10株乙型脑炎病毒基因组序列测定,利用MEGA软件登录GenBank下载乙型脑炎病毒代表株序列并绘制进化树,同时用ClustalW2软件与疫苗株进行氨基酸同源性比对和E蛋白的序列分析。10株乙型脑炎病毒均属基因I型GI-b组,但分别位于2个不同的、小的进化分枝中。10株新分离病毒与P3和SA14-14-2疫苗株的E蛋白氨基酸同源性分别位于97.40%~97.60%和97.20%~97.40%之间。E基因区段500个氨基酸中,P3株与新分离乙型脑炎病毒株之间共存在17个氨基酸位点的差异(包括12个共同氨基酸的改变),略高于SA14-14-2疫苗株的16个氨基酸位点变异(包括11个共同氨基酸的改变)。其中在DI区的P3和SA14-14-2株分别有1个和3个共同氨基酸变异,DⅡ区各有5个共同氨基酸改变,DⅢ区分别有5个和2个共同氨基酸改变,结构域之外各有1个共同氨基酸的变异。绝大多数变异发生在非关键位点,只在E306和E388处观察到的氨基酸位点变异与疫苗P3株关键位点的改变有关,这两个位点(G306E,E388G)均发生在DⅢ区,而疫苗SA14-14-2未观察到关键位点的改变。总之,广东省流行的乙型脑炎病毒基因型别可能已由Ⅲ型变为I型;疫苗SA14-14-2株及P3株与新分离毒株均具有很高的同源性,绝大多数关键氨基酸位点未发生变异,对新分离病毒均具有良好的免疫保护价值。     

不同年份生产的乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2基因稳定性研究

为了研究不同年份生产的乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因稳定性,从分子水平控制乙型脑炎减毒活疫苗质量,确保疫苗安全性,本研究分析了不同年份生产的乙脑活疫苗病毒E蛋白基因核苷酸序列及编码的氨基酸序列,并与该疫苗原始种子、主种子、工作种子、乙脑病毒强、弱毒株进行比较。结果显示不同年份生产的乙脑活疫苗病毒E蛋白基因核苷酸序列与其原始种子、主种子、工作种子和基因库中登录的乙脑病毒弱毒株SA14-14-2的相应序列完全一致,与乙脑病毒强毒株SA14的E蛋白氨基酸序列比较有9个位点氨基酸发生了改变。不同年份生产的乙脑活疫苗病毒E蛋白基因稳定性表明该疫苗质量稳定、安全。     

陕西省9株乙脑病毒的分离及E基因序列分析

分析陕西省分离的9株乙脑病毒基因组序列特征。使用乙脑病毒全基因组序列测定引物进行RT-PCR扩增,扩增产物进行测序,拼接后获得基因组序列。利用MEGA 4.1、MegAlin、MEGA7.0等软件进行毒株的系统进化分析,并与P3株、减毒活疫苗SA14-14-2株及覆盖5个基因型别的其他乙脑病毒进行E基因序列比对。9株分离株3株分离自猪舍、6株分离自羊舍,其中4株获得全基因组序列,5株测得E基因序列。基于E基因序列进行毒株核苷酸、氨基酸同源性比较,结果显示分离株均与基因I型GI-b亚型毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性范围为96.5%～99.7%、氨基酸同源性范围99.2%～100.0%;与SA14-14-2株核苷酸同源性范围为87.5%～88.9%、氨基酸同源性范围96.3%～97.2%;与P3株核苷酸同源性范围为87.6%～88.1%、氨基酸同源性范围96.7%～97.6%。分析09年（陕南地区）分离株与18年（关中地区）分离株的E基因核苷酸差异率为1.8%～2.9%、氨基酸差异率为0%～0.8%。陕西省自然界中循环的乙脑病毒以基因Ⅰ型为主,与P3株在抗原毒力关键位点无差异,...     

乙型脑炎病毒减毒中间株SA14—12—1—7基因组全序列的测定

本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA14 12 1 7株进行全序列测定和分析 ,进一步了解乙脑活疫苗减毒及其稳定性的分子机制。根据已发表的SA14 14 2株及SA14 株的序列 ,设计 6对重叠引物 ,涵括整个乙脑病毒的基因组 ,通过RT PCR扩增出SA14 12 1 7株的各cDNA片段 ,分别克隆到pGEM T载体 ,转化至TG1受体菌中 ,挑取阳性克隆进行鉴定后测序。结果表明SA14 12 1 7株基因组全序列长 10 976个核苷酸 ,从 96到 10 394为一个长开放读码框 ,编码 3432个氨基酸。与野毒株SA14 和疫苗株SA14 14 2的核苷酸序列和氨基酸序列相比 ,同源性均在 99%以上 ,突变位点分散于各个区域 ,E区有 5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同 ,3个位点与野毒株一致而与疫苗株不同 ,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关。此外 ,NS3、NS5和 3′NTR的几个位点可能与病毒毒力稳定性相关。综上所述 ,乙脑病毒减毒中间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列 ,若干突变位点影响病毒的弱毒性及毒力的稳定性。全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理具有重要意义     

中国流行性乙型脑炎病毒表型和基因型的研究进展

流行性乙型脑炎(乙脑)病毒是引起病毒性脑炎最主要的病毒之一,本文对我国分离株的表型和基因型特性进行了综合分析。生物学特征研究显示,不同毒株间存在空斑形态、小鼠神经侵入致病性、保护性抗原和血凝性的明显差异。中国在1977年前,自然界中仅存在基因Ⅲ型乙脑病毒,但自1977年以后基因Ⅰ型和Ⅲ型病毒均从自然界分离到,而基因Ⅰ型病毒已成为优势病毒,其中多数分离自蚊虫。基因序列分析显示,两种基因型的氨基酸序列差异率很小(≤3%),与当前广泛应用的减毒活疫苗株比较,仅≤3%的氨基酸序列差异率,这些差别主要存在于与SA14-14-2减毒相关的位点,提示SA14-14-2疫苗能够有效地保护这两种基因型毒株的感染。     

我国2009年新分离乙脑病毒全基因组序列特征研究

本研究对我国2009年新分离的两株乙脑病毒进行全基因组序列测定和分析,以了解病毒全基因组分子特征。通过RT-PCR和核苷酸序列测定方法获得病毒全基因组序列,采用ClustalX、DNASTAR、MEGA等生物学软件完成核苷酸序列及氨基酸序列分析和系统进化分析等。研究结果显示,新分离两株乙脑病毒YN0911和YN0967株基因组全长均为10 965个核苷酸,编码3 432个氨基酸。这2株乙脑病毒之间核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.8%。与国际乙脑病毒流行株相比,核苷酸同源性为83.5%～98.9%,氨基酸同源性为94.8%～99.7%。与乙脑病毒疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白有13个氨基酸差异位点,但都位于抗原关键位点之外。这2株病毒在3′UTR区域存在11nt缺失。基于C/PrM区段、E基因、全基因组系统进化分析结果均显示新分离2株乙脑病毒为G I乙脑病毒,并且和越南、四川、贵州、广西以往的分离株遗传进化关系较近。本研究提示我国新分离的2株乙脑病毒均为G I乙脑病毒,决定病毒毒力的关键氨基酸位点未见明显变化。     

我国新分离森林脑炎病毒E基因特征分析

为了解分离自黑龙江省大兴安岭林区全沟硬蜱中的DXAL-5、12、13、16、18,21共6株森林脑炎(TBE)病毒E蛋白基因特征并确定病毒基因型,应用RT-PCR技术对6株病毒E蛋白基因进行体外扩增、克隆、测序.结果发现,6株病毒E蛋白基因的核苷酸序列长均为1 488 bp,推导的氨基酸序列长均为496 aa.与TBE参考毒株E蛋白基因进行比较,这6株病毒与远东亚型同源性最高,其次是西伯利亚亚型,与欧洲亚型同源性最差;在决定亚型特征的氨基酸位点多数属于TBE病毒远东亚型.E蛋白基因推导的氨基酸种系发生树分析表明,6株病毒均在远东亚型分枝内.因此就E蛋白基因而言,DXAL-5、12、13、16、18、21株均属于TBE病毒的远东亚型.新分离毒株与Senzhang株同源性较高,种系发生关系也比较接近,推测疫苗株对新分离毒株仍具有很好的保护作用.但是在E蛋白的A、B和C抗原决定区内,6株病毒均有不同程度的氨基酸改变,这些突变有可能影响E蛋白的功能.     

乙型脑炎病毒减毒中间株SA14-12-1-7基因组全序列的测定

本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA14-12-1-7-12 -1-7株进行全序列测定和分析,进一步了解乙脑活疫苗减毒及其稳定性的分子机制.根据 已发表的SA14-12-1-7株及SA14-12-1-7株的序列,设计6对重叠引物,涵括整个乙脑病 毒的基因组,通过RT-PCR扩增出SA14-12-1-7-12-1-7株的各cDNA片段,分别克隆到pGEM -T载体,转化至TG1受体菌中,挑取阳性克隆进行鉴定后测序.结果表明SA14-12-1-7-12- 1-7株基因组全序列长10976个核苷酸,从96到10394为一个长开放读码框,编码3432个氨基 酸.与野毒株SA14-12-1-7和疫苗株SA14-12-1-7的核苷酸序列和氨基酸序列相比,同 源性均在99%以上,突变位点分散于各个区域,E区有5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同 ,3个位点与野毒株一致而与疫苗株不同,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关.此 外,NS3、NS5和3′NTR的几个位点可能与病毒毒力稳定性相关.综上所述,乙脑病毒减毒中 间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列,若干突变位点影响病毒的弱毒性及毒力的稳定性.全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理具有重要意义.     

一株强神经毒力乙脑病毒株的生物学及其分子特征

研究一株神经毒力很强的乙型脑炎病毒株SA4株的生物学特性并进行基因组全序列分析,并找到其毒力强的分子基础。将SA4脑内接种昆明小鼠后每日观察发病和死亡鼠数并每日收取鼠脑,用空斑法检测接种后不同时间点的脑内病毒增殖滴度,同时以另一株乙脑病毒SA14按照相同方法进行平行实验作为对照。SA4株的全基因组测序序列结果与乙脑SA14株及世界各地共21株乙脑病毒的全基因组序列进行比较。结果显示,脑内接种SA4株的小鼠发病和死亡时间均比SA14株早1d,在相同时间点上SA4株的病毒滴度高0.5～1.0lgPFU/mL。SA4株与世界各地毒株基因同源性比对,核苷酸同源性为84.6%～99.0%,氨基酸同源性为95.2%～99.7%。与SA14相比,氨基酸序列存在17个位点的差异,分布于不同的区段,其中E区最多,为5个。证明SA4是一株在脑内具有较快繁殖力的神经毒力很强的毒株,其序列上17个氨基酸位点的替换很可能是其强神经毒力的分子基础。     

乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2全基因组序列测定及基因遗传稳定性

目的对乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株进行全基因组序列测定和分析,并观察该生产株在疫苗制备过程中的基因遗传稳定性。方法根据DNA序列数据库(Gen Bank)公布的SA14-14-2株的序列,设计合成7对引物,提取疫苗生产株SA14-14-2及其工作种子批生产的3批原液、3批成品疫苗的病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SA14-14-2株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化至大肠埃希菌DH5α中,挑取阳性菌落克隆、鉴定后测定全序列并对序列进行比较分析,观察毒株在传代的过程中病毒滴度的稳定性。结果乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株基因组全长10 976 bp,编码3 433个氨基酸。3批原液和3批成品疫苗的基因组全长为10 977 bp,比较分析发现,在3'端非编码区10 701处多一个G核苷酸的插入。与DNA序列数据库(Genbank)登录号为D90195的全长序列同源性分别是99.9%、99.9%、99.9%、99.9%、99.8%、99.9%、99.8%,其中E蛋白的同源性均为100%。SA14-14-2生产株的病毒滴度为7.22 lg PFU/mL,原液和成品疫苗的滴度分别为7.32、7.23、7.32、6.86、6.92、6.70 lg PFU/mL。结论乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2基因稳定,具有良好的一致性,为乙型脑炎减毒活疫苗的质量的稳定性提供了可靠依据。     

Isolation in immunodeficient mice of Sarcocystis neurona from opossum (Didelphis virginiana) faeces, and its differentiation from Sarcocystis falcatula

Sarcocystis neurona was isolated in nude mice and gamma-interferon knockout mice fed sporocysts from faeces of naturally infected opossums (Didelphis virginiana). Mice fed sporocysts became lethargic and developed encephalitis. Protozoa were first found in the brain starting 21 days post-inoculation. Sarcocystis neurona was recovered in cell culture from the homogenate of liver, spleen and brain of a nude mouse 11 days after feeding sporocysts. The protozoa in mouse brain and in cell culture multiplied by schizogony and mature schizonts often had a residual body. Sarcocystis falcatula, which has an avian-opossum cycle, was not infective to nude or knockout mice. Protozoa were not found in tissues of nude mice or knockout mice after subcutaneous injection with culture-derived S. falcatula merozoites and sporocysts from the faeces of opossums presumed to contain only S. falcatula. Results demonstrate that S. neurona is distinct from S. falcatula, and that opossums are hosts for both species.     

乙型脑炎病毒及其疫苗的研究进展

流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的、经蚊虫传播的严重危害中枢神经系统的人畜共患急性传染病,其重症病死率高,易造成永久性的神经系统后遗症,严重威胁着人类的健康。目前尚无特效的治疗流行性乙型脑炎的方法,控制蚊虫传播和免疫接种是当前的主要防御手段。简要综述了乙型脑炎病毒的基因组结构、结构蛋白与非结构蛋白功能、基因分型,以及流行性乙型脑炎疫苗的研究进展。     

乙型脑炎疫苗研究进展

乙型脑炎（乙脑）的流行是世界性的公共卫生问题之一,其流行范围正逐步扩大。目前对于乙脑尚无特效治疗手段,因此预防乙脑的发生尤为重要。随着对日本脑炎病毒研究的深入,利用基因工程技术研制新型候选疫苗已成为预防乙脑新的发展方向。我们简要综述了乙型脑炎病毒的基因组结构及其蛋白功能,以及国内外乙型脑炎疫苗研发的新进展。     

利用流行性乙型脑炎病毒减毒株脑细胞吸附特征快速筛选减毒株的初步研究

实验证明,流行性乙型脑炎病毒减毒株的脑细胞吸附能力明显低于强毒株。据此,我们发展建立了一种从强毒SA14株中快速、简便地筛选减毒株的新方法。将3周鼠脑细胞37℃吸附SA14株1小时,从未吸附的病毒颗粒中挑出3个减毒株(C4、C5和B1)。将C5株再次吸附筛选,得到C563株。C563株已完全丧失对3周鼠的脑内毒力和皮下毒力,免疫小鼠一针即能诱导良好的抗体反应和保护力,经BHK21细胞盲传5代或乳鼠脑传一代,毒力没有明显回升。     

Evaluation of the European tick‐borne encephalitis vaccine against Omsk hemorrhagic fever virus

This study focused on the antigenic cross‐reactivity between tick‐borne encephalitis virus (TBEV) and Omsk hemorrhagic fever virus (OHFV) to assess the efficacy of the commercial TBE vaccine against OHFV infection. Neutralization tests performed on sera from OHFV‐ and TBEV‐infected mice showed that neutralizing antibodies are cross‐protective. The geometric mean titers of antibodies against TBEV and OHFV from TBEV‐infected mice were similar. However, the titers of anti‐TBEV antibodies in OHFV‐infected mice were significantly lower than those of anti‐OHFV antibodies in the same animals. In mouse vaccination and challenge tests, the TBE vaccine provided 100% protection against OHFV infection. Eighty‐six percent of vaccinees seroconverted against OHFV following complete vaccination, and the geometric mean titers of neutralizing antibodies against OHFV were comparable to those against TBEV. These data suggest that the TBE vaccine can prevent OHFV infection.     

Simian immunodeficiency virus disrupts extended lengths of the blood--brain barrier

It is known that there is disruption of the blood-brain barrier during terminal AIDS encephalitis in both human immunodeficiency virus (HIV)-infected humans and simian immunodeficiency virus (SIV)-infected rhesus macaques. Much, although by no means all, of the neuropathological findings of HIV and SIV infection involves accumulation of monocytes/macrophages that have likely crossed the blood-brain barrier (BBB). There is no convincing, rigorous, demonstration of HIV (or SIV) infecting endothelial cells in vivo. However, this is not to say that HIV infection would not have any effects on the physiology of microvascular brain endothelial cells. Because of the elaborate nature of cerebral microvessels, previous studies of cerebral endothelial cells have been constrained by sectioning artifacts. Examination of freshly isolated cerebral microvessels allows investigation of extended lengths of vessels (>150 mum) without sectioning artifacts. These studies determine the changes in the expression of the tight junction protein zo-1 protein on the endothelial cells of cerebral capillaries at terminal acquired immune deficiency syndrome, demonstrating that there is a decreased expression of zo-1 protein over extended lengths of microvessels.     

流行性乙型脑炎强毒株和SA14-14-2弱毒株对裸鼠的致病性和免疫性实验研究

本试验结果表明,免疫缺陷无胸腺裸鼠对乙型脑炎强毒株病毒神经外感染较正常鼠敏感,病毒容易入脑,在脑内的繁殖滴度高,并引起脑细胞严重病理改变。乙脑14-2弱毒株神经外感染则不引起裸鼠发病,脑组织未见病理改变;若脑内直接注射,则引起部分裸鼠发病死亡,但病理变化仍然很轻。以上说明以7.0Log TC(?) 14-2株病毒0.1～0.6ml接种时,对免疫功能不全的裸鼠也是安全的。     

用亲和素-生物素复合物法研究流行性乙型脑炎病毒感染小鼠中枢神经系统后的抗原定位

利用亲和素-生物素免疫组织化学技术,研究了流行性乙型脑炎(简称乙脑)病毒抗原(P3,A2株)感染小鼠中枢神经系统后的定位。观察到乙脑病毒抗原分布具有一定选择性,主要集中在脑干、小脑、间脑和大脑皮质。病变分布与H-E常规病理染色一致。该方法敏感、特异。同时比较了兔免疫血清与乙脑单克隆抗体的应用效果。对组织化学冰冻切片漂浮法诊断病毒抗原进行了探讨。     

Duration of neutralizing antibody titer after Japanese encephalitis vaccination

In paired serum samples collected from 17 children, we measured neutralizing antibody (NTAb) titers after the second series of routine Japanese encephalitis (JE) vaccination in Japan to estimate the duration of NTAb titer when children did not receive the third series of routine vaccination by applying a random coefficient model. We also measured NTAb titers in adult serum samples to confirm the duration of NTAb titer estimated in the analysis of pediatric serum samples. In the absence of the third series of routine vaccination, 18% (3/17), 47% (8/17), 82% (14/17) and 100% (17/17) of children were estimated to become NTAb negative at 5, 10, 15, and 20 years after the second series of routine vaccination, respectively. Of 38 adults, 39.5% (15/38) became NTAb negative; the percentage was somewhat lower than that of antibody-negative children. The results suggested that JE vaccination schedule should be reevaluated in the future.     

SIV-induced activation of the blood-brain barrier requires cell-associated virus and is not restricted to endothelial cell activation

It has never been determined if activation of the blood-brain barrier (BBB) during simian immunodeficiency virus/human immunodeficiency virus (SIV/HIV) infection is a function of high levels of circulating virus or if the virus has to be within a cell capable of crossing the BBB to activate it. In vitro models of the BBB are becoming recognized as an acceptable method for determining the cellular events associated with HIV neuroinvasion. Cell free virus (when added in the physiologically relevant lumen) although capable of activating the endothelial cells of our in vitro BBB did not activate astrocytes beneath. SIVmac251-infected CEMx174 cells, however, were capable of activating both components of the BBB model. Here we demonstrate that an in vitro model of the BBB can be activated in a physiologically relevant manner, that SIV requires to be cell-associated and that endothelial cells of the BBB are not the only components that are activated during SIV neuroinvasion.