宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态的研究

为了检测宫颈癌患者血浆和组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 以找到无创伤性诊断宫颈癌的新指标, 选取151例宫颈癌患者的血浆和30例患者的宫颈癌组织为研究对象,用MSP的方法检测FHIT基因5′端CpG岛甲基化状态, 并对MSP产物进行克隆和测序。结果在宫颈癌患者血浆和组织中, FHIT基因5′端CpG岛甲基化率为30.46%和53.33%, 血浆和组织的总体符合率为80%。而对照中均未检测到甲基化状态。随着患者临床分期和组织学分级的增加, FHIT基因甲基化的检出率也在逐渐的增加。表明宫颈癌患者的血浆和肿瘤组织中FHIT基因5′端CpG岛甲基化的发生是高频事件, 使用FHIT基因作为标记可以对宫颈癌患者进行无创伤诊断和预后的评估。     

宫颈癌患者血浆中E-钙黏着蛋白基因启动子区的甲基化状态

肿瘤细胞可以释放DNA进入患者的血浆/血清中,并可作为无创伤性诊断肿瘤的标记物。采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MS-PCR)结合亚硫酸盐测序法对151例宫颈癌患者血浆和对应的30例组织中E-钙黏着蛋白基因启动子区甲基化状态进行检测,并与化学发光法检测患者血清的鳞状上皮癌抗原(SCC)相比较,发现此方法的灵敏度为40.39%,特异性为100%,正确性为49.72%,血浆和组织的符合率为76.67%。宫颈炎、子宫肌瘤和正常人的血浆中均未检测到甲基化状态的存在。随着临床分期和组织学分级的增加,E-钙黏着蛋白基因甲基化的检出率也在逐渐增加,与SCC结果相比,MS-PCR方法在早期和恶性度高的宫颈癌中的诊断效果良好。使用E-钙黏着蛋白基因作为分子标记可以对宫颈癌患者进行无创伤性早期诊断和预后的评估。     

FHIT基因在宫颈癌细胞中的表达及其甲基化调控

目的：分析FHIT基因在宫颈癌细胞中表达情况以及甲基化的调控情况。方法：对RJC-1、SiHa、CS1213以及C4-1细胞进行培养,提取这些细胞的DNA并经过亚硫酸氢盐修饰,进行PCR反应和产物的检测。分析FHIT基因在宫颈癌细胞中表达情况以及甲基化的调控情况。结果：RJC-1、CS1213细胞仅有甲基化引物扩增出了目的条带,为完全甲基化状态。其他细胞则是甲基特异性引物与非甲基特异性引物共同扩增出73bp的目的条带,其状态为甲基化杂合性。通过5-aza-CdR处理细胞后,通过实时定量PCR检测FHIT mRNA的表达,显示处理后各种细胞中的FHIT mRNA的表达升高。结论：FHIT基因的甲基化是其表达下调的重要机制之一,是临床研究宫颈癌细胞的重要方向之一。     

宫颈癌中相关基因启动子高甲基化研究进展

本文主要从分子水平介绍了在宫颈癌发生发展过程中抑癌基因的甲基化的作用.以往认为人乳头状病毒高危型的的感染是导致宫颈癌发生的主要因素.随着科技的发展,宫颈癌组织中抑癌基因的甲基化越来越备受关注.既往认为基因内突变和染色体物质缺失是肿瘤抑制基因失活的主要原因.但是,启动子CPG岛异常甲基化导致的基因失活在肿瘤发生发展过程中起着非常重要的作用现已确切证明,DNA甲基化是肿瘤抑制基因失活的第三种机制,而且在某些情况下是抑癌基因失活的惟一机制.对宫颈癌组织中的对相关抑癌基因甲基化的筛选并作为标记应用在检测宫颈癌中,这在防止宫颈癌的发生起到重大作用,还可有望作为宫颈癌治疗疗效检测的一项手段.     

肝细胞癌中FHIT基因启动子甲基化状态分析及其与临床病理特征之间的关系研究

目的:分析肝细胞癌组织中FHIT基因启动子甲基化状态及其与FHIT基因表达和肝细胞癌临床病理特征的关系。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)方法分析肝细胞癌组织和癌旁正常肝脏组织中FHIT基因启动子甲基化状况;应用RT-PCT和Western免疫印迹方法检测FHIT基因mRNA和蛋白的表达情况;统计学分析FHIT基因启动子甲基化与肝细胞癌临床病理特征的关系。结果:MSP分析结果表明肝细胞癌组织中FHIT基因甲基化率(60.8%)显著高于癌旁正常组织中FHIT基因甲基化(16.2%;x2=31.071,P=0.000)。同时我们还发现:发生完全或者部分甲基化的肝细胞癌组织或者癌旁正常肝组织中FHIT基因mRNA和蛋白表达水平显著降低。FHIT基因启动子甲基化和肝细胞癌患者的临床分期和肝外转移情况密切相关(P=0.006和0.049),而与其他临床病理特征无相关性(P>0.05)。结论:FHIT基因甲基化是导致FHIT基因在肝细胞癌中失活的一个重要因素,与肝细胞癌的发生密切相关,有望成为肝细胞癌早期诊断的分子检测标志物和分子治疗新靶点。     

脑胶质瘤组织中p16基因启动子区CpG岛甲基化检测及其临床意义研究

目的：研究脑胶质瘤中p16基因启动子区甲基化情况及其临床意义。方法：用甲基化特异性PCR技术检测42例脑胶质瘤组织和癌旁正常脑组织中p16基因启动子甲基化,并分析该基因启动子甲基化与临床病理特征之间的关系。结果：脑胶质瘤组织中p16基因异常甲基化率（38.27%）显著高于癌旁正常脑组织中p16基因的异常甲基化率（8.8%,P=0.000）。发生甲基化的肿瘤组织或者正常脑组织中p16基因mRNA和蛋白表达显著降低。此外,p16基因异常甲基化和肿瘤病理分级有相关性（P=0.007）,而与患者性别、年龄及肿瘤类型等临床特征无关（P=0.669,0.869和0.944）。结论：p16基因启动子区CpG岛高甲基化与p16表达下调相关,推测p16启动子区CpG岛高甲基化是导致p16基因在脑胶质瘤中表达下调的重要因素,有望成为脑胶质瘤早期辅助诊断的分子标志物之一。     

亚硫酸氢钠测序法检测水稻FIE基因CpG岛甲基化状态

建立了适用于水稻基因组特定基因甲基化检测的亚硫酸氢钠测序法,并利用此方法对FIE2A基因CpG岛部分片段的甲基化差异进行了研究。采用CTAB法提取水稻叶片和胚乳细胞的基因组DNA,经亚硫酸氢钠化学修饰后,针对已修饰的FIE基因序列设计特异引物并结合巢式PCR扩增,TA载体克隆、测序,最后对测序结果进行分析。结果表明巢式PCR能够增加特异性产物的产生,FIE基因CpG岛在对称的CG和CNG位点甲基化水平较高,而在非对称CNN位点甲基化水平最低,此外在叶片中的平均甲基化水平较高。由此表明本研究建立的亚硫酸氢钠测序法适用于水稻基因组特定基因甲基化状态的检测。     

人肝细胞中FⅧ基因5'端CpG岛甲基化状态的研究

本实验通过建立稳定的重亚硫酸盐测序(bisulfite-sequencing PCR,BSP)检测平台,研究人类永生化肝细胞LO2与人肝组织细胞中凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ,FⅧ)基因5'端Cp G岛的甲基化状态及该Cp G岛的甲基化在FⅧ表达调节中的作用。运用RT-PCR、Western-blot检测FⅧ在LO2细胞与人肝组织中的转录及表达,Methprimer软件预测FⅧ基因5'端Cp G岛并设计BSP引物,BSP联合TA克隆及质粒PCR各验证十个阳性单克隆送测序,QUMA软件对测序结果进行甲基化位点分析,以(甲基化CG位点个数)/(甲基化CG位点个数+非甲基化位点个数)计算甲基化率。结果显示,新鲜分离的人肝组织细胞能够稳定表达FⅧ,LO2细胞不能表达;FⅧ基因5'端存在一个278 bp的Cp G岛,LO2细胞中该Cp G岛的甲基化率为93.48%,正常人肝组织中该Cp G岛的甲基化率为93.91%。本实验成功建立稳定的BSP检测平台,并发现在LO2细胞与人肝组织中,FⅧ基因5'端均存在一个被高度甲基化的Cp G岛,人肝组织中FⅧ基因5'端Cp G岛的甲基化可能参与维持体内FⅧ的低水平表达。     

山羊克隆胎儿不同组织中H19基因CpG岛甲基化模式及表达量检测

表观重编程异常是核移植胚胎发育异常的重要原因。为了研究克隆山羊胎儿不同组织中H19基因CpG岛甲基化水平和相对表达量,本实验运用亚硫酸盐法和荧光实时定量PCR法分别检测了死亡克隆山羊胎儿和同期普通山羊胎儿(对照组)肝脏、胎盘、肾脏、肺脏和心脏组织中H19基因CpG岛甲基化水平和mRNA的相对表达量。结果表明,克隆山羊胎儿胎盘组织中H19基因第5个CpG岛的甲基化水平显著高于对照组(70%vs49.41%,P0.05),H19基因相对表达量显著低于对照组(883.3vs1264.5,P0.05);肺脏组织甲基化水平显著低于对照组(63.53%vs88.24%,P0.05),相对表达量显著高于对照组(1003.4vs515.5,P0.05);其他各组差异不显著(P0.05)。结果说明,H19基因在克隆山羊胎儿部分组织中DNA甲基化重编程异常,而且这种异常影响H19基因的正常表达,这也可能是导致克隆动物死亡的重要因素之一。     

hMLH1基因启动子CpG岛甲基化致MSI与肿瘤的关系

通过人类错配修复基因( hMLHl)启动子CpG岛甲基化与微卫星不稳定性(MSI)的分析,探讨癌症发病的机制.错配修复基因hMLH1启动子CpG岛甲基化是hMLH1基因失活的重要机制,而hMLH1的表达失活则可导致MSI的产生,促进癌症的发生.根据一系列研究得出结论,在肿瘤组织中hMLH1基因启动子CpG岛甲基化和微卫星不稳定(MSI)有显著相关性,并在癌症早期发生、发展过程中起重要作用.因此临床检测hMLH1基因启动子CpG岛甲基化及微卫星不稳定可能成为癌症鉴别诊断、评价预后、指导化疗的分子标志物之一.     

小鼠骨髓细胞中p16和Ralb基因启动区CpG岛的甲基化位点分析

抑癌基因p16和白血病致癌因子Ralb与白血病的发生密切相关,其启动子区CpG岛的甲基化对基因表达具有重要作用.本文旨在分析p16、Ralb基因启动子区CpG岛甲基化位点信息,并比较这两个基因在小鼠骨髓细胞和原代培养的骨髓细胞中甲基化状态的差异.运用"MethPrimer"软件预测p16、Ralb基因启动子区的CpG岛,设计甲基化特异性引物.利用重亚硫酸盐测序法(BSP)检测甲基化位点信息.结果显示,p16有1个CpG岛,岛上21个CpG位点全部未发生甲基化;Ralb有2个CpG岛,CpG岛1上的5个CpG位点全部呈甲基化状态,而CpG岛2上的17个CpG位点全部呈非甲基化状态,且小鼠骨髓细胞和体外原代培养的骨髓细胞中两基因的甲基化状态一致.表明p16、Ralb基因甲基化状态未受外界培养条件的影响而改变,提示在与两基因甲基化相关的研究中体外试验可替代体内试验.     

骨肉瘤中RASSF1A基因的甲基化状态研究

目的:分析骨肉瘤组织中RASSF1A基因甲基化状况。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)分别检测44例骨肉瘤组织及相应的癌旁组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态并分析其临床病理意义。结果:骨肉瘤组织中RASSF1A基因异常甲基化率(61.4%)显著高于癌旁正常骨组织中RASSF1A基因的异常甲基化率(20.5%),二者之间差异具有统计学意义(P<0.05)。RASSF1A基因异常甲基化导致组织中RASSF1A基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低。另外,RASSF1A基因异常甲基化和肿瘤组织分化程度及全身有无转移情况有相关性(P值分别为0.022和0.016),而与患者年龄、性别、肿瘤位置及大小等临床特征无关(P值分别为0.6944,0.977,0.786和0.831)。结论:RASSF1A基因启动子高甲基化可能是导致其在骨肉瘤中表达水平降低的分子机制之一,有望成为骨肉瘤早期辅助诊断的一个重要分子标志物。     

骨肉瘤中RASSF1A基因的甲基化状态研究

目的：分析骨肉瘤组织中RASSF1A基因甲基化状况。方法：运用甲基化特异性PCR（MSP）分别检测44例骨肉瘤组织及相应的癌旁组织中RASSF1A基因启动子甲基化状态并分析其临床病理意义。结果：骨肉瘤组织中RASSF1A基因异常甲基化率（61.4%）显著高于癌旁正常骨组织中RASSF1A基因的异常甲基化率（20.5%）,二者之间差异具有统计学意义（P〈0.05）。RASSF1A基因异常甲基化导致组织中RASSF1A基因mRNA和蛋白表达水平均显著降低。另外,RASSF1A基因异常甲基化和肿瘤组织分化程度及全身有无转移情况有相关性（P值分别为0.022和0.016）,而与患者年龄、性别、肿瘤位置及大小等临床特征无关（P值分别为0.6944,0.977,0.786和0.831）。结论：RASSF1A基因启动子高甲基化可能是导致其在骨肉瘤中表达水平降低的分子机制之一,有望成为骨肉瘤早期辅助诊断的一个重要分子标志物。     

脑胶质瘤患者组织和血清MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态检测

目的探讨脑胶质瘤患者组织和血清中MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子CpG岛甲基化发生率及相关性。方法甲基化特异性PCR（MSP）检测39例脑胶质瘤组织样本及32例预处理的脑胶质瘤血清样本中MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态。结果脑胶质瘤组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46．2％、10．3％和20．5％,肿瘤组织中至少有一种基因甲基化的发生率为64．1％（25／39）;在脑胶质瘤患者外周循环血液中检测到了相关基因甲基化系列,并且与组织中基因甲基化发生率明显相关。结论MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件,血清中相关基因DNA甲基化检测有可能为脑胶质瘤诊断和个体化化疗提供一种稳定的无创性检测指标。     

非霍奇金淋巴瘤p73基因甲基化状态及去甲基化再表达的研究

目的:探讨p73基因甲基化状态在非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgk in's lymphomas,NHL)患者中的检测意义以及去甲基化干预对p73基因再表达的效果.方法:检测26例非霍奇金淋巴瘤标本中P73基因的表达以及甲基化状态;用不同剂量(4,8μmol/L)去甲基化因子5氮胞苷(5-A za)诱导P 73基因甲基化的淋巴瘤细胞,RT-PCR和MSP-PCR方法测定p73基因的表达以及甲基化状态.结果:p73基因在非霍奇金淋巴瘤中表达显著下降,26例标本中,13例呈阴性(50%),6例表达下降;p73基因外显子1甲基化的发生率为100%;4μmol/L去甲基化因子5氮胞苷(5-A za)在体外即可诱导的淋巴瘤细胞p 73基因去甲基化再表达,8μmol/L 5-Aza效果较4μmol/L更为明显.结论:p 73基因甲基化与非霍奇金淋巴瘤的发病密切相关,去甲基化干预可能为一种可行的临床治疗手段.     

CDH1 基因启动子甲基化与宫颈癌临床病理类型的关系

目的:探讨分析CDH1基因启动子甲基化与宫颈癌临床病理类型的关系。方法:选取2012年5月~2015年7月我院105例宫颈癌患者为宫颈癌组,同时选取60例正常宫颈组织为正常组,以甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测CDH1基因启动子Cp G岛甲基化状态及高危型HPV DNA状态,分析CDH1基因甲基化状态与高危型HPV DNA状态及临床病理参数的关系。结果:宫颈癌组CDH1基因启动子甲基化阳性率为56.19%,明显高于正常组的6.67%,具有统计学差异(P0.05);宫颈癌组的高危型HPV DNA阳性率为84.76%,明显高于正常组的20.00%,具有统计学差异(P0.05);高危型HPV DNA与CDH1基因启动子甲基化的一致性分析结果具有统计学意义(P0.05);CDH1基因启动子甲基化率与患者的WHO组织分化程度分级、FIGO分期、组织病理学分型、肿瘤大小有关,差异有统计学意义(P0.05)。结论:宫颈癌CDH1基因启动子甲基化与WHO组织分化程度分级、FIGO分期、组织病理学分型、肿瘤大小具有关联,并与高危型HPV DNA阳性具有一致性,可以作为宫颈癌诊断和预后评估的参考指标。     

宫颈癌p16基因甲基化及表达的研究

为了探讨p16基因甲基化及异常表达在宫颈癌中的意义,分别采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测不同病理类型和临床分期的60例宫颈癌组织中p16基因启动子区域5´CpG岛甲基化状态;采用PCR方法检测p16基因外显子1（E1)和外显子2(E2)纯合缺失情况;采用免疫组化的方法分析p16蛋白的表达缺失和减弱情况。结果显示正常对照组织及癌旁p16基因无甲基化,且无E1和E2缺失和p16蛋白表达异常。60例宫颈癌标本的甲基化率为21.67%（13/60）;p16 基因缺失率为15.00%（9/60）;p16蛋白表达下降或无表达为51.67%（31/60）。可见p16基因蛋白的阳性表达率随着临床分期升高呈明显下降趋势。结果提示p16基因失活在宫颈癌中多见且与病理分级密切相关。p16 基因甲基化在宫颈癌发生中起着一定作用。Abstract： To detect hypermethylation and aberrant expression of the p16 gene in cervical carcinoma (CC), methylation-specific PCR (MSP) was used to determine the methylation status of 5´CpG islands of the p16 gene, loss or decrease of p16 expression was analyzed by immunohistochemistry (IHC), and homozygous deletion of exon 1 (E1) and/or exon 2 (E2) was determined by PCR. in 60 cases of CC at different pathological grades and clinical stages. The results showed absence of methylation and presence of normal expression of the p16 gene in the control and adjacent tissues of CC. Hypermethylation, loss or decrease of expression and deletion of the p16 gene were detected in 21.67%(13/60), 51.67%(31/60) and 15.00%(9/60) of the tumor tissues, respectively. The rate of p16 expression markedly reduced with the increase of clinical stages. Our data suggested that inactivation of the p16 gene was a frequent event and positively correlated with pathological grades in CC, and that methylation of the p16 gene was an important event in carcinogenesis of CC.     

天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞TSLC1基因甲基化及其表达的影响

目的：检测人宫颈癌HeLa细胞中TSLC1基因甲基化的状况,研究在人宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中TSLC1基因甲基化的变化情况,探讨肿瘤细胞凋亡与抑癌基因甲基化的相关性,并进一步证实天花粉蛋白（TCS）去甲基化作用是否存在普遍性,以促进天花粉蛋白的临床应用。方法：应用甲基化特异性PCR（MSP）法检测人宫颈癌HeLa细胞及其凋亡过程中TSLC1基因甲基化的状况;采用实时定量RT-PCR技术检测TCS处理前、后HeLa细胞TSLC1基因表达的变化。结果：肿瘤抑制基因TSLC1在人宫颈癌HeLa细胞中呈高度甲基化状态,经40μg／mL TCS处理48h后,TSLC1基因甲基化程度明显降低;RT-PCR检测结果显示,TCS处理组HeLa细胞中TSLC1 mRNA的表达量高于未处理组,提示TSLC1基因启动子区CpG岛甲基化是导致其低表达的重要机制。结论：肿瘤抑制基因TSLC1启动子甲基化在人宫颈癌癌变过程中可能是一种重要的分子调控机制;人宫颈癌HeLa细胞凋亡与抑癌基因的去甲基化之间可能存在某些密切的相关性;TCS对肿瘤抑制基因TSLC1有一定的去甲基化作用。     

ES小鼠和ES细胞中H19基因甲基化状态

为探讨印迹基因H19的甲基化状态与ES小鼠胚胎发育之间的关系, 以遗传背景相同的正常成年对照小鼠、22只成年ES小鼠和8只新生死亡的ES小鼠以及不同传代次数的ES细胞为实验材料, 利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR技术分别检测了其印迹基因H19的5′非翻译区两个位点的甲基化状态。结果表明, 发育至成年的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与正常成年对照小鼠之间没有差异, 而新生死亡的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠相比则存在明显差异。推测ES细胞中印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠之间可能存在 差异。     

持续植物状态患者血浆及脑脊液中内皮素变化研究

内皮素 (ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ,ＥＴ)是近年来发现的一类活性最强的收缩血管物质 ,主要分布于下丘脑、丘脑、Ｐｕｒｋｉｎｊｅ细胞、侧脑室、苍白球、尾状核、脑干包括脑桥等处 ,为脑和脊髓中的主要神经递质。有报道表明ＥＴ与脑损伤、脑血管疾病的发生和发展有关[1 ,2 ,4] 。但有关ＥＴ与持续植物状态 (ＰＶＳ ,俗称植物人 )间关系 ,尚未见报道。本文主要通过对ＰＶＳ患者血浆和脑脊液 (ＣＳＦ)中ＥＴ的含量测定 ,探讨ＥＴ与ＰＶＳ发病的关系。1　资料与方法(1)临床资料　对照组血浆 17例 ,为健康成人 ,年龄 17～ 6 4岁 ,其中男 9例 ,女 8…