离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯代盐对溶菌酶结晶的影响

以亲水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐(BmimCl)为添加剂,研究离子液体对溶菌酶结晶的影响.分别考察了离子液体对溶菌酶晶体数量与尺寸、晶体形貌及蛋白质纯度的影响,并探讨了离子液体对结晶过程影响的作用机制.离子液体通过增大溶菌酶的溶解度和其自身低蒸气压两种途径,降低了溶菌酶在结晶过程中的过饱和度,更有利于晶体的成核和生长,得到更好的结果.如避免多晶态现象的发生,增大晶体的尺寸,降低溶菌酶样品纯度的要求.X-射线衍射分析表明,离子液体未改变晶体的晶型结构,但可提高晶体的衍射分辨率.     

不同重力条件下生长的溶菌酶晶体的结构

利用我国返回式卫星和国内研制的蛋白质结晶装置 ,先后进行了 2次空间蛋白质晶体生长实验 ,均获得了质量较好的溶菌酶晶体 .为了探索微重力对溶菌酶晶体结构的影响 ,对 2次空间生长的和地面实验室生长的溶菌酶晶体进行了高精度的晶体结构测定和研究     

凝胶法生长溶菌酶晶体的研究

凝胶介质可以排除或削弱晶体生长过程中重力引起的对流和沉淀现象,用凝胶法生长生物大分子晶体是一种新的探索。使用类似于悬滴汽相扩散的方法,凝胶中生长出单个较大的外形发育完善且高度对称的鸡蛋清溶菌酶晶体。ＭＰＤ在凝胶中对溶菌酶结晶与溶液中具有相似的抑核作用。排循照像实验表明,凝胶法生长的晶体具有较强的衍射能力。     

超临界CO_2诱导双酚A型聚碳酸酯预聚体的结晶行为

采用超临界CO_2技术对不同数均分子量(M_n)的双酚A型聚碳酸酯预聚体进行诱导结晶,应用热分析(DSC)、广角X射线衍射(WAXD)、扫描电子显微镜(SEM)对诱导结晶后的聚碳酸酯进行了结构和形貌的表征。研究表明,预聚体经超临界CO_2诱导结晶形成同一晶型、尺寸不同的片状晶体,片晶随着诱导结晶时温度、压力的升高逐渐增厚,结晶度增大。在二氯甲烷、乙醇和丙酮三种共溶剂中,极性最大的丙酮诱导的晶体结晶度最大。随M_n的增大,结晶度减小。同时广角X射线衍射结果也证实了超临界CO_2诱导的聚碳酸酯的晶体是单斜晶系结构。     

溶菌酶分子聚集状态对蛋白质晶体生长影响的研究

使用动态光散射仪及微批量法,实时测量了溶菌酶晶体生长过程中,蛋白质颗粒的聚集情况。实验表明当液滴中的溶菌酶分子单体形式占多数,同时也存在一定数目的聚集体时,将会产生晶体。另外还通过观察有无絮状物附着情况下,溶菌酶晶体的生长情况,研究了絮状物对晶体生长速度的影响。实验表明这种由高密度的蛋白质聚集体组成的絮状物附着在晶体表面时,晶体的生长受到抑制。而絮状物会逐渐解体,重构成四方晶体或球状结晶等更稳定的聚集状态。研究在一定程度上揭示了溶液中溶菌酶分子的聚集状态与结晶的关系。     

限制性酶切提高E.coli Hfq蛋白晶体结构分辨率

Hfq蛋白是一种促进sRNA结合互补RNA的细菌伴侣蛋白. Hfq蛋白可以抑制或上调目的蛋白的表达及促进mRNA的降解,从而调控细菌的生理功能使其适应周围胁迫环境.Hfq是同源六聚体蛋白质,在其中心部位有1个内环,每个单体上有1个极其保守的组氨酸分布在这个内环表面.根据Hfq这个特点,应用镍离子亲和柱直接从大肠杆菌中纯化Hfq,接着用凝胶过滤层析柱纯化,最终获得了纯度70%的Hfq蛋白.对该蛋白质进行结晶条件初筛前,应用胰凝乳蛋白酶对其进行限制性蛋白酶解,切除其C端无规则卷曲,便于Hfq结晶及提高晶体衍射率.初期得到的Hfq晶体是极小的针状晶体,通过优化结晶条件获得了较大的晶体.最终解析出了2个分辨率较高的Hfq晶体结构,其中1个晶体结构分辨率达到了1.63A.     

限制性蛋白酶解提高E.coli Hfq蛋白晶体结构分辨率

Hfq蛋白是一种促进sRNA结合互补RNA的细菌伴侣蛋白.Hfq蛋白可以抑制或上调目的蛋白的表达及促进mRNA的降解,从而调控细菌的生理功能使其适应周围胁迫环境.Hfq是同源六聚体蛋白质,在其中心部位有1个内环,每个单体上有1个极其保守的组氨酸分布在这个内环表面.根据Hfq这个特点,应用镍离子亲和柱直接从大肠杆菌中纯化Hfq,接着用凝胶过滤层析柱纯化,最终获得了纯度70%的Hfq蛋白.对该蛋白质进行结晶条件初筛前,应用胰凝乳蛋白酶对其进行限制性蛋白酶解,切除其C端无规则卷曲,便于Hfq结晶及提高晶体衍射率.初期得到的Hfq晶体是极小的针状晶体,通过优化结晶条件获得了较大的晶体.最终解析出了2个分辨率较高的Hfq晶体结构,其中1个晶体结构分辨率达到了1.63.     

利用数字图象技术观察蛋白质的结晶过程

用汽相扩散法生长溶菌酶晶体并利用ＣＣＤ显微摄像系统记录了溶菌酶晶体的生长过程。由此图象序列,我们可以计算晶体的最大线度、生长速度,估计溶菌酶分子层的增长速度,了解蛋白质晶体在结晶室内的分布及其形态变化。得到结果如下：蛋白晶体生长初期最大线度与时间近似成线性关系;各晶面生长速度基本相等。     

制备用于结晶的蛋白质样品

制备高质量蛋白质晶体是通过X射线衍射解析蛋白质分子三维结构的关键环节,是结构生物学领域中的瓶颈问题之一。蛋白质的结晶受多因素控制,其中蛋白质样品自身的质量是影响蛋白质能否结晶及晶体质量好坏的关键因素。我们从蛋白质纯度、可溶性、均一性及表面修饰等方面介绍了如何获得适于结晶的蛋白质样品,以及如何借助相关仪器检测蛋白质样品的质量,预测蛋白质的可结晶性。     

我国第2次空间蛋白质晶体生长实验

1994年7月,在我国返回式卫星FSW-2上进行了第2次空间蛋白质结晶实验.该次实验中的晶体生长状况明显优于首次空间实验结果,参加实验的10种蛋白质中有9种蛋白质在空间长出了晶体,48个样品的单晶产生率达70％以上.其中3种蛋白质在空间长出较大单晶体,能用于X射线衍射实验和收集强度数据.这3种蛋白质中,除了在首次空间实验中长出较大晶体的溶菌酶,还有由于结晶条件优化而结晶效果明显改进的酸性磷脂酶A₂和斑头雁氧合血红蛋白.微重力条件对蛋白质晶体生长的良好效应在本次实验中得到进一步证实.     

溶菌酶的结晶研究

介绍了溶菌酶结晶的意义,通过对晶核形成、晶体生长和停止生长三个阶段的论述,详细地阐述了溶菌酶的结晶机理;并综述了结晶过程中的各个影响因素:蛋白质浓度、pH值、添加剂、生长温度及重力场、磁场等;展望了溶菌酶结晶研究的发展趋势和发展前景。     

碱性离子液体1-甲基-3-丁基咪唑氢氧化物催化地沟油制备生物柴油的研究

本研究合成了碱性离子液体1-甲基-3-丁基咪唑氢氧化物,通过红外光谱和核磁共振检测与文献报道一致,以此离子液体为制备生物柴油的催化剂,发现具有很高的催化活性.在生物柴油的合成过程中,考察了离子液体的用量、醇与油物质的量比、反应温度和反应时间对酯交换反应的影响.结果显示,以地沟油制备生物柴油的最佳工艺条件为:醇油摩尔比8:1、反应温度70 ℃、反应时间110 min、催化剂用量为原料油质量的3.0 %.在此条件下, 脂肪酸甲酯转化率为95.7 %.由地沟油制备的生物柴油,其低温流动性能好,闪点高,除碘值较高外,其他主要性能符合0# 柴油标准,并且可以和0# 柴油进行调和使用.     

D-阿拉伯糖结晶影响因素分析

D-阿拉伯糖是多种功能性糖合成的中间体,其纯度高低决定了功能性糖转化率的高低,所以得到高纯度的D-阿拉伯糖尤为重要。通过对D-阿拉伯糖结晶温度、搅拌速度、结晶液中离子含量等因素进行试验,确定了采用梯度降温形式、搅拌速度控制在5 r/min,离子含量控制在100 μs/cm以下能够得到纯度达99.8%的D-阿拉伯糖晶体,实验结果为后续功能性糖的高效转化奠定了基础。     

溶菌酶晶体及其交联技术的研究进展

在结晶蛋白中,溶菌酶成为一种典范,是一种模型蛋白.在不同的环境中,通过调变各项反应条件,可以实现对不同晶系溶菌酶晶体形貌、结构的控制并进行最优化,然后对其进行交联,讨论其反应机理.所采用的方法还能扩展到其他类型蛋白质晶体中,为设计和制备具有优良应用性能的不同形貌的蛋白晶体及交联晶体材料奠定基础,必将大大促进蛋白晶体材料在我国生物材料应用方面的研究.     

6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶的纯化与结晶条件

【目的】在大肠杆菌中克隆表达尼古丁降解关键的6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶基因hspB,纯化重组HspB蛋白并进行结晶条件的初步研究。【方法】从恶臭假单胞菌S16基因组中PCR扩增hspB基因,构建重组表达载体pET28a-hspB,并在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组蛋白。利用悬滴扩散法对HspB蛋白进行结晶条件筛选和优化。【结果】本文成功构建重组质粒pET28a-hspB并纯化获得达到结晶纯度的HspB蛋白。结晶条件初筛和优化后获得可培养HspB蛋白晶体的条件为0.2 mol/L NaCl、0.1 mol/L HEPES pH 7.5、1.1 mol/L(NH4)2SO4、4°C、加晶种。【结论】HspB蛋白纯化体系的构建和结晶条件的初步研究为从结构生物学的角度进一步研究HspB结构与功能的关系、定向进化提高HspB催化效率奠定了基础。     

杂质对蛋白质晶体影响研究进展

综述了杂质对蛋白质晶体生长影响研究领域的进展情况. 对可能的杂质来源以及杂质对结晶过程的影响进行了介绍.重点介绍了和结晶蛋白质分子结构相似的杂质分子的影响, 包括晶体成核、生长形态、表面形貌、生长动力学、质量等,以及杂质在晶体中的重新分配.     

蛋白质结晶的研究进展

概括了蛋白质结晶的基本过程,阐述了蛋白质结晶的早期发展历程,重点介绍了蛋白质结晶的近期研究状况,主要包括:形核机理的研究、结晶条件的筛选和结晶技术的优化以及基于结构的药物设计技术。特别是对离子液体在蛋白质结晶过程中的应用及发展前景进行了讨论。     

固氮酶铬铁蛋白和锰铁蛋白大单晶的培养

用液/液扩散法, 从分别含Cr和Mn的无氨培养基中生长的固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW3中纯化出的CrFe蛋白和MnFe蛋白, 在合适的结晶条件下生长出深棕色大单晶(最大晶体的尺寸分别为0.20 mm×0.20 mm×0.07 mm 和 0.18 mm×0.18 mm×0.05 mm).PEG、MgCl2和NaCl 的浓度对这两种蛋白的出晶时间、晶核数目、晶体大小和形状都有明显影响.结果表明,用此结晶法有利于CrFe蛋白和MnFe蛋白生长出可供X-射线衍射分析的大单晶.     

离子液体对固定化Saccharomyces cerevisiae细胞催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应的影响

对比研究了C4MIm.BF4-缓冲液混合体系和缓冲液单相体系中固定化面包酵母Saccharomyces cerevisiae细胞催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应的特性,系统探讨了离子液体C4MIm.BF4对该反应的初速度、最大转化率和产物对映体纯度的影响规律。在各自最优的反应条件下,固定化面包酵母细胞在缓冲液单相体系中催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应的初速度、最大转化率及产物e.e.值分别为84.8 mmol/(L.h)、99.2%和≥99.9%;而在C4MIm.BF4-缓冲液混合体系中,该反应的初速度、最大转化率及产物e.e.值分别为87.0 mmol/(L.h)、99.0%和≥99.9%。离子液体的存在,提高了固定化面包酵母细胞催化该反应的速度,但降低了固定化酵母细胞的操作稳定性。     

天然结晶纤维素的生物合成及其去晶化途径

纤维素是高等植物细胞壁的结构骨架和重要组成成分,由细胞质膜上的纤维素合成酶合成.一个纤维素合成酶亚基合成一根纤维素分子链,多个亚基聚集在一起形成末端复合体(TC),可同时合成多根葡聚糖分子糖链,其在氢键和范德华力作用下快速有序堆积,形成结构紧密的天然微纤丝结晶结构.质膜上有序线性排列的超分子TC合成结晶纤维素Ⅰα,而玫瑰花型排列的TC合成结晶纤维素Ⅰβ.结晶微纤丝的密切有效堆积是植物抗降解的天然屏障.高浓度的酸和离子液体可以在微纤丝间有效扩散,破坏晶体分子链的有序堆积、分子间氢键网络,甚至打断晶体内部的糖苷键,完成天然结晶纤维素的去晶化及解聚过程.酶分子的去晶化过程是发生在微纤丝特定表面上的非均相反应过程,可在常温常压下固或液表面上快速完成,但有效可及表面积是其主要限速瓶颈.因此结合物理、化学方法预处理,低成本高效打破限制酶分子有效扩散的屏障,增加酶分子对结晶纤维素特异性结合的效率和有效可及面积,从而实现天然结晶纤维素高效去晶化及绿色快速降解转化.