基于ChIP-Seq进行肿瘤睾丸抗原XAGE-1b基因表达蛋白的DNA结合位点鉴定

XAGE-1b（X antigen family member 1B）属于XAGE亚家族,是一种肿瘤 睾丸抗原（cancer/testis antigen,CTA）,表达于正常人睾丸组织和多种类型的肿瘤细胞中.本实验室前期研究发现,该基因在涎腺腺样囊性癌高转移细胞系中呈高表达.为了进一步研究XAGE-1b下游调控基因,本实验采用ChIP Seq技术筛查XAGE 1b蛋白质可能存在的DNA结合片段. 结果发现,XAGE-1b下游调控基因富集于细胞分裂（cell division,P-Value＝7.95e-04）、细胞周期调控（cell cycle,P-Value＝5.532e-03）、及癌症相关基因（GESA/MSigDB module_11,P-Value＝2.010e-06）中．同时发现,XAGE-1b下游调控多个基因的表达产物（NCBI/interactions 22827,P-Value＝4.678e-06）能与原癌基因c-Myc的启动子抑制蛋白PUF60发生蛋白质相互作用,并通过qPCR进行了验证．这些研究对阐明XAGE-1b在肿瘤细胞的增殖和转移中的作用有重要意义.     

敲减XAGE-1b基因表达降低ACCM和A673肿瘤细胞的增殖能力

XAGE是通过生物信息学方法发现的新一类肿瘤 睾丸抗原(cancer/testis antigen,CT抗原)基因,其主要表达亚型为XAGE-1b.已有的研究表明,该基因可能与肿瘤细胞的生长相关．本研究构建了针对XAGE-1b进行RNA干扰的重组腺病毒载体Adv-Sh1和Adv-Sh2．半定量和定量RT-PCR显示,Adv-Sh1比Adv-Sh2对XAGE-1b的干扰效率更高. 细胞荧光干扰实验显示,Adv-Sh1对XAGE-1b有显著的干扰作用．在细胞增殖和集落形成实验中,感染Adv-Sh1后的细胞增殖能力显著降低(Ｐ<0.01),形成的单克隆集落数也显著减少．研究结果表明,下调XAGE-1b基因表达使ACCM和A673肿瘤细胞的增殖能力均有降低,提示XAGE-1b在肿瘤生长过程中可能发挥重要作用．本研究为进一步深入研究XAGE-1b的功能和致癌机制打下了良好基础．     

牦牛和雄性不育犏牛睾丸PPP2CA、PME-1基因mRNA水平的比较

蛋白磷酸酶2A(PP2A)参与细胞中蛋白质的可逆磷酸化作用,在磷酸化信号通路调控方面具有重要功能,其活性受蛋白磷酸甲酯酶-1(PME-1)和其他因素的调控。为阐明牦牛杂交雄性不育的分子机制,本研究从牦牛睾丸中克隆了PP2A催化亚基α基因(PPP2CA)和PME-1基因c DNA序列,编码区长度分别为930 bp和1 143 bp,编码的氨基酸序列保守;定量PCR检测显示,犏牛(n=7)睾丸中PPP2CA与PME-1基因的m RNA水平均极显著低于牦牛(n=13,P0.01)。根据本研究结果,推测犏牛睾丸中这2个基因的显著下调可能会影响一些重要信号通路,且与犏牛雄性不育有关。     

MiR-26b是前列腺癌中的抑癌微RNA（英文）

微RNAs(又称miRNAs或miRs)是一类长度为19~24个核苷酸的单链非编码RNA分子.miRNA通过与其靶向的mRNA分子序列特异性互补配对,调节mRNA表达水平,抑制转录后的蛋白质翻译.miRNA在肿瘤中既可作为致癌因子也可作为抑癌因子.本研究前期已报道miR-26b在前列腺癌细胞系中低表达,并且抑制细胞自噬.本研究进一步全面揭示miR-26b对前列腺肿瘤细胞的作用.我们发现过表达miR-26b能够在体外抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭,并抑制裸鼠体内原位异种前列腺肿瘤的生长.为了探究miR-26b对前列腺癌细胞增殖和侵袭的潜在调控机制,我们进行了表达谱芯片鉴定miR-26b调控基因.表达谱芯片分析表明,在前列腺癌细胞系PC-3中过表达miR-26b后,显著上调的基因57个,显著下调的基因55个(变化倍数均大于2,且P值小于0.05).差异基因的功能多与细胞增殖、凋亡调控、蛋白质磷酸化和泛素化修饰调控过程相关,并且富集在多种信号通路中,例如TNF和TGF-β信号通路.在这些筛选出的基因中,CEACAM6表达水平下调2.17倍;序列分析及实验验证表明,CEACAM6的3′UTR区存在miR-26b的互补序列,是miR-26b的直接靶标.本研究证明了miR-26b能够靶向结合抑制CEACAM6的表达,从而抑制前列腺癌细胞在体外和体内的细胞增殖和侵袭活性,miR-26b是前列腺癌中的抑癌microRNA.     

MTNR1a和MTNR1b基因在繁殖期与非繁殖期雄性高原鼢鼠HPG轴上的表达

高原鼢鼠 (Eospalax baileyi) 终年营地下生活,感光受洞道限制,但褪黑素 (Melatonin) 分泌水平仍存有季节差异,为探明褪黑素对高原鼢鼠季节性繁殖的调控作用,研究利用q?PCR技术检测雄性高原鼢鼠繁殖期 (5月) 和非繁殖期 (9月) 下丘脑、垂体及睾丸中褪黑素受体1a (Melatonin receptor 1a, MTNR1a) 和褪黑素受体1b (Melatonin receptor 1b, MTNR1b) 基因mRNA的相对表达量,通过免疫组织化学技术对MTNR1a和MTNR1b在睾丸中定位,并采用Image Pro Plus软件进行免疫组化阳性评价。结果发现,高原鼢鼠繁殖期下丘脑和垂体中MTNR1a基因的相对表达量显著高于非繁殖期的相对表达量 (P < 0.05),MTNR1b基因的相对表达量在不同时期无显著差异 (P > 0.05),但非繁殖期睾丸中MTNR1a和MTNR1b基因的相对表达量均显著高于繁殖期 (P < 0.01);繁殖期除长形精子外的所有类型细胞以及非繁殖期的间质细胞、支持细胞和精原细胞中均观察到MTNR1a的阳性信号,繁殖期除精原细胞和长形精子细胞外的所有类型细胞,以及非繁殖期间质细胞和支持细胞中均观察到MTNR1b的阳性信号,且非繁殖期MTNR1a和MTNR1b的平均光密度值均显著高于繁殖期 (P < 0.01)。MTNR1a和MTNR1b基因在雄性高原鼢鼠HPG轴上的表达模式,提示了褪黑素在其季节性繁殖调控中的潜在作用。     

涎腺腺样囊性癌高低转移细胞系mRNA及蛋白质表达谱差异研究

转移性和侵袭性是恶性肿瘤的重要特征,与基因和蛋白质水平上一系列改变密切相关.应用mRNA抑制性消减杂交技术和双向电泳结合肽质量指纹分析技术,对涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞系的mRNA和蛋白质表达谱的差异性进行比较研究.实验结果显示,在抑制性消减杂交中,分别以两个细胞系为测试子,共获得差异片段34个,其中高转移株细胞中高表达的基因序列有6个,低转移细胞系中有28个,其中包括两个新的表达序列标签（EST）.对这些基因序列,进一步以RNA 斑点杂交对这些基因的表达状况进行验证并排除假阳性结果,结果发现,32个基因在mRNA水平上有不同程度的表达量改变,改变趋势与消减杂交结果一致.以蛋白质等电聚焦结合SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的双向电泳技术获得的总蛋白质分离,经PDQuest2DE软件分析结果表明, 高转移细胞系表达谱的平均蛋白质点数为(978±38), 低转移细胞系的平均蛋白质点数为(996±27).其中高转移细胞与低转移细胞相比,其蛋白质点有355个未被匹配 ,低转移细胞相比高转移细胞有222个未被匹配.对其中10个差异较明显的蛋白质点,进一步进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS)测定肽质量指纹图谱,用Peptident软件对SWISS PROT数据库比较分析,结果显示,Stratifin、Symplekin和乳腺癌相关抗原NY-BR-20等蛋白质在高转移细胞中表达,在低转移中未被检测到,B7蛋白质在低转移细胞中高表达,在高转移细胞中低表达.结果表明涎腺腺样囊性癌高转移特性与多种基因、蛋白质相关,这些基因或蛋白质参与血管生成、蛋白质合成、信号传递、细胞周期调控、分子伴侣以及免疫共刺激等多种生理活动.同时在mRNA和蛋白质水平上进行表达谱分析使结果更全面,具有明显的互补性,这些结果为进一步探索腺样囊性癌肿瘤转移分子机理以及肿瘤控制和基因治疗提供了重要的依据.     

MiR-125b在肿瘤发生发展中作用的研究进展

MicroRNAs(微小RNAs)是新近发现的内源性高度保守的非蛋白质编码的长约22核苷酸单链小分子RNA,在转录后水平上调节基因表达的重要调节因子.MiR-125b在多种肿瘤组织中表达异常,既有上调发挥癌基因作用的报道,也有下调发挥抑癌基因作用的报道,miR-125b在肿瘤中作用的研究结果众说纷纭,涉及到肿瘤细胞生命活动周期的各个过程,以下就miR-125b与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移、分化和耐药方面的最新研究进展作一综述.     

BRCA1在人类肿瘤细胞中的表达

人类乳癌易感基因1(BRCA1)是乳癌,卵巢癌和前列腺癌的危险因素之一,而且表现出许多的生物功能.采用WesternBlotting和半定量RT-PCR的方法,我们检测了内源性BRCA1蛋白质和mR-NA在从十一种人类肿瘤组织中建立的四十三种肿瘤细胞系的表达水平.在不同的肿瘤细胞中BR-CA1的表达水平是各不一样的.而且并没有发现BRCA1的表达和细胞的内源性p53基因状况有明显的相关性.通过采用细胞转染乳头状瘤病毒-E6致癌基因或采用畸变的p53基因(143Ala→Va1)而导致的p53基因功能失活并不对内源性BRCA1本底表达水平产生任何的影响,但两种与p53功能有关p21(-/-)和Gadd45基因剔除则轻微地增加BRCA1蛋白质的表达.因此,虽然我们目前还不清楚BRCA1在人类肿瘤细胞中不同表达的功能意义,但本文的结果为进一步研究BRCA1在不同肿瘤细胞系的生物功能提供了有价值的背景资料.     

PCNA等5种基因在小鼠睾丸发育过程中的表达

以出生1日、30日和成年昆明小鼠睾丸组织为实验材料,利用地高辛标记的基因探针在组织切片上进行DNA－mRNA分子原位杂交,研究了PCNA、cyclinD1、cdc2、P21和P16基因共5种细胞周期调控基因在小鼠睾丸发育中的表达变化。结果发现：PCNA基因在30日龄和成年鼠睾丸中都有强的表达;而cyclin D1基因只在30日龄的小鼠睾丸组织中有表达;P21、P16和cdc2基因在3个不同的发育阶段都没有表达。这些结果表明：(1)细胞周期调控基因cyclin D1、cdc2、P16和P21与小鼠睾丸发育和精子发生过程的细胞增殖控制关系不大,可能小鼠睾丸和精子发育过程中的细胞增殖调控与其他细胞的增殖调控有不同的机制;(2)cyclin D1基因在小鼠睾丸中的表达模式表明,cyclin D1基因在睾丸发育中有不同于细胞增殖促进的作用;(3)小鼠睾丸发育中,精子发生开始时期可能晚于30日龄。 Abstracts：Using in situ hybridization technique with Dig Labeled DNA probe, we studied the expression of PCNA,cyclin D1, cdc2, P21 and P16 gene in the test of one day old,30 days old and adult Kunming mouse.The results shows that the expression of PCNA gene was strong in the test of 30 days old and adult mouse; cyclin D1 gene only expressed in the test of 30 days old mouse; cdc2,P21 and P16 gene did not express in the test of all three groups of mouse.These results suggest that:(1)cyclin D1,cdc2,P16 and P21 genes are not related to the regulaton of cell cycle during test development and germ genaration, and possibly the machanism of cell cycle regulation during test development and germ genaration is different from other kind of cells;(2)cyclin D1 has other founctions except promoting cell profilation;and (3)the germ genaration during test development may start after 30 days old.     

MTNR1a和MTNR1b在牦牛不同组织中的表达及其在睾丸中的定位

褪黑素对调节季节性繁殖哺乳动物的生殖具有重要调节作用。其受体MTNR1a（Melatonin receptor 1a,褪黑素受体1a）主要参与昼夜节律和生殖调控,MTNR1b（Melatonin receptor 1b,褪黑素受体1b）与多种疾病发生密切相关。为了探讨褪黑素受体基因的生物学功能,本实验对牦牛不同组织中MTNR1a、MTNR1b基因的表达与定位情况进行了研究。采用qRT-PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR) 检测成年雄性牦牛各组织及不同发育阶段（30日龄,2岁、4岁、6岁和8岁龄）牦牛睾丸组织中MTNR1a、MTNR1b mRNA的表达规律,并运用免疫组化技术对不同年龄牦牛睾丸中MTNR1a、MTNR1b蛋白进行了定位研究。结果发现,MTNR1a mRNA在松果体组织中表达量最高,肺脏、肌肉和睾丸次之;随着年龄增加,MTNR1a mRNA在睾丸中的表达量逐渐升高,到4岁后表达量趋于平稳;MTNR1a蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸组织中均有表达,圆形精子呈现较强的免疫阳性,其次为初级精母细胞;MTNR1b mRNA在松果体表达量最高（P<0.05）,肾脏、肝脏和下丘脑次之;在不同年龄牦牛睾丸中MTNR1b mRNA均有表达,且随着年龄的增加表达量逐渐增加,在8岁时表达量最高;MTNR1b蛋白主要定位在圆形精子细胞中。MTNR1a、MTNR1b基因在牦牛不同组织及不同发育阶段睾丸中的广泛表达,揭示了其在雄性牦牛生殖等生理过程中的重要作用。     

SF-1诱导小鼠子宫内膜基质细胞增殖及其机制的研究

该研究分离并鉴定了原代小鼠子宫内膜基质细胞(mouse endometrial stromal cell,m ESC)。过表达类固醇生成因子-1(steroidogenic factor-1,SF-1)可显著诱导该细胞的增殖能力、促进增殖相关基因PCNA(proliferating cell nuclear antigen)及PH3(phospho-histone 3)的蛋白质水平表达增高以及激活PI3K-AKT-m TOR信号通路;PI3K信号通路抑制剂LY294002和m TOR信号通路抑制剂Rapamycin等可抑制mESC中SF-1过表达所引起p AKT S473、pm TOR S2448、pp70S6K T389、p S6 S235/236和p4E-BP1 T37/46的蛋白质水平的增高。该研究初步揭示了SF-1表达与mESC增殖的相关性。     

食管鳞癌中P33~(ING1b)、FXYD3和PINCH的相关性分析

PINCH表达在肿瘤间质,而FXYD3、P33~(ING1b)蛋白表达在肿瘤细胞,FXYD3、P33~(ING1b)和PINCH的相关性研究未见报道,本研究以期为肿瘤的发生和转移机制开辟新的思路。采用免疫组织化学方法(SP法)检测河北医科大学第一医院2000年7月~2004年5月各种临床资料齐全的64例食管鳞癌及相对应的肿瘤远断端的正常食管粘膜组织20例中FXYD3、PINCH和P33~(ING1b)的表达。结果显示P33~(ING1b)蛋白在肿瘤细胞胞质中的表达与PINCH蛋白表达呈正相关(r=0.529,p0.000 01),两种蛋白同时表达阳性的病例具有较高的淋巴结转移率(p=0.001);食管鳞癌中FXYD3蛋白的阳性表达也趋于与PINCH蛋白的阳性表达有一定的相关性(r=0.232,p=0.063),两种蛋白淋巴结转移表达同时阳性的表达呈正相关(r=0.577,p=0.008)。因此联合检测P33~(ING1b)、FXYD3和PINCH,有利于进一步探讨食管鳞癌的发生、发展和转移机制。     

组织微阵列技术研究肿瘤转移相关基因在鼻咽癌中的表达与临床意义

利用高通量组织微阵列结合免疫组化检测MT1-MMP、MT2-MMP、Ezrin、nm23-H1、E-cad和TIMP-2在鼻咽癌组织中的蛋白质表达,探讨肿瘤转移相关基因异常表达在鼻咽癌侵袭转移中的作用,筛选鼻咽癌转移相关分子标志物.结果发现,鼻咽癌组织存在MT1-MMP、Ezrin蛋白高表达(P<0.01)和nm23-H1、TIMP-2蛋白低表达(P<0.05).临床Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌和淋巴结转移鼻咽癌中MT1-MMP、MT2-MMP和Ezrin蛋白阳性表达显著高于临床Ⅰ期鼻咽癌和无转移癌(P<0.05,P<0.01),但临床Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌和淋巴结转移鼻咽癌中nm23-H1蛋白的阳性表达显著低于临床Ⅰ期鼻咽癌和无转移癌(P<0.05).鼻咽癌组织中MT1-MMP与MT2-MMP r=0.308,P<0.001),nm23-H1与E-cad(r=0.167,P<0.05)及TIMP-2(r=0.279,P=0.001),E-cad与TIMP-2(r=0.279,P=0.001)的蛋白质表达旱显著正相关.MT1-MMP与E-cad(r=-0.188,P<0.05)及TIMP-2(r=-0.233,P<0.05),Ezrin与E-cad(r=-0.204,P<0.05)的蛋白质表达呈显著性负相关.聚类分析显示,鼻咽癌MT1-MMP、MT2-MMP和Ezrin蛋白共同阳性表达显著高于慢性炎性鼻咽上皮(P<0.05),但nm23-H1、E-cad和TIMP-2蛋白在鼻咽癌组织中的共同阴性显著高于癌旁上皮和慢性炎性鼻咽上皮(P<0.05,P<0.01).多因素分析和有效性评估发现,MT1-MMP蛋白能较好地独立预测鼻咽癌淋巴结转移和临床进展.上述研究结果提示,多个肿瘤转移基因的蛋白质高表达,转移抑制基因的低表达和这些基因的蛋白质表达失平衡在鼻咽癌淋巴结转移和临床进展过程中起重要作用.MTI-MMP蛋白可作为预测鼻咽癌淋巴结转移的较好分子标志.     

利用四环素调控系统研究 CHIP 对TGF-β信号通路的抑制性调节

为了研究伴侣分子相互作用蛋白 CHIP 对 TGF-β信号通路的调控,利用四环素基因表达调控系统,建立四环素调控表达 CHIP 的稳定细胞系 (Mv1Lu-Tet off-CHIP). 利用此细胞模型,发现 CHIP 的过量表达可显著降低细胞内 Smad2/3 蛋白水平;荧光素酶报告分析也表明开启 CHIP 蛋白表达可明显降低 Smads 介导的基因转录活性;进一步的免疫印迹结果显示 CHIP 蛋白可明显下调 TGF-β所诱导的下游基因 JunB 的表达 . 上述结果提示 CHIP 可以作为一种新的蛋白质分子抑制性调节 TGF-β信号通路 .     

水稻转录因子WRKY42的转录、表达及其与W-box的结合特征分析

WRKY是植物中最大的转录因子家族之一.本文对水稻WRKY42基因的转录分析发现,该基因在水稻苗期和花药中转录,其蛋白质可在各时期的叶片中检测到.在Xa21介导的抗白叶枯病过程中,接菌后期可检测到明显的诱导表达条带,比较其在抗、感和对照反应中的表达丰度发现,在抗、感反应中的表达相似但均明显大于对照反应,推测WRKY42蛋白质在水稻-白叶枯病菌互作反应中发挥作用.我们克隆并在细菌中表达了WRKY42蛋白质,采用微量热泳动(microscale thermophoresis)技术,调查了WRKY42与病程相关基因PR1a和PR1b启动子区顺式元件W-box的互作,发现它们之间可发生特异结合,其解离常数分别为73.3μmol/L和58.3μmol/L.上述数据提供了WRKY42调控下游基因的直接证据,支持WRKY42在水稻抗病过程中发挥作用.文章提出了WRKY转录因子在水稻与白叶枯病菌互作过程中的作用模式.     

磷脂酰乙醇胺结合蛋白的基础和临床研究

磷脂酰乙醇胺结合蛋白 ( phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP )是一类高度保守的多功能蛋白质,广泛存在于不同物种中.在同一物种的多种组织和不同类型细胞中均有表达.PEBP在多条信号转导通路中具有重要的调控作用.PEBP通过与Raf-1相互作用抑制MAPK信号通路的活性,因此也被称为Raf-1激酶抑制蛋白(RKIP);同时,PEBP还参与了PKC、G蛋白偶联受体和NF-κB信号通路的调控.在临床医学研究中发现,PEBP作为海马胆碱神经刺激肽(HCNP)的前体蛋白在阿尔采末病(AD)的形成过程中发挥重要作用.由于PEBP可以抑制肿瘤转移和促进肿瘤细胞凋亡,因此也被认为是一种肿瘤转移的抑制基因.新近研究表明,PEBP参与细胞周期的纺锤体检查点的调控,PEBP的缺失可导致染色体异常.在直肠结肠癌,PEBP基因启动子区的高甲基化可导致其不表达,这可能是癌症转移的分子基础.     

胎盘特异性基因PLAC1与肿瘤

胎盘特异性基因PLAC1(placenta-specific 1 gene)具有癌-睾丸(cancer-testis antigen,CT)抗原的特点,即能在多种肿瘤组织中表达,而在正常组织(除胎盘和睾丸)几乎不表达。PLAC1编码一种膜蛋白,该蛋白质具有一定的免疫原性,能在肿瘤患者体内引起体液免疫和细胞免疫。目前的研究结果显示PLAC1代表一类新的肿瘤相关抗原,可能成为肿瘤免疫治疗的一个靶点。     

人受精促进肽受体基因（TCP11b）的剪接、克隆和差别表达

运用同源比较和PCR法 ,从人睾丸组织中分离了人受精促进肽受体TCP11基因的一个新的剪切体TCP11b ,它编码 5 0 3个氨基酸的蛋白质 ,与TCP11a相比 ,在基因组的 5′端存在复杂的外显子剪接现象。运用荧光原位杂交 (FISH)方法 ,显示该基因定位到人染色体 6p2 1。Northern杂交及多组织RT PCR的结果显示该转录本在正常睾丸中表达 ,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因的表达。该结果结合mTcp 11功能的提示 ,TCP11b这种转录本对精子发生和人受精过程可能起重要作用。     

肺癌转移相关蛋白的比较蛋白质组分析与鉴定

采用比较蛋白质组技术对肺巨细胞癌高、低转移株的蛋白质表达谱进行双向电泳分离和MALDI-TOF分析,并在蛋白质和mRNA水平进行进一步验证,成功鉴定了11个肺癌转移相关蛋白.其中,候选蛋白膜联蛋白1(ANX1)、细胞骨架蛋白(CK18)、Rho-GDP解离抑制剂1(GDIR)、原肌球蛋白3(TPMF)、蛋白谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶(TGLC)和白介素18(IL-18)在肺巨细胞癌高转移株显著高表达,而候选蛋白核氯离子通道蛋白1(CLI1)、蛋白质二硫键异构酶(ER60)、肌酸激酶、硫氧还蛋白过氧化物酶1(PDX1)和热休克蛋白60(CH60)在肺巨细胞癌高转移株显著低表达.大多数的候选蛋白可通过调控肿瘤细胞的生长、迁移、粘附、凋亡和肿瘤免疫等环节来影响肿瘤细胞的侵袭和转移能力.迄今为止,还未见候选蛋白CLI1和IL-18与肺癌转移相关的报道,提示这两种蛋白质可能为新的肺癌转移相关蛋白.