奶牛乳腺上皮细胞系的建立及高温对细胞超微结构的影响

应用差酶消化法和反复贴壁法在体外建立奶牛乳腺上皮细胞培养方法,以细胞流式术、免疫组化、免疫印迹、超微结构观察等方法对乳腺上皮细胞特性进行检测,并研究高温热刺激对乳腺细胞超微结构的影响。实验结果表明,运用本方法建立的奶牛乳腺细胞系上皮特性及遗传特征完备;41℃1h的高温热刺激可使乳腺细胞染色质浓缩、线粒体肿胀、空泡化,形成凋亡小体,说明高温可以诱发乳腺细胞凋亡。     

奶牛乳腺上皮细胞系的建立及高温对细胞超微结构的影响

应用差酶消化法和反复贴壁法在体外建立奶牛乳腺上皮细胞培养方法,以细胞流式术、免疫组化、免疫印迹、超微结构观察等方法对乳腺上皮细胞特性进行检测,并研究高温热刺激对乳腺细胞超微结构的影响。实验结果表明,运用本方法建立的奶牛乳腺细胞系上皮特性及遗传特征完备;41℃ 1h 的高温热刺激可使乳腺细胞染色质浓缩、线粒体肿胀、空泡化,形成凋亡小体,说明高温可以诱发乳腺细胞凋亡。     

组合添加雌激素和催乳素对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响

为了探讨组合添加雌激素和催乳素对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)酪蛋白合成的影响及作用机制,以课题组前期筛选出的最佳雌激素和催乳素浓度为基础,开展组合添加试验.雌激素和催乳素的添加总量为300 ng/mL,根据二者的添加比例分为试验Ⅰ组(对照组,不添加雌激素和催乳素)、试验Ⅱ组(雌激素∶催乳素=5∶1)、试验Ⅲ组(雌激素...     

乳蛋白调控元件和乳腺表达载体的研究进展

利用转基因动物乳腺生物反应器生产重组蛋白是一项极具潜力和开发价值的生物技术,但成功的例子并不多,主要是由于乳蛋白的表达调控机制还未完全阐明,构建的表达载体不足以克服位置效应的影响,使得外源基因的表达难以预期。目前乳腺生物反应器研究的热点是对乳蛋白表达调控元件进行更深入的研究,构建基于酵母人工染色体、细菌人工染色体的经过修饰的乳蛋白基因座载体。简要综述了乳蛋白表达调控元件和表达载体的研究进展。     

亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪和乳蛋白合成相关基因表达的影响

该文主要研究了添加不同浓度的亚油酸(顺-9,顺-12-十八碳二烯酸)(0、20、40、80、120μmol/L)对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响。通过MTT法检测细胞活力,利用甘油三酯试剂盒检测BMECs内甘油三酯(triglyceride,TAG)的合成量,实时荧光定量PCR检测乳脂和乳蛋白合成相关基因的表达。结果表明:(1)添加20μmol/L的亚油酸能促进BMECs的增殖,120μmol/L的亚油酸组BMECs的相对增殖率显著低于对照组(P0.05);(2)40μmol/L和80μmol/L亚油酸添加组BMECs中TAG的合成量显著高于对照组(P0.05);(3)添加20μmol/L亚油酸显著上调αs1-酪蛋白(casein alpha s1 identifiers symbols,CSN1S1)和κ-酪蛋白(κ-casein,CSN3)基因的表达,而80μmol/L和120μmol/L亚油酸显著下调CSN1S1和CSN3基因的表达(P0.05);(4)120μmol/L亚油酸上调了真核启始4E结合蛋白-1(eukaryotic initiation factor 4E-binding-protein-1,4EBP1)基因的表达,下调了核糖体蛋白S6激酶-1(ribosomal protein S6 kinase-1,RPS6K1)基因的表达(P0.05);(5)添加20~120μmol/L亚油酸显著下调脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-Co A desaturase,SCD)、脂肪酸结合蛋白-3(fatty acid-binding protein-3,FABP3)的基因表达(P0.05);(6)20μmol/L亚油酸添加组过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARG)基因表达量显著高于对照组,而120μmol/L亚油酸组PPARG、固醇调节元件结合因子-1(sterol regulatory element binding factor-1,SREBF1)的表达量显著低于对照组(P0.05)。综上所述,20~40μmol/L的亚油酸对BMECs乳脂肪和乳蛋白合成有较好的促进效果。     

高温对乳腺上皮细胞生长及凋亡的影响

近年来随着生物技术的发展,对应激的研究已经深入到细胞水平上,Li met al·(2006)揭示细胞抵抗热应激的能力因细胞种类、热处理的温度、时间的不同而存在差异;热应激还会引起G1/S或G2/M细胞周期调控点的阻滞(Kuhl and Rensing,2002;Fuse et al.,1996),剧烈的热应激还可以诱导细     

氢化可的松对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪合成的影响

该研究旨在探讨不同浓度的氢化可的松处理对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cells,BMECs)增殖、甘油三酯(triglyceride,TAG)合成、脂滴的形成以及乳脂肪合成相关基因表达的影响。采用单因子随机实验设计,以不添加氢化可的松组为对照组,处理组的氢化可的松浓度分别为1、10、100、1 000 ng/m L。各组细胞处理24 h后,通过四甲基偶氮唑盐(thiazoly blue tetrazolium,MTT)比色法检测细胞活力;利用试剂盒检测胞内TAG的含量;使用油红O染色法检测细胞内乳脂球的合成;采用实时定量PCR法检测乳脂合成相关基因的表达。结果表明,氢化可的松处理对BMECs增殖无显著影响(P0.05);与对照组相比,100 ng/m L氢化可的松组能够显著提高TAG的合成量、增加胞内脂滴的形成以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)的基因表达(P0.05);10 ng/m L和100 ng/m L氢化可的松组能够显著上调乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylase,ACC)、二酰甘油酰基转移酶(diacylgycerol acyltransferase,DGAT)的基因表达(P0.05);1、10、100 ng/m L氢化可的松组能够显著上调脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)基因表达(P0.05),且1 ng/m L的促进效果最明显,而1 000 ng/m L则显著抑制了FASN的表达(P0.05)。该研究结果说明,氢化可的松能够促进BMECs乳脂肪合成,且100 ng/m L的剂量对乳脂合成的促进效果最佳。     

14-3-3γ蛋白协同mTOR信号通路影响奶牛乳腺上皮细胞生理功能

14-3-3γ作为蛋白质与蛋白质之间的"桥梁蛋白",广泛参与细胞凋亡、细胞分裂、信号转导和蛋白质合成等生物体所有的重要生命活动的调节。以体外培养的荷斯坦奶牛(Vaccas)乳腺上皮细胞(dairy cow mammary gland epithelial cells,DCMECs)为模型,研究14-3-3γ对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂合成的影响。瞬时和稳定转染p GCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ即14-3-3γ过表达的奶牛乳腺上皮细胞,应用CASY细胞活力分析仪分析细胞活力的变化,测定细胞中甘油三脂(triglyceride,TG)和β-酪蛋白(β-Casein,CSN2)的合成,并且通过Western blot检测DCMECs中m TOR(mammalian target of rapamycin,m TOR)和p-m TOR的表达量,探究14-3-3γ影响奶牛乳腺上皮细胞生理功能的机制。结果显示,瞬时和稳定转染p GCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ的奶牛乳腺上皮细胞相对正常培养的奶牛乳腺上皮细胞,细胞活力极显著增强(P0.01),CSN2和TG表达量极显著增加(P0.01),同时m TOR和p-m TOR的表达量也显著增加(P0.01)。研究结果表明14-3-3γ参与泌乳关键信号通路即m TOR信号通路,能够增强乳腺上皮细胞活力,促进奶牛乳腺上皮细胞CSN2和TG的合成,丰富了奶牛泌乳信号通路,为乳品质研究提供了新的理论依据。     

硬脂酸及血清对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成关键酶的影响

通过检测添加硬脂酸和血清后体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成关键酶的表达变化,阐明硬脂酸及血清对乳脂合成的影响,为建立体外乳脂合成细胞培养模型提供实验依据。采用ELISA法检测乳脂合成关键酶ACC、FAS、SCD含量。结果表明,分别添加硬脂酸和血清能显著上调ACC、FAS、SCD含量;同时添加血清和硬脂酸要比单独添加血清和单独添加硬脂酸更加明显促进乳脂关键酶的表达。     

MTT比色法检测赖氨酸、蛋氨酸对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

采用噻唑蓝比色法检测赖氨酸、蛋氨酸对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响。赖氨酸和蛋氨酸在培养基中的添加浓度分别为0、0.05、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6mmol/L和0、0.025、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8mmol/L;培养期为24、48和72h。结果表明,赖氨酸在0.8-1.6mmol/L、蛋氨酸在0.4-0.8mmol/L浓度范围内对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的促进作用最明显且在48h时增殖作用最强(P0.0001)。     

miR-221对小鼠乳腺上皮细胞增殖和泌乳功能的影响

MicroRNA（miRNA）是一类大约22个核苷酸的非编码RNA.miR-221能通过调控受体表达,引发肿瘤形成、细胞增殖和组织器官发育.本文应用脂质体转染技术,改变miR-221在小鼠乳腺上皮细胞和组织中的表达量.采用HPLC、Western 印迹、电镜技术等观察miR-221对小鼠乳腺上皮细胞和乳腺组织的影响.结果表明,miR-221沉寂后,细胞增殖能力增强（P<0.01）,β酪蛋白表达增加（P>0.05）,生长激素受体(GHR)表达增强（P<0.01）,泌乳期乳腺组织中上皮细胞数量增加（P<0.05）,小鼠泌乳量增加（P<0.05）.结果提示,miR-221可能通过抑制靶蛋白GHR表达,进而抑制乳腺上皮细胞增殖和泌乳.     

Adhesion of Staphylococcus aureus to Bovine Mammary Epithelial Cells Induced by Growth in Milk Whey

Staphylococcus aureus strains isolated from bovine intramammary infection (mastitis) were tested for adhesion to bovine mammary epithelial cells after growth in milk whey or TSB. Bacteria grown in milk whey adhered more efficiently to mammary gland epithelial cells in vitro than the corresponding homologous bacteria grown in TSB. Trypsin treatment of milk whey-grown S. aureus had no effect on their adherence. Whereas, pretreatment with periodate significantly decreased bacterial adherence capacity. Periodate treatment of TSB-grown bacteria had no effect on adhesion to the mammary gland epithelial cells.     

miR-138对小鼠乳腺上皮细胞的作用及其调控的靶序列

miRNA是一类长约20～25 nt的内源性非编码蛋白的小RNA.miRNAs的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡等过程,但目前对miRNA在细胞中的确切功能和其如何发挥作用知之甚少.应用miRNA基因沉默技术,抑制小鼠乳腺上皮细胞miR-138的表达,应用荧光定量PCR、Western blot、细胞活力分析技术等分析mi-138的表达及mLR-138对小鼠乳腺上皮细胞的影响,结果显示,miR-138抑制后细胞活性增强(P＜0.05),PRL-R蛋白表达增强(P＜0.05),信号转导通路分子STAT5、MAPK表达加强.研究认为,miR-138抑制小鼠乳腺上皮细胞的增殖.miR-138在乳腺上皮细胞调控的靶序列是PRL-R,抑制其表达而发挥作用.miR-138通过调控STAT5、MAPK信号转导通路而调控乳腺上皮细胞增殖.     

研究: 奶牛与水牛初乳中乳寡糖组分比较研究

乳寡糖是由乳汁中含量丰富的固体物质组成．研究结果表明,乳寡糖有提高免疫、益生元及抗感染等作用,已发现与婴儿肠道发育、神经智力发育等多方面关系密切．水牛奶是除牛奶外的第二大奶源,国际上公认其为营养含量高、口感好的优质乳制品,但目前针对水牛乳寡糖的研究多以美洲水牛为研究对象,尚无中国水牛的相关研究．本研究利用固相萃取对已脱脂和除去蛋白质的广西水牛初乳乳汁样品进行纯化,并采用苯胺 (aniline,Bn)衍生化试剂对其进行衍生化处理,通过UPLC-ESI-Q-TOF-MS液相质谱进行优化后,对水牛初乳中的寡糖组分进行测定并与牛乳进行了对比,最终测得奶牛初乳中19种及水牛初乳中的9种乳寡糖组分,并对二者的种类及含量进行比较,发现在两种初乳的乳寡糖中,中性糖二糖m/z 385.15和中性糖三糖m/z 547.21以及酸性糖m/z 635.23均为其主要寡糖成分,与其他乳寡糖相比含量相对较高．总体而言水牛初乳中的中性寡糖占比比奶牛初乳高,二者中性糖占乳寡糖总量的比例分别为88.88%和63.16%．     

The Impact of ABCG2 on Bovine Mammary Epithelial Cell Proliferation

The ATP-binding cassette transporter, ABCG2, has been identified as a gene of significance in the regulation of bovine lactation by a number of gene mapping studies yet its role in lactational physiology remains unclear. We have used the potent ABCG2 specific inhibitor, Ko143, to investigate role of ABCG2 in primary bovine mammary epithelial cell (BMEC) proliferation and differentiation. After incubation with Ko143, the proliferation rate of BMECs was reduced at 48 and 72 hours by up to 80% (P < 0.001), and the effect was dose-dependent (approximately 40% with 10 nM Ko143 and 80% with 20 nM Ko143). Morphological changes in BMEC mammosphere formation were not observed when co-incubated with Ko143. Our results suggested that ABCG2 plays a role in mammary epithelial cell proliferation and that functional polymorphisms in this gene may influence the cellular compartment of the mammary gland and potentially milk production.     

具有乳腺导管再生能力的小鼠乳腺原基细胞群黏附因子的表达特点

乳腺干细胞是研究器官形成、细胞增殖、分化、生存和凋亡等信号通路的理想模型,而近来的研究发现许多成体干细胞的特异性表面标记都与细胞黏附分子(celladhesion molecule,CAM)家族相关.因此,研究胚胎期乳腺干/祖细胞群的黏附分子基因表达特点,对于纯化和鉴定胚胎期乳腺干/祖细胞具有重要指导意义.用成年小鼠乳腺上皮干细胞的标记CD24和CD49f来分选小鼠胚胎期14天乳腺原基细胞群,发现CD24+和CD49f+双阳性的乳腺原基细胞包含两个细胞群:CD24hiCD49f+细胞群和CD24medCD49f+细胞群.它们占乳腺原基总细胞的比例分别为16%和47%.在随后的细胞培养实验和体内移植再生实验中发现,CD24medCD49f+细胞群可以贴壁,而且具有再生乳腺导管的能力,相反,CD24hiCD49f+细胞群既不能贴壁也不具有移植再生能力.这些结果表明,这两个细胞群分别代表不同的细胞类型,而CD24medCD49f+细胞群有可能包含具有自我更新能力的乳腺原基干/祖细胞.挑选了可能与乳腺相关的19个黏附分子,并对这两群细胞进行了定量PCR检测.结果表明,具有乳腺导管重建能力的CD24medCD49f+细...     

牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性

采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牛乳腺上皮细胞。形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征;染色体分析结果表明,培养的细胞具有正常的染色体数目。通过荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白5和8。该细胞在添加胰岛素、氢化可的松以及羊催乳素的无血清培养液中诱导培养时,用RT-PCR方法检测到了β-酪蛋白基因的转录。这些结果表明,分离培养的细胞是乳腺上皮细胞,这些细胞在诱导培养的条件下能够转录表达β-酪蛋白。     

RMP基因干扰对肝癌细胞周期的影响

目的:建立RMP(RPB5-Mediating Protein)基因干扰的稳定细胞株,研究RMP基因干扰对正常肝细胞及其肝癌细胞周期的影响.方法:构建RMP基因的短发卡RNA(short-hairpin RNA,shRNA)真核表达载体pGPU6-Neo-RMPi-484.通过脂质体转染的方法转染到SMMC-7721肝...     

Transplantation of a Mammary Stromal Cell Line into a Mammary Fat Pad: Development of the Site-Specific in Vivo Analysis System for Mammary Stromal Cells

The interaction between mammary epithelial and stromal tissue is considered to be important in breast tissue development. In this study, we developed a transplantation procedure for the mammary stromal fibroblastic cell line (MSF) to examine its life in vivo. First we established MSF cells which stably expressed lacZ (lacZ/MSF) and had characteristics of mammary stromal cells. The lacZ/MSF cells were then transplanted into a cleared mammary fat pad of syngenic mice with and without mammary primary epithelial organoids. Whole mount X-gal and carmine staining of the transplants revealed that a number of undifferentiated lacZ/MSF cells survived around the mammary epithelial tissue when transplanted with organoids. These results indicate that transplantation of MSF cells into mammary fat pad was accomplished by co-transplantation with primary mammary organoids. Finally, we discuss the application of transplantation procedure for in vivo studies of the mammary stromal tissue development and stromal-epithelial interactions.