温度调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸

正L-丙氨酸是最小的手性分子之一,被用于医药和兽药行业,与其他L-型氨基酸共同用作手术前和手术后的营养剂[1]。由于L-丙氨酸具有甜味,也被用于食品添加剂[2]。目前,L-丙氨酸全球需求年增长率为20%,主要增长地区是亚洲、北美等。然而,L-丙氨酸产量和价格基本被日本垄断和控制。国内企业生产规模小,生产菌种陈旧低效,L-丙氨酸的供应量远低于市场需求量。     

温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响

目的：研究变温控制对大肠杆菌TRTH L-色氨酸补料分批发酵过程中生物量、色氨酸产量、比生长速率及质粒稳定性的影响。方法：利用5L自控发酵罐对L-色氨酸补料分批发酵过程进行温度控制,对不同温度下相关参数进行分析比较,确定优化的温度控制方案。结果：以30-36％顺序升温的工艺进行发酵得到理想结果,与单一温度控制策略相比,L-色氨酸产量提高了15．4％;色氨酸的比合成速率提高了21．6％;质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平。结论：温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵有重要影响。     

代谢工程改造大肠杆菌一碳模块高效合成L-甲硫氨酸

L-甲硫氨酸又名L-蛋氨酸,是人体必需8种氨基酸之一,在饲料、医药、食品领域具有重要应用。以实验室前期构建的M2(Escherichia coli W3110?IJAHFEBC/PAM)为出发菌株,以模块化代谢工程策略构建了一株L-甲硫氨酸高产菌株。首先通过过表达亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MetF)和筛选不同来源的丝氨酸羟甲基转移酶(hydroxymethyltransferase,GlyA),增强了一碳模块甲基供体的生成,优化了一碳模块。随后针对一碳模块的前体供应,过表达了胱醚裂解酶(cysteamine lyase,MalY)和半胱氨酸内运基因(fliY),有效地提高了L-高半胱氨酸和L-半胱氨酸的供应。最终摇瓶发酵L-甲硫氨酸的产量由2.8 g/L提高至4.05 g/L,5 L发酵罐中达到18.26 g/L。研究结果表明,一碳模块对L-甲硫氨酸的生物合成具有十分重要的影响,在细胞内通过优化一碳模块,可以实现L-甲硫氨酸的高效生物合成。本研究为进一步提高微生物发酵生产L-甲硫氨酸的水平奠定了基础。     

大肠杆菌发酵生产L-色氨酸工艺简析

本文对L-色氨酸进行了简要概述,指出利用大肠杆菌工程菌直接发酵生产L-色氨酸为国内主流方法,并对其成熟的发酵工艺控制、提取工艺进行了简析,并指出部分可进一步优化的工艺点。其中发酵工艺简析包括菌种培养基增加一定溶度抗生素和控制发酵温度来控制质粒稳定性;分析物料作用并提出优化后的种子、发酵培养基组成;菌种无需控制溶氧,而发酵则用溶氧反馈补料;控制乙酸和氨氮浓度、顺序升温缩短周期降低抑制性副产物作用。分离提取工艺简析包括硫酸酸化p H2-3,陶瓷膜过滤并控制滤液平均单位为14000-18000u/ml,阳离子树脂纯化,醋酸调p H5.89,0.5%活性炭60℃脱色20-30min,蒸发浓缩结晶,纯化水洗涤整条工艺路线。     

丙氨酸转氨酶修饰对大肠杆菌L-色氨酸合成的影响

探究大肠杆菌细胞内负责L-丙氨酸合成的转氨酶对菌株代谢及L-色氨酸合成的影响。运用Red重组技术分别对编码L-丙氨酸转氨酶的基因alaA、alaC和avtA进行敲除。通过摇瓶和50 L罐中探究其对L-色氨酸积累、L-丙氨酸代谢及菌体生长变化情况。结果显示,除3种L-丙氨酸转氨酶全部缺失的工程菌L-丙氨酸合成受阻、菌体生长受到较强抑制外,其它各任意一种或两种丙氨酸转氨酶缺失菌株的生长并未有较大差异,但色氨酸的合成变化显著。其中alaA和alaC双基因缺失的E.coli FS-T4工程菌,摇瓶发酵L-色氨酸产量达6.08 g/L,L-丙氨酸含量仅0.16 g/L,较出发菌株分别提高了26.7%和降低了91.0%。在50 L罐中E.coli FS-T4工程菌L-色氨酸产量最高可达41.9 g/L,糖酸转化率达20.5%,分别较出发菌株提高了13.8%和5.1%。转氨酶AlaA和AlaC的同时缺失,既可以满足细胞整体氨基酸池的需要,而且有利于减少杂酸的积累,使得更多的碳源流向L-色氨酸的合成。     

模块化工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸

L-色氨酸作为一种必需氨基酸,广泛应用于食品、饲料和医药等领域。目前,微生物法生产L-色氨酸存在转化率低等问题。为此,本研究通过敲除L-色氨酸操纵子阻遏蛋白(L-tryptophan operon repressor protein, trpR)、替换l-色氨酸弱化子(trpL)、引入抗反馈调节的aroG^fbr等,获得可积累11.80 g/L L-色氨酸的底盘菌株大肠杆菌(Escherichia coli)TRP3。在此基础上,将L-色氨酸合成途径分为中心代谢途径模块、莽草酸(shikimic acid, SA)途径至分支酸(chorismic acid, CHA)模块、分支酸至L-色氨酸模块,并借助启动子工程,通过平衡中心代谢途径模块、莽草酸途径至分支酸模块、分支酸至L-色氨酸模块,获得工程菌E.coli TRP9。在5 L发酵罐中,工程菌E.coli TRP9的L-色氨酸产量提升至36.08 g/L,糖酸转化率提升至18.55%,达到理论转化率的81.7%。本研究利用模块工程策略,构建了高产L-色氨酸生产菌株,为l-色氨酸的规模化生产奠定了良好的基础。     

代谢工程改造大肠杆菌合成己二酸

己二酸是一种具有重要应用价值的二元羧酸,是合成尼龙-66的关键前体。目前,生物法生产己二酸存在生产周期长、生产效率低的问题。本研究选择一株野生型高产琥珀酸菌株大肠杆菌(Escherichia coli) FMME N-2为底盘细胞,首先通过引入逆己二酸降解途径的关键酶,成功构建了可合成0.34 g/L己二酸的E. coli JL00菌株;接着,对合成路径限速酶进行表达优化,使E. coli JL01菌株在摇瓶发酵条件下产量达到0.87 g/L;随后,通过敲除sucD基因、过表达acs基因和突变lpd基因的组合策略平衡己二酸合成前体的供应,优化菌株E. coli JL12己二酸产量进一步提升至1.51 g/L;最后,在5 L发酵罐上对己二酸发酵工艺进行优化。工程菌株经72 h分批补料发酵,己二酸的产量达到22.3 g/L,转化率为0.25 g/g,生产强度为0.31 g/(L·h),具备了一定的应用潜力。本研究可为包括己二酸在内的多种二元羧酸细胞工厂的构建提供理论依据和技术基础。     

ppc基因敲除对大肠杆菌L-色氨酸发酵的影响

目的：减少大肠杆菌L-色氧酸前体物质磷酸烯醇式丙酮酸向草酰乙酸的代谢流,提高其L-色氨酸的产量。方法：以大肠杆菌TRTH0709为出发菌株,利用Red重组敲除技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Ppc）编码基因PPc,并经测序和酶活性检测确证;对出发菌株和基因敲除菌株进行L-色氖酸发酵,对比分析发酵结果。结果：测序和酶活性检测结果表明ppc基因被成功敲除。发酵结果表明,与出发菌株相比,基因敲除菌株TRTH0709△ppc生长速度减慢,最终生物量减少32％,L-色氯酸产量降低27％,但糖酸转化率提高6％;向发酵培养基中添加1％琥珀酸后,TRTH0709△ppc的生长速率和产酸量有所提高,但仍与出发菌株有一定差距。结论：虽然ppc基因敲除对菌体生长和产酸量影响较大,但能有效提高其糖酸转化率;选育Ppc弱化的突变株以达到减弱代谢流且不影响菌体生长,以及增加,L-色氨酸积累的目的,将是本研究今后的主要方向。     

产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysC~(fbr)、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysC~(fbr))、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。     

以甘油为底物利用重组大肠杆菌生产聚3-羟基丙酸

【目的】解决前期研究中所构建的以甘油为底物合成聚3-羟基丙酸(P3HP)的代谢途径中存在两个主要的问题——细胞内还原力不平衡和质粒丢失,以提高P3HP的产量。【方法】克隆来源于肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇(1,3-PDO)氧化还原酶基因,构建P3HP和1,3-PDO联产的菌株,解决细胞内还原力不平衡的问题。利用自杀性载体系统介导的同源重组技术,将甘油脱水酶及其激活因子的基因整合到大肠杆菌基因组中,提高质粒的稳定性。同时,对发酵条件进行优化。【结果】菌种改造和发酵条件优化显著提高了P3HP产量,在摇瓶条件下到达2.7 g/L,比以前的报道提高2倍,并可同时得到2.4 g/L 1,3-PDO。【结论】该重组大肠杆菌合成P3HP的产量得到提高,具有较好的工业化生产前景。     

Polyhydroxyalkanoate production in recombinant Escherichia coli

Abstract The bacterial species Escherichia coli has proven to be a powerful tool in the molecular analysis of polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis. In addition, E. coli holds promise as a source for economical PHA production. Using this microorganism, clones have been developed in our laboratory which direct the synthesis of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) to levels as high as 95% of the cell dry weight. These clones have been further enhanced by the addition of a genetically mediated lysis system that allows the PHB granules to be released gently and efficiently. This paper describes these developments, as well as the use of an E. coli strain to produce the copolymer poly-(3-hydroxybutyrate- co -3-hydroxyvalerate (PHB- co -3-).     

重组大肠杆菌产琥珀酸研究进展

琥珀酸作为一种优秀的C4平台化合物, 广泛用于生物高分子、食品与医药等行业, 市场潜在需求量巨大。采用微生物发酵法生产琥珀酸, 可利用廉价的可再生资源, 实现石油的原料替代, 而且过程污染小, 环境友好, 且在发酵过程中可吸收固定温室气体CO2, 开辟了其利用的新途径, 近年来引起了广泛关注。在丁二酸生产菌株中, 大肠杆菌由于其遗传背景清楚, 易操作易调 控, 培养基要求简单, 生长迅速等优点, 近年来被广泛用于研究以获得产琥珀酸优秀生产菌株。本工作系统综述了产琥珀酸大肠杆菌构建中所采用的基因工程策略及代谢工程技术, 并探讨了今后研究的方向。     

Optimum melanin production using recombinant Escherichia coli

AIMS: A parametric study was conducted to define optimum conditions to achieve high yields in the conversion of tyrosine to eumelanin (EuMel) using recombinant Escherichia coli. METHODS AND RESULTS: Escherichia coli W3110 (pTrcMutmelA) expressing the tyrosinase coding gene from Rhizobium etli and glucose-mineral media were used to transform tyrosine into EuMel. Batch aerobic fermentor cultures were performed to study the effect of temperature, pH and inducer concentration (isopropyl-D-thio-galactopyranoside) on melanin production. Under optimum conditions, 0.1 mmol l(-1) of isopropyl-D-thio-galactopyranoside, temperature of 30 degrees C, and changing pH from 7.0 to 7.5 during the production phase, a 100% conversion of tyrosine into EuMel is obtained. Furthermore, tyrosine feeding allowed us to obtain the highest level (6 g l(-1)) of EuMel produced by recombinant E. coli reported until now. CONCLUSIONS: The most important factors affecting melanin formation and hence influencing the rate and efficiency in the conversion of tyrosine into EuMel in this system, are the temperature and pH. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: Maximum theoretical yield was obtained using a simple culture process and mineral media to convert tyrosine (a medium value compound) into melanin, a high value compound. The process reported here avoids the use of purified tyrosinase, expensive chemical methods or the cumbersome extraction of this polymer from animal or plant tissues.     

Parametric studies of ethanol production form xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli

The conversion of xylose to ethanol by recombinant Escherichia coli has been investigated in pH-controlled batch fermentations. Chemical and environmental parameters were varied to determine tolerance and to define optimal conditions. Relatively high concentrations of ethanol (56 g/L) were produced from xylose with excellent efficiencies. Volumetric productivities of up to 1.4 g ethanol/L h were obtained. Productivities, yields, and final ethanol concentrations achieved from xylose with recombinant E. coli exceeded the reported values with other organisms. In addition to xylose, all other sugar constituents of biomass (glucose, mannose, arabinose, and galactose) were efficiently converted to ethanol by recombinant E. coli. Unusually low inocula equivalent to 0.033 mg of dry cell weight/L were adequate for batch fermentations. The addition of small amounts of calcium, magnesium, and ferrous ions stimulated fermentation. The inhibitory effects of toxic compounds (salts, furfural, and acetate) which are present in hemicellulose hydrolysates were also examined.     

大肠杆菌产琥珀酸基因工程研究进展

生物合成琥珀酸摆脱了对不可再生战略资源石油的依赖,以其社会、经济和环境效益展现出良好的发展前景。野生型大肠杆菌的琥珀酸生产强度难以满足生物合成琥珀酸工业化的要求,但遗传背景清楚,容易改造。近年来,人们深入研究了大肠杆菌的琥珀酸代谢途径,通过强化大肠杆菌琥珀酸合成途径、抑制琥珀酸旁路代谢途径、构建产琥珀酸乙醛酸循环和有氧生产体系等多种基因工程策略,对大肠杆菌进行菌株改造和代谢进化筛选,提高了琥珀酸产量。综述了大肠杆菌产琥珀酸的基因工程研究进展。     

利用大肠杆菌工程菌廉价高效生产聚羟基丁酸酯

利用大肠杆菌生产聚羟基脂肪酸酯是近来国际上生物可降解塑料的研究热点,本研究通过对适宜于聚羟基脂肪酸酯生产的大肠杆菌菌株的选择和碳源利用试验,初步确立了大肠杆菌代谢工程改造生产聚羟基脂肪酸酯的基础。并在此基础上,通过对大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖转移酶系统的改造和工程菌环境诱导系统的应用,解决了大肠杆菌工程菌无法同时利用多种碳源合成聚羟基脂肪酸酯的难题。发酵试验证明,工程化改造的大肠杆菌利用廉价底物在5L发酵罐中分批培养32h后,菌体终浓度能够达到8.24g/L,聚羟基脂肪酸酯占细胞干重的84.6%。