人P68核蛋白在小鼠成纤维细胞中过量表达引起恶性转化的研究

P68核蛋白是一个依赖于ATP的RNA解旋酶,同时具有依赖于RNA的ATPase活性,它与SV40大T抗原有交叉免疫反应。随细胞周期不同,其含量和分布均有较大差异。以前的工作表明P68核蛋白在同一细胞系不同生长阶段的表型不同。它在肿瘤细胞（HeLa和TC3H10）与非肿瘤细胞（NIH3T3和NC3H10）之间表型亦有明显差异。因此,在细胞中过量表达P68核蛋白,可能会影响到细胞的生长特性,报道了将重组人P68表达质粒DNA分别传染NIH3T3及NC3H10细胞,使P68核蛋白在细胞中过量表达,引起细胞恶性转化;（1）转染细胞的形态从纤维状趋于梭形;（2）在单层细胞中形成微球细胞转化灶;（3）转染的细胞在软琼脂上生长形成集落;（4）将转染细胞注射裸鼠,3－4个星期后形成肿瘤。     

蕨类植物问荆DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆与分析

DEAD-box RNA解旋酶参与RNA多方面的代谢,在植物生长发育和逆境反应中起重要作用。本研究从蕨类植物问荆（Equisetum arvense）中克隆到一条DEAD-box RNA解旋酶c DNA全长序列,命名为EaRH1,并在Gen Bank注册登记（KJ734026）。序列分析显示：该c DNA全长3 230 bp,包含一个从487 bp到2 799 bp编码770个氨基酸的开放读码框,其对应的蛋白序列包含9个保守模块结构。EaRH1与其它物种DEAD-box RNA解旋酶蛋白序列比对结果显示：模块Ⅰa、Ⅱ和Ⅲ序列几乎完全相同,模块Q、Ⅰ和Ⅳ序列存在一些差异。EaRH1与江南卷柏（Selaginella moellendorffii）基因组一条假定序列相似度高达69%,其中相似度最高的区域集中在包含9个保守模块的结构域。系统进化树分析显示：EaRH1与拟南芥（Arabidopsis thaliana）DEAD-box RNA解旋酶At3g22320在氨基酸序列上有相对较高的同源性。序列结构比较和进化分析可推测出EaRH1可能参与植物体生长发育、miRNA生物合成、与RNA结合蛋白的相互作用和非生物胁迫应答。本文的研究为探索问荆DEAD-box RNA解旋酶的进一步功能提供参考。     

玉米cyclinⅢ基因的染色体原位杂交物理定位

本文首次报道了玉米低拷贝基因 cyclinⅢ(B-类)生物素标记的染色体原位杂交定位结果。供试探针为该基因的cDNA克隆,其长度仅为1.6kb。结果表明, 探针的信号分布在第6染色体短臂和第9染色体长臂,与着丝粒的百分距离分别为70.05±3.31和86.86±1.64,检出率分别为8.29%和6.83%。文中对基因的物理位置与功能间的关系等作了讨论。 Abstract:A biotin-labelled in situ hybridization technique was used to physically map a low copy gene cyclinIII in maize.The cDNA clone was 1.7kb in size.The probe was hybridized onto the short arm of chromosome 6 and the long arm of chromosome 9.The percent distances from centromere to detection site were 70.05±3.31 and 86.86±1.64 respetively.The detection rates of in situ hybridization were 8.29 and 6.83 respectively,The relationship between the position and function of the genes is discussed in this paper.     

蕨类植物问荆DEAD box RNA解旋酶基因的克隆与分析

DEAD box RNA解旋酶参与RNA多方面的代谢,在植物生长发育和逆境反应中起重要作用。本研究从蕨类植物问荆(Equisetum arvense)中克隆到一条DEAD box RNA解旋酶cDNA全长序列,命名为EaRH1,并在GenBank注册登记（KJ734026）。序列分析显示：该cDNA全长3230bp,包含一个从487bp到2799bp编码770个氨基酸的开放读码框,其对应的蛋白序列包含9个保守模块结构。EaRH1与其它物种DEAD box RNA 解旋酶蛋白序列比对结果显示：模块Ⅰa、Ⅱ和Ⅲ序列几乎完全相同,模块Q、Ⅰ和 Ⅳ序列存在一些差异。EaRH1与江南卷柏(Selaginella moellendorffii)基因组一条假定序列相似度高达69%,其中相似度最高的区域集中在包含9个保守模块的结构域。系统进化树分析显示：EaRH1与拟南芥(Arabidopsis thaliana)DEAD box RNA解旋酶At3g22320在氨基酸序列上有相对较高的同源性。序列结构比较和进化分析可推测出EaRH1可能参与植物体生长发育、miRNA生物合成、与RNA结合蛋白的相互作用和非生物胁迫应答。本文的研究为探索问荆DEAD box RNA解旋酶的进一步功能提供参考。     

DDX21 RNA解旋酶不同结构域的功能特点解析

DEAD-box家族是在生物体内普遍存在的一类高度保守的RNA解旋酶,在RNA的合成和加工、细胞发育和细胞代谢等过程中都发挥着重要作用。DDX21 RNA解旋酶是DEAD-box家族成员之一,而目前为止DDX21的酶学功能及结构特征尚未被完全了解。本研究运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了DDX21各结构域在不同功能中发挥的作用。首先重组构建并纯化了人的DDX21 RNA解旋酶及不同的截短蛋白质,利用动态激光散射和凝胶层析技术分析各蛋白质的寡聚形态,发现N-端的非功能区（N-端181aa）与C-端的4个FRGQR重复结构域对其结构有较大的影响;利用荧光偏振技术比较分析了各蛋白质与单链RNA的结合反应,结果显示,仅保留DEADc和HELICc结构域的截短蛋白质与单链RNA完全没有亲和性,缺失N-端181aa的截短蛋白质对ssRNA的结合能力与全长蛋白质基本一致,而仅缺失C-端的4个重复FRGQR结构域的截短蛋白质与单链RNA的亲和能力将显著下降;利用快速停流检测技术分析各截短蛋白质的解旋及退火活性,发现DEADc、HELICc及GUCT_RHII三个结构域共同参与DDX21的解旋功能,另一方面,缺失C-端4个FRGQR重复结构域的截短蛋白质导致退火能力的丧失。本研究揭示了DDX21的GUCT_RHII结构域及C-端4个FRGQR重复结构域在其结构及功能中发挥的重要作用,为今后研究DDX21的结构及其细胞功能提供了重要的理论依据。     

番茄DEAD-box RNA解旋酶基因SlDEAH1的克隆及表达分析

DEAD-box RNA解旋酶是一种特殊的RNA分子伴侣,参与了RNA代谢,包括前体RNA剪接、核糖体合成、RNA降解以及基因表达,并对植物的发育和抗性等也具有重要作用。根据已报道的拟南芥DEAD-box蛋白,通过同源比对,在NCBI据库中筛选得到一个DEAD-box RNA解旋酶同源蛋白,命名为SlDEAH1,并根据其基因序列设计特异引物,应用RT-PCR方法从野生型番茄(Solanum lycopersicum)AC++中克隆得到了该基因的全长编码区序列。利用生物学网站、软件及实时荧光定量PCR方法,对其进行生物信息学、表达模式、胁迫及激素处理分析。结果表明:SlDEAH1包括2 073 bp的开放阅读框,编码690个氨基酸残基,其编码蛋白有9个保守结构基序,其所涉及到的ATP结合、ATP水解及RNA结合等功能对于解旋酶活性是至关重要的;表达模式分析表明SlDEAH1基因可能在野生型番茄萼片、叶片发育及果实成熟方面起到重要作用;高温、低温、脱水、伤害、盐胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达,但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制;ABA、ACC、IAA、GA3、MeJA和ZT均不同程度诱导了SlDEAH1的表达,其中ABA诱导效应最为明显。这些结果为进一步研究SlDEAH1在番茄发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。     

P68——一种广泛存在于真核细胞中的核蛋白

本文对近年来在真核细胞中发现的Ｐ６８核蛋白研究历史、分布情况、生物学功能以及其基因在人染色体上的定位等方面进行了系统的评述。同时还对该蛋白在结构特征与功能特性及与某些重要功能蛋白间的相关关系进行了讨论。     

肝癌细胞系（HepG2）感染HCV RNA的研究

为建立丙型肝炎病毒（HCV）体外感染和细胞培养系统,用定量的HCV RNA阳性血清感染人肝癌细胞系（HepG2细胞系）,应用地高辛标记HCV RNA探针原位杂交技术和RT－PCR方法对感染后的细胞和上清液听 HCV RNA进行了检测。在感染后的第一代至第七代的细胞中出现特异性杂交阳性信号,第一代、第二代和第六代检测出HCV RNA正链,并在感染后第一、二代检测出HCV RNA负链。显示HCV不仅能在体外感染HepG2细胞系,而且在基因的复制,证明HepG2细胞能作为HCV的体外细胞培育系。     

低温诱导型凡纳滨对虾DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆与表达分析

为研究凡纳滨对虾耐寒性状的分子基础, 克隆鉴定了凡纳滨对虾DEAD-box RNA解旋酶的同源基因。根据差减文库中筛选到的一个低温上调表达的DEAD-box RNA解旋酶基因片段, 通过RACE PCR扩增获得两条高度相似的cDNA全长序列, 两条cDNA均为1430 bp, 包含139 bp 5'UTR、79 bp 3'UTR和1212 bp 开放阅读框, 编码403个氨基酸残基。Blast比对结果显示, 两条cDNA与其他物种的DDX5相似性最高, 推测为凡纳滨对虾DDX5基因的两个变异体, 分别命名为LvDDX5variant A (LvDDX5A)和LvDDX5variant B (LvDDX5B), 在系统进化树中, LvDDX5A和LvDDX5B聚为最近的一支, 并与虾类DDX5、文昌鱼DDX、贝类的DDX5距离较近。Real-time PCR分析结果显示, LvDDX5A和LvDDX5B都呈多组织遍在表达, 在精巢、鳃、肠、肌肉和卵巢中,LvDDX5B表达量高于LvDDX5A, 而在肝胰腺中LvDDX5A表达量高于LvDDX5B。在低温胁迫对虾肝胰腺和心中, LvDDX5A呈上调表达而LvDDX5B表达量无明显变化。进一步对LvDDX5A在不同低温条件胁迫对虾的肝胰腺中表达变化进行了分析。结果显示, LvDDX5A在18℃、15℃、13℃和11℃低温胁迫36h均被诱导表达,并随着15℃和13℃低温胁迫时间的增加呈先上升后下降的表达模式, 在48h达到峰值, LvDDX5A的低温诱导表达模式暗示其可能是在凡纳滨对虾低温适应中发挥作用的剪接体。     

Ku70作为RNA解旋酶调节miR-124的加工成熟及神经细胞的分化

目的 Ku70蛋白主要通过其DNA结合特性参与双链DNA断裂（DSB）的非同源端连接（NHEJ）修复,有报道称其具有RNA结合功能,本文探索Ku70是否具有RNA解旋酶活性并影响miRNA加工成熟。方法 利用RNA免疫共沉淀（RIP）测序结合生物信息学分析Ku蛋白结合的RNA;蛋白质印迹法（Western blot,WB）结合定量反转录PCR（qRT-PCR）检测Ku蛋白与miRNAs的表达关系;生物膜干涉技术（BLI）实验分析Ku蛋白与RNA的结合能力;电泳迁移率变动分析（EMSA）实验确定Ku70及Ku80的RNA解旋酶活性;形态学检测结合WB分析Ku70调节miR-124引起的神经细胞功能变化;免疫荧光结合形态学分析寨卡病毒（ZIKV）感染后Ku70及miR-124的变化与神经元分化关联。结果 研究发现,Ku70蛋白具有RNA解旋酶活性,并通过其RNA解旋酶活性影响miRNA加工成熟。Ku70缺失引起许多miRNAs上调,其中包括神经细胞特异的miR-124。在人神经前体细胞（hNPCs）和人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中敲低Ku70可促进 miR-124的成熟,从而导致上述细胞向神经元分化。本文进一步发现,ZIKV感染影响了Ku70及miR-124的表达,导致细胞形态的分化。结论 本研究揭示了Ku70的一种新功能,即Ku70有可能参与miRNA的成熟调控和神经细胞的分化,并且可能是ZIKV病毒致小头症的原因之一。     

Phosphorylation of p68 RNA helicase regulates RNA binding by the C-terminal domain of the protein

We previously reported ATPase, RNA unwinding, and RNA-binding activities of recombinant p68 RNA helicase that was expressed in Escherichia coli. Huang et al. The recombinant protein bound both single-stranded (ss) and double-stranded (ds) RNAs. To further characterize the substrate RNA binding by p68 RNA helicase, we expressed and purified the recombinant N-terminal and C-terminal domains of the protein. RNA-binding property and protein phosphorylation of the recombinant domains of p68 were analyzed. Our data demonstrated that the C-terminal domain of p68 RNA helicase bound ssRNA. More interestingly, the C-terminal domain was a target of protein kinase C (PKC). Phosphorylation of the C-terminal domain of p68 abolished its RNA binding. Based on our observations, we propose that the C-terminal domain is an RNA substrate binding site for p68. The protein phosphorylation by PKC regulates the RNA binding of p68 RNA helicase, which consequently controls the enzymatic activities of the protein.     

玉米DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆及分析

DEAD-box RNA解旋酶参与RNA转录、前体mRNA剪切、核糖体发生、核质运输、蛋白质翻译、RNA降解等重要的生命活动.根据本室在S-Mo17Rf3Rf3cDNA芯片研究中,检测到花粉发育后期RNA解旋酶上调表达的结果,应用RACE技术从S-Mo17Rf3Rf3花粉中克隆得到该RNA解旋酶基因全长cDNA,命名为ZmRH2并在GenBank注册登记 (DQ327709).序列分析表明：该cDNA全长1 652bp,从第163 bp开始到1 386bp含有一个开放阅读框,编码407个氨基酸.其编码的蛋白质具有DEAD-box RNA解旋酶特有的9个保守模体,与水稻、拟南芥和豌豆中的DEAD-box RNA解旋酶的氨基酸序列存在着很高的同源性.RT-PCR分析表明,该基因在近等基因系S-Mo17Rf3Rf3和S-Mo17rf3rf3的叶、根、和雌穗中的表达没有差异,但在花丝和花粉中有明显差异.     

小鼠胚胎干细胞中RNA干涉现象

报道了不同品系小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )系MESPU13、B3和R1中存在的RNA干涉 (RNAi)现象。应用脂质体法 ,将转录绿色荧光蛋白 (GFP)基因双链RNA(dsRNA)的载体 (pdsGFP)转染GFP标记的ES细胞 ,dsRNA的瞬时表达可引起ES细胞中的RNAi效应 ,即质粒转录的GFP基因的dsRNA能够显著降低ES细胞内相应的外源GFP基因的表达 ;同时 ,用电穿孔转染法将线性化的pdsGFP puro导入ES细胞中 ,筛选后 ,在 3 0 %左右的抗性克隆中GFP表达量明显降低 ,少数细胞内的干涉效率达到RT PCR检测不到的程度。在此基础上 ,构建了可转录ES细胞特异标记基因OCT 4基因片断dsRNA的载体 ,经基因打靶和抗性筛选得到了稳定整合的ES细胞克隆 ,随机扩增了 5 1个克隆 ,并对其中的 48个阳性克隆进行了PCR半定量检测 ,结果显示 :在 11个ES细胞克隆中具有显著的RNAi效应 ,干涉效率达到RT PCR检测不到的程度。这一结果表明 ,应用RNAi在不同品系ES细胞中研究哺乳动物及人的基因功能是可行的     

Cell Culture and Selection of High Flavonoids- producing Cell Lines in Saussurea medusa

Explants of stems and leaves of Saussurea medusa Maxim. were cultured on MS medium supplemented with 0.5 mg/L BA, 2 mg/L NAA, and from which factors, such as the media, plant hormones and culture temperature, as well as the addition of phenylalanine to the medium, that affect the callus growth, were investigated. The results showed that cells grew appropriately in MS medium supplemented with 2 mg/L NAA at 25 ℃. Phenylalanine was not suitable for cell growth in solid culture but it increased flavonoid production. The calli could be distinguished by colour with naked eyes into two cell lines, a faint yellow (A) and a red coloured (B), representing respectively the different colour of metabolite accumulations. A sensitive and rapid high-performance liquid chromatographic as well as a UV spectrophotometric method have been developed for detecting the flavonoids in cultured cells. It revealed that the A line contained 1.9% flavonoids and 0.42% jaceosidin, which was 2.5 times and 3.9 times more than B line; 2.6 and 4.2 times more than the initial callus cells respectively.     

Analysis of the tertiary structure of bacterial RNase P RNA

The ubiquitous occurrence of ribonuclease P (RNase P) as a ribonucleoprotein and the catalytic properties of bacterial RNase P RNAs indicate that RNA fulfills an ancient and important role in the function of this enzyme. This review focuses on efforts to determine the structure of the bacterial RNase P RNA ribozyme. Phylogenetic comparative analysis of a library of bacterial RNase P RNA sequences has resulted in a well-developed secondary structure model and allowed identification of some elements of tertiary structure. The native structure has been redesigned by circular permutation to facilitate intra- and inter-molecular crosslinking experiments in order to gain further structural information. The crosslinking constraints, together with the constraints provided by comparative analyses, have been incorporated into a first-order model of the structure of the ribozyme-substrate complex. The developing structural perspective allows the design of self-cleaving pre-tRNA-RNase P RNA conjugates which are useful tools for additional structure-probing experiments.Abbreviations cpRNA circularly permuted RNA     

基于DUS测试性状的玉米自交系形态多样性分析

利用DUS测试中的47个性状对15份普通玉米自交系和13份糯玉米骨干自交系进行了形态多样性研究。结果表明:本研究所选用的普通玉米自交系较糯玉米自交系的形态变异更为丰富;47个性状的Shannon-Weaver多样性指数存在较大差异。聚类分析表明,糯玉米自交系紧密地聚在一起,与普通玉米自交系存在较大形态差别。DUS测试性状涵盖的信息量大且受环境影响相对较小,可应用于玉米自交系的形态多样性分析。